焦叢蕊，楊文娟，陳曉玲，董自星，金鵬，劉曉光，王正祥, *

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津，300457)

黑曲霉xynC基因編碼一種低溫酸性木聚糖酶

焦叢蕊1，楊文娟1，陳曉玲1，董自星2，金鵬2，劉曉光2，王正祥1, 2*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津，300457)

木聚糖酶(xylanase, EC 3.2.1.8)可以隨機(jī)切割木聚糖主鏈的β-1,4-糖苷鍵，在飼料、食品、造紙和紡織等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。該研究通過(guò)分子克隆技術(shù)將黑曲霉CICIM F0510來(lái)源的木聚糖酶基因xynC在畢赤酵母中進(jìn)行了克隆表達(dá)，構(gòu)建獲得了重組菌GS115 (pPIC-XynC)。在搖瓶水平上，重組菌的酶活為1.14 U/mL。酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，重組酶XynC的最適反應(yīng)溫度和pH分別為30 ℃和2.5，且它在25～40 ℃或pH 2.0～5.0有較好的穩(wěn)定性；K+對(duì)XynC的活性有微弱的促進(jìn)作用，而Ca2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Sn2+、EDTA和SDS等對(duì)XynC的活性有不同程度的抑制作用。此外，該酶還可以水解戊聚糖產(chǎn)生聚合度為3～6的低聚木糖。這些良好的理化性質(zhì)為重組酶XynC在飼料及食品等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

低溫酸性木聚糖酶；黑曲霉；分子克??；酶學(xué)性質(zhì)；低聚木糖

內(nèi)切-1,4-β-D-木聚糖酶，簡(jiǎn)稱木聚糖酶(xylanase，EC 3.2.1.8)，是降解木聚糖的關(guān)鍵酶，它可以隨機(jī)切割主鏈的β-1,4-糖苷鍵，從而產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的低聚木糖[1]。該酶廣泛應(yīng)用于飼料、食品、造紙、紡織以及能源等諸多工業(yè)領(lǐng)域[2-3]。當(dāng)前，木聚糖酶主要通過(guò)真菌、細(xì)菌等微生物發(fā)酵生產(chǎn)獲得[4]。而國(guó)內(nèi)主要由真菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶，其酶活較低，且成分復(fù)雜，限制了木聚糖酶的廣泛應(yīng)用。因此，通過(guò)分子克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)木聚糖酶的異源表達(dá)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。目前已有多種木聚糖酶被克隆及表達(dá)，其中黑曲霉來(lái)源的XynB[5-7]和XynI[8-10]已經(jīng)在畢赤酵母、黑曲霉和大腸桿菌等多種宿主中得到了克隆表達(dá)，它們的酶學(xué)性質(zhì)也被系統(tǒng)地解析。

盡管黑曲霉CBS 513.88的基因組序列已經(jīng)于2007年被解析完成并公布[11]，但黑曲霉的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中還有許多蛋白的功能未確定。本課題組前期通過(guò)對(duì)其基因組序列信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的編碼木聚糖酶的基因xynC，其理化性質(zhì)與功能等未知。為此，本研究通過(guò)分子克隆技術(shù)將其在畢赤酵母中進(jìn)行克隆表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行了初步純化，還就其生化特征進(jìn)行了全面解析，為其大規(guī)模生產(chǎn)及其在飼料及食品行業(yè)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌種

黑曲霉(Aspergillusniger)CICIM F0510為從自然樣本中分離保藏的野生菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保藏[12]。重組畢赤酵母菌GS115 (pPIC-XynC)由本研究中構(gòu)建、篩選并保存。大腸桿菌JM109由本實(shí)驗(yàn)室保藏。黑曲霉采用CD培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；大腸桿菌用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；畢赤酵母及其重組菌的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法按照Invitrogen的畢赤酵母操作手冊(cè)進(jìn)行。

1.2主要試劑

限制性酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒以及膠回收試劑盒等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；G418、無(wú)氨基酵母氮源等為Invitrogen公司產(chǎn)品；RNA抽提試劑盒(High Pure RNA Isolation Kit)和cDNA合成試劑盒(Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit)由Roche公司提供；生物素、胰蛋白胨和酵母抽提物等購(gòu)于英國(guó)OXOID公司；戊聚糖購(gòu)自陜西帕尼爾生物科技有限公司；D-木糖和低聚木糖為江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司產(chǎn)品，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3黑曲霉木聚糖酶基因XynC的克隆與表達(dá)

1.3.1 畢赤酵母工程菌的構(gòu)建

質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的純化、酶切、連接、電轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化子篩選等均采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法[13]。其中，基因克隆過(guò)程中所采用寡核苷酸引物(An-XynC1：GTACTCCCCAATGGCAAGGCCC；An-XynC2：TGCTC￣T￣A￣G￣A￣TTAGCAGCTCTCCTCGGTGCTGTC；下劃線部分為人工引入的限制性酶切位點(diǎn))由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。黑曲霉總RNA的提取與cDNA的制備按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 重組酶的誘導(dǎo)分泌表達(dá)與初步純化

將畢赤酵母重組菌GS115(pPIC-XynC)在YPD平板上進(jìn)行純化，挑取單菌落接種于25 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600為2～6，約18～20 h)。按1%(v/v)接種量接入50 mL BMGY培養(yǎng)基中，于30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600為2～6，約16～18 h)。室溫下5 000 r/min離心5 min回收酵母細(xì)胞，棄上清，將細(xì)胞重懸于適當(dāng)體積的BMMY培養(yǎng)基中，至OD600值為1.0，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)并開始誘導(dǎo)。每隔24 h補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為0.5%以維持誘導(dǎo)，并同時(shí)取樣測(cè)定酶活，直至酶活不再提高。

發(fā)酵結(jié)束后，離心(8 000 r/min，15 min，4 ℃)收集粗酶液。采用鹽析、透析和Sephadex G-75凝膠層析柱對(duì)其進(jìn)行初步純化，并通過(guò)酶活測(cè)定和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電脈(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析蛋白的純化情況。[14]采用5%的濃縮膠，12%的分離膠。

1.4重組木聚糖酶的酶學(xué)特征分析

1.4.1 酶活測(cè)定方法

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[15]測(cè)定木聚糖酶的酶活。反應(yīng)體系為200 μL 50 g/L戊聚糖溶液、300 μL相應(yīng)pH的緩沖液和100 μL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液，在50 ℃反應(yīng)30 min后，加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。離心后，取400 μL反應(yīng)上清液，加入400 μL去離子水和1 mL DNS試劑，沸水浴5 min后，迅速冷卻。再用去離子水定容到5 mL，測(cè)540 nm下的吸光值；對(duì)照組中預(yù)先加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液滅酶活，然后于上述條件下反應(yīng)，測(cè)定吸光度。酶活力定義：1 mL酶液在50 ℃、pH 5.5條件下，每分鐘水解戊聚糖生成1 mg還原糖為1個(gè)酶活力單位(U)，用U/mL表示。

1.4.2 最適反應(yīng)溫度的測(cè)定

在不同溫度條件下(25～70 ℃)測(cè)定重組木聚糖酶的酶活，以酶活最高者為100%表示所處溫度下的相對(duì)酶活。

1.4.3 熱穩(wěn)定性的測(cè)定

分別將木聚糖酶的酶液在不同溫度下(25～70 ℃)進(jìn)行孵育，于不同時(shí)間(15、30、60和120 min)取樣，測(cè)定重組木聚糖酶的酶活。以未進(jìn)行熱處理的酶液的酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，確定重組木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。

1.4.4 最適反應(yīng)pH的測(cè)定

在不同反應(yīng)pH下(pH 2.0～8.0)測(cè)定重組木聚糖酶的酶活，以酶活最高者為100%表示所處pH下的相對(duì)酶活。所用緩沖液為：pH 2.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。

1.4.5 pH穩(wěn)定性的測(cè)定

室溫下，分別將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的木聚糖酶酶液在pH 2.0～7.0的緩沖液中孵育1 h后，按照1.4.1的方法測(cè)定酶活。以酶活最高者為100%計(jì)算殘余酶活力，確定重組酶的pH穩(wěn)定性。

1.4.6 金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響

在木聚糖酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)的體系中，加入終濃度為5 mmol/L的不同金屬離子或化合物，分別測(cè)定各反應(yīng)體系中重組木聚糖酶的相對(duì)酶活，以不加金屬離子或化學(xué)試劑的反應(yīng)體系的酶活為100%。

1.5重組酶水解戊聚糖的產(chǎn)物分析

1.5.1 水解實(shí)驗(yàn)

將200 μL 50 g/L戊聚糖溶液與100 μL酶液混勻，在最適反應(yīng)溫度和pH條件下反應(yīng)10 h后，煮沸滅酶活。然后在12 000 r/min離心5 min，取上清液。

1.5.2 水解產(chǎn)物薄層層析

將上述上清液采用薄層層析進(jìn)行分析。所用的展開劑為:V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)∶V(異丙醇)∶V(甲酸)∶V(水)=25∶10∶5∶1∶15[16]，顯色劑為：V(硫酸)∶V(無(wú)水乙醇)=5∶95。從左到右依次點(diǎn)樣：木糖標(biāo)品(1 mg/mL)、低聚木糖標(biāo)品(1 mg/mL)、XynC與戊聚糖反應(yīng)的上清液、滅活的XynC與戊聚糖反應(yīng)的上清液。將已經(jīng)點(diǎn)好樣的硅膠板放入盛有適量展開劑的層析缸中，待展開劑擴(kuò)散至距硅膠板上沿1 cm處，取出硅膠板，在通風(fēng)廚里晾干。向此干燥的硅膠板上快速均勻的噴灑顯色劑，在通風(fēng)櫥里晾干，然后烘烤至樣品顯示出來(lái)，并拍照記錄。

1.6木聚糖酶基因XynC的生物信息學(xué)分析

從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取不同來(lái)源的木聚糖酶的氨基酸序列。利用MEGA 4.0等軟件將XynC與這些木聚糖酶的氨基酸序列以鄰近法(Neighbour-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹，分析它們親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近[17]。通過(guò)軟件Clustal X2和BioEdit對(duì)不同來(lái)源木聚糖酶的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1木聚糖酶基因XynC的克隆與分析

采用BLAST等分析方法對(duì)A.nigerCBS 513.88的基因組序列(EMBL AM270980-AM270998)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的木聚糖基因(命名為xynC)。以此為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)出相應(yīng)的核苷酸引物。然后以A.nigerCICIM F0510的cDNA為模板對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用XbaI進(jìn)行完全酶切，并與經(jīng)過(guò)SnaB I和AvrII酶切的pPIC9K進(jìn)行連接。再通過(guò)PstI酶切，驗(yàn)證了重組質(zhì)粒的正確性，獲得了重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC-XynC。進(jìn)一步通過(guò)核苷酸序列測(cè)定，確認(rèn)了所克隆的xynC基因具有完整的開放閱讀框(ORF)，且其核苷酸序列和氨基酸序列與A.nigerCBS 513.88基因組公布的序列一致。其完整ORF大小為696 bp，編碼231個(gè)氨基酸。

利用MEGA 4.0將XynC與不同來(lái)源木聚糖酶的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果匯總于圖1。此進(jìn)化樹反映了不同來(lái)源的木聚糖酶之間的遺傳距離。其中，黑曲霉來(lái)源的3個(gè)木聚糖酶均屬于糖苷水解酶第11家族(GH11, EC 3.2.1.8)，但它們分屬3個(gè)不同組合。

圖1 進(jìn)化樹描述不同來(lái)源的木聚糖酶的遺傳距離Fig.1 Phylogenetic tree describing the genetic distances among xylanases from different microorganisms線段的長(zhǎng)度表示的是用MEGA 4.0計(jì)算的距離；分支節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字代表的是bootstrap百分比。黑曲霉來(lái)源的木聚糖酶用粗體標(biāo)出，木聚糖酶AuXyn11D、AoXynG1、AkXynB、AtXlnA和AuXynA分別來(lái)源于A. usamii E001、A. oryzae KBN616、A. kawachii IFO 4308、A. tubingensis和A. usamii。)

進(jìn)一步利用Clustal X2等軟件將上述不同來(lái)源木聚糖酶的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)與分析，結(jié)果如圖2所示。XynC與這些木聚糖酶的氨基酸序列的相似度為42.44%～99.13%。與其他木聚糖酶相比，XynC具有木聚糖酶家族典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)，且具有其典型的活性中心(Glu117和Glu208)，屬于木聚糖酶家族。

(*)保守的氨基酸序列；(:)保守的替換；(.)半保守的替換；虛線表示的是空格；二級(jí)結(jié)構(gòu)標(biāo)在序列的上方；灰色部分標(biāo)注的是信號(hào)肽；活性位點(diǎn)用方框標(biāo)出；五角星標(biāo)出的是對(duì)酶的最適反應(yīng)pH有影響的氨基酸殘基圖2 不同來(lái)源的木聚糖酶的氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Multiple amino aeid sequence alignment of xylanases from different microorganisms

2.2黑曲霉木聚糖酶的分泌表達(dá)與初步純化

將構(gòu)建獲得的重組質(zhì)粒pPIC-XynC用NcoI線性化后，電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115中，并通過(guò)G418平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，獲得重組菌GS115(pPIC-XynC)。在250 mL搖瓶培養(yǎng)120 h后，重組菌的胞外木聚糖酶酶活達(dá)到最高，為1.14 U/mL，表達(dá)量約為530 mg/L。進(jìn)一步通過(guò)鹽析、透析和凝膠過(guò)濾層析法，將XynC的粗酶液進(jìn)行初步純化，其得率、純化倍數(shù)和比酶活分別為57.9%、9.2倍和19.8 U/mg。蛋白電泳的結(jié)果(圖3)表明，XynC的純度已經(jīng)達(dá)到酶學(xué)特征分析的要求；其分子質(zhì)量約為26.0 kDa，略高于其理論分子質(zhì)量(23.0 kDa)，這可能是因?yàn)楸磉_(dá)的蛋白經(jīng)過(guò)了糖基化修飾[8]。

M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-XynC粗酶液；2-純化后的XynC圖3 SDS-PAGE分析XynC的純化情況Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purification of XynC

2.3重組木聚糖酶的酶學(xué)特征

2.3.1 重組木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

在不同溫度下(25、30、35、40、45、50、60和70 ℃)測(cè)定木聚糖酶的酶活，結(jié)果如圖4-a所示。重組酶XynC的最適反應(yīng)溫度為30 ℃，且在30～45 ℃范圍內(nèi)其相對(duì)酶活在80%以上。進(jìn)一步在上述不同溫度下研究XynC的熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明(圖4-b)：(1)在25～40 ℃的水浴中孵育2 h，XynC殘留的酶活仍維持在70%以上，具有較好的穩(wěn)定性；(2)在50 ℃孵育15 min，殘留酶活僅有40%左右；(3)在60 ℃和70 ℃孵育15 min，XynC幾乎完全失活。

圖4 XynC的最適反應(yīng)溫度(a)和熱穩(wěn)定性(b)Fig.4 Optimum temperature (a) and thermostability (b) of XynC

2.3.2 重組木聚糖酶的最適作用pH和pH穩(wěn)定性

在不同pH反應(yīng)條件下(pH 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和5.0)測(cè)定XynC的酶活，結(jié)果如圖5-a所示。由圖可知，XynC的最適反應(yīng)pH為2.5，且在pH 2.0～2.5范圍內(nèi)其相對(duì)酶活在80%以上。pH穩(wěn)定性的研究結(jié)果(圖5-b)表明，在pH 2.5～4.0的緩沖液中孵育1 h后，XynC仍能保持80%以上的相對(duì)酶活；在pH 2.0～7.0孵育1 h后，其殘留酶活仍在60%以上，具有較寬泛的pH穩(wěn)定范圍。

圖5 XynC的最適反應(yīng)pH(a)和pH穩(wěn)定性(b)Fig.5 Optimum pH (a) and pH stability (b) of XynC

2.3.3 金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對(duì)重組木聚糖酶活性的影響

在XynC與其底物進(jìn)行反應(yīng)的體系中加入不同的金屬離子或化學(xué)試劑(終濃度為5 mmol/L)，研究其對(duì)XynC酶活的影響，結(jié)果匯總于表1。除了K+對(duì)XynC的活性有微弱的促進(jìn)作用外，Ca2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Sn2+和EDTA、SDS等都對(duì)XynC的活性有不同程度的抑制作用。其中，5 mmol/L SDS可以使XynC幾乎完全失活。

表1 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)重組木聚糖酶酶活的影響

2.4重組酶XynC水解戊聚糖的產(chǎn)物分析

將重組木聚糖酶XynC與50 g/L戊聚糖在pH 2.5和30 ℃反應(yīng)10 h后，采用薄層層析對(duì)其水解產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。戊聚糖經(jīng)XynC水解后會(huì)產(chǎn)生聚合度為3～6左右的低聚木糖。

1-1 mg/mL木糖;2-1 mg/mL低聚木糖;3-XynC與戊聚糖反應(yīng)上清液;4-滅活XynC與戊聚糖反應(yīng)上清液；5-戊聚糖；X1～X5-木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖圖6 薄層色譜分析XynC水解戊聚糖的產(chǎn)物Fig.6 TLC analysis of the hydrolytic products of pentosan catalyzed by XynC

3 討論

本研究成功將黑曲霉CICIM F0510的木聚糖酶基因xynC在畢赤酵母中進(jìn)行了克隆與表達(dá)。進(jìn)化樹的構(gòu)建和氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果(圖1和圖2)表明，重組酶XynC具有木聚糖酶家族典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心，屬于糖苷水解酶第11家族的木聚糖酶(GH11，EC 3.2.1.8)。其最適反應(yīng)pH和溫度分別為2.5和30 ℃(圖4-a和圖5-a)，與許多嗜中溫真菌來(lái)源木聚糖酶的最適反應(yīng)pH和溫度相似[4, 10, 18]，但低于其他GH11家族木聚糖酶的最適反應(yīng)pH和溫度(比如XynB，其最適反應(yīng)pH和溫度分別為5.0、55 ℃)[19]。此外，室溫下將XynC在pH 2.0～7.0的緩沖液中孵育1 h，殘留酶活仍在60%以上(圖5-b)，如此寬泛的pH穩(wěn)定范圍在其它GH11家族的木聚糖酶中并不常見[6, 20]。在低溫和酸性條件下具有良好的穩(wěn)定性使得XynC可以作為飼料添加劑，在動(dòng)物酸性的胃腸道中發(fā)揮作用。

一些真菌木聚糖酶，比如A.kawachii木聚糖酶XynC[21]和A.niger木聚糖酶XynI[10]都具有較低的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性。在這些木聚糖酶中，它們N端的天冬氨酸殘基都是保守的。相反地，耐酸性較弱的或中性木聚糖酶中相應(yīng)位置的氨基酸則是天冬酰胺。在此保守區(qū)，XynC中有3個(gè)天冬氨酸殘基(Asp44、Asp54和Asp57，圖2)，因此它具有較低的最適反應(yīng)pH和良好的耐酸性。其中，Asp57對(duì)應(yīng)于XynI中的Asp37，它會(huì)嚴(yán)重影響木聚糖酶的最適反應(yīng)pH[10]。

Ca2+、Mn2+、Co2+和Cu2+對(duì)XynC的酶活有不同程度的抑制作用(表1)，這與它們對(duì)XynI酶活的影響類似[8]。據(jù)報(bào)道，Zn2+可以增強(qiáng)木聚糖酶XynI[8]和XynB[19]的酶活，但它卻對(duì)XynC具有一定的抑制作用。EDTA是一些木聚糖酶的抑制劑[22]，它可以明顯抑制XynC的酶活，這表明XynC是金屬酶。但EDTA會(huì)促進(jìn)木聚糖酶XYN186[20]、XYNZG[22]和XynI[8]等的酶活，它們可能不是金屬酶，其催化機(jī)制也可能與XynC不同。5 mmol/L SDS會(huì)強(qiáng)烈抑制XynC的酶活，使它幾乎完全失活，該研究結(jié)果也得到了MAO等[20]的證實(shí)。而5 mmol/L K+對(duì)XynC的酶活有微弱的促進(jìn)作用，與ZHANG等[22]的研究結(jié)果一致。

此外，重組酶XynC可以將戊聚糖降解成聚合度為3～6的低聚木糖(圖6)。由于低聚木糖不能被哺乳動(dòng)物的胃腸道吸收，而且可以作為益生元促進(jìn)腸道益生菌的生長(zhǎng)，因此作為飼料添加劑使用可以間接抑制有害菌的生長(zhǎng)、改善腸道環(huán)境等。此外，低聚木糖還具有防治齲齒、促進(jìn)微量元素的吸收、降低膽固醇、調(diào)節(jié)冰點(diǎn)、抗氧化、保水性、改善血清以及調(diào)節(jié)血壓等功能[23]，在食品或飼料行業(yè)具有較高的應(yīng)用潛力。

綜上所述，本文成功將黑曲霉CICIM F0510的木聚糖酶基因xynC在畢赤酵母中進(jìn)行了克隆表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行了初步純化。酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，重組酶XynC是一種低溫酸性木聚糖酶，且可以將戊聚糖水解成低聚木糖，這為該酶在飼料和食品等行業(yè)的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

[1] WU Min-chen, WANG Jun-qing, ZHANG Hui-min, et al. Cloning and sequence analysis of an acidophilic xylanase (XynI) gene fromAspergillususamiiE001[J]. World Journal of Microbiology amp; Biotechnology, 2011, 27(4): 831-839.

[2] WALIA A, GULERIA S, MEHTA P, et al. Microbial xylanases and their industrial application in pulp and paper biobleaching: a review[J]. Biotechnology, 2017, 7(1): 11.

[3] UDAY U S P, CHOUDHURY P, BANDYOPADHYAY T K, et al. Classification, mode of action and production strategy of xylanase and its application for biofuel production from water hyacinth[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 82: 1 041-1 054.

[4] AHMED S, RIAZ S, JAMIL A. Molecular cloning of fungal xylanases: an overview[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 84(1): 19-35.

[5] KINOSHITA K, TAKANO M, KOSEKI T, et al. Cloning of thexynNBgene encoding xylanase B fromAspergillusnigerand its expression inAspergilluskawachii[J]. Journal of Fermentation amp; Bioengineering, 1995, 79(5): 422-428.

[6] DENG Ping, LI De-fa, CAO Yun-he, et al. Cloning of a gene encoding an acidophilic endo-β-1,4-xylanase obtained fromAspergillusnigerCGMCC1067 and constitutive expression inPichiapastoris[J]. Enzyme amp; Microbial Technology, 2006, 39(5): 1 096-1 102.

[7] LEVASSEUR A, ASTHER M, RECORD E. Overproduction and characterization of xylanase B fromAspergillusniger[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2005, 51(2): 177-183.

[8] HMIDA-SAYARI A, TAKTEK S, ELGHARBI F, et al. Biochemical characterization, cloning and molecular modeling of a detergent and organic solvent-stable family 11 xylanase from the newly isolatedAspergillusnigerUS368 strain[J]. Process Biochemistry, 2012, 47(12): 1 839-1 847.

[9] YI Xiu-li, SHI Yan, XU Hui, et al. Hyperexpression of twoAspergillusnigerxylanase genes inEscherichiacoliand characterization of the gene products[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2010, 41(3): 778-786.

[10] KRENGEL U, DIJKSTRA B W. Three-dimensional structure of endo-1,4-beta-xylanase I fromAspergillusniger: molecular basis for its low pH optimum[J]. Journal of Molecular Biology, 1996, 263(1): 70-78.

[11] PEL H J, DE WINDE J H, ARCHER D B, et al. Genome sequencing and analysis of the versatile cell factoryAspergillusnigerCBS 513.88[J]. Nature Biotechnology, 2007, 25(2): 221-31.

[12] 董自星, 肖華, 王靜培, 等. 黑曲霉果糖基水解酶的重組表達(dá)及酶學(xué)特征分析[J]. 食品工業(yè)科技, 2017, 38(10): 178-184.

[13] 諸葛健, 王正祥. 工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)[M]. 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 1994: 413-450.

[14] 奧斯伯 F M, 金斯頓 R E, 塞德曼 J G, 等. 精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2008: 42-50.

[15] 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心, 武漢新華揚(yáng)生物有限公司, 廣東溢多利生物技術(shù)股份有限公司. GB/T 23874—2009 飼料添加劑木聚糖酶活力的測(cè)定分光光度法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2009.

[16] KUMAR K S, MANIMARAN A, PERMAUL K, et al. Production of beta-xylanase by aThermomyceslanuginosusMC 134 mutant on corn cobs and its application in biobleaching of bagasse pulp[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2009, 107(5): 494-498.

[17] TAMURA K, DUDLEY J, NEI M, et al. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24(8): 1 596-1 599.

[18] POLIZELI M L, RIZZATTI A C, MONTI R, et al. Xylanases from fungi: properties and industrial applications[J]. Appllied Microbiology and Biotechnology, 2005, 67(5): 577-591.

[19] KRISANA A, RUTCHADAPORN S, JARUPAN G, et al. Endo-1,4-beta-xylanase B fromAspergilluscf.nigerBCC14405 isolated in Thailand: purification, characterization and gene isolation[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2005, 38(1): 17-23.

[20] MAO Liang-wei, MENG Po, ZHOU Cheng, et al. Molecular cloning and heterologous expression of an acid stable xylanase gene fromAlternariasp. HB186[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28(3): 777-784.

[21] ITO K, OGASAWARA H, SUGIMOTO T, et al. Purification and properties of acid stable xylanases fromAspergilluskawachii[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1992, 56(4): 547-550.

[22] ZHANG Gui-min, HUANG Jun, HUANG Guang-rui, et al. Molecular cloning and heterologous expression of a new xylanase gene fromPlectosphaerellacucumerina[J]. Appllied Microbiology and Biotechnology, 2007, 74(2): 339-346.

[23] 汪俊卿. 宇佐美曲霉木聚糖酶AusXyn10A的克隆表達(dá)及耐熱性的改造研究[D]. 無(wú)錫： 江南大學(xué), 2014.

GenexynCfromAspergillusnigerencodingacold-activeandacidophilicxylanase

JIAO Cong-rui1, YANG Wen-juan1, CHEN Xiao-ling1, DONG Zi-xing2*, JIN Peng2, LIU Xiao-guang2, WANG Zheng-xiang1, 2*

1 (College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457,China) 2 (College of Chemical Engineering and Materials Science, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457,China)

Xylanase, an enzyme that randomly cleaves internal β-1,4-xylosidic linkages of xylan backbone, has wide applications in feed, food, pulp and paper, and textile industries. In the present study, genexynCencoding xylananse fromAspergillusnigerCICIM F0510 was cloned and expressed inPichiapastoris, and the recombinant strain GS115 (pPIC-xynC) was subsequently constructed. At the shake flask level, the activity of the recombinant enzyme XynC was 1.14 U/mL. The optimum temperature and pH of XynC was determined to be 30 ℃ and 2.5, respectively. This enzyme was also stable at 25-40 ℃ or pH 2.0-5.0. K+slightly enhanced the activity of XynC, whereas Ca2+, Co2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Fe3+, Sn2+EDTA and SDS had different inhibitory effects on its activity. Besides, XynC can hydrolyze pentosan to yield short chain xylooligosaccharides with degree of polymerization of 3-6. Such good biochemical properties lay a solid foundation for the applications of XynC in feed and food fields.

cold-active and acidophilic xylanase；Aspergillusniger；molecular cloning；enzymatic properties；xylooligosaccharides

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014869

碩士研究生(董自星博士、王正祥教授為通訊作者,E-mail: dzx@tust.edu.cn; zxwang0519@tust.edu.cn)。

2017-06-02，改回日期：2017-07-25