賈亞楠，逯海朋，喻艷，劉欣瑾，陳偉，曾令樹，潘敏慧，徐立*

1(西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶，400715) 2(蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，重慶，400700)

桑枝內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物抑制α-葡萄糖苷酶和抗氧化活性研究

賈亞楠1，逯海朋1，喻艷1，劉欣瑾1，陳偉1，曾令樹2，潘敏慧1，徐立1*

1(西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶，400715) 2(蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，重慶，400700)

從嚴(yán)格表面消毒的桑枝中分離、純化內(nèi)生菌，根據(jù)菌株的形態(tài)與培養(yǎng)特征、生理生化特性、16S r DNA序列分析對其進行菌種鑒定，并檢測其發(fā)酵液不同萃取相抑制α-葡萄糖苷酶活性和抗氧化活性。通過初步活性篩選發(fā)現(xiàn)，有3株內(nèi)生假單胞菌發(fā)酵液抑制α-葡萄糖苷酶活性和抗氧化活性較好，進一步對其發(fā)酵液的乙酸乙酯、正丁醇萃取部分及其剩余水相進行活性檢測。結(jié)果顯示，菌株4c發(fā)酵液乙酸乙酯相(ethyl acetate extract，EAE)抑制α-葡萄糖苷酶活性和清除ABTS+·最好，IC50分別為1.749 mg/mL和1.376 mg/mL；菌株2s發(fā)酵液EAE清除DPPH·活性最好，IC50為0.048 mg/mL，總還原力最強，抗壞血酸當(dāng)量(ascorbic acid equivalent，AEE)為191.627 mg AAE/g dw。

桑枝；內(nèi)生菌；假單胞菌；α-葡萄糖苷酶；抗氧化；菌種鑒定

桑樹是一種在中國乃至亞洲廣泛種植的經(jīng)濟作物，具有很高的藥用價值。桑枝含有多種化學(xué)成分，主要有黃酮類化合物、生物堿、多糖和香豆精類化合物，以及氨基酸、有機酸、揮發(fā)油及多種維生素等。其中的生物堿[1]、多糖類和黃酮類具有很好的降血糖活性[1-4]和抗氧化活性[5]。

內(nèi)生菌是生長在健康植物組織內(nèi)部的微生物，幾乎存在于所有目前已研究過的植物中。美國學(xué)者STIERLE[6]等人從短葉紫杉(Taxusbrevifolia)的樹皮中分離出1株內(nèi)生真菌(Taxomyces andreanae)，在其培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)了紫杉醇(taxol)和其他紫杉烷類化合物。這為人類突破植物資源周期長，不可再生等限制，利用植物內(nèi)生菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)重要植物源藥物提供了新思路。在過去的幾十年里，植物內(nèi)生菌在生物工程與技術(shù)領(lǐng)域，均展現(xiàn)出了巨大的自然資源優(yōu)勢[7]。

α-葡萄糖苷酶(α-glycosidase)是一類能夠從含有α-糖苷鍵底物的非還原端催化水解葡萄糖基酶的總稱，參與人體多種能源物質(zhì)的合成與消化代謝過程[8]。因此，α-糖苷酶抑制劑的開發(fā)對糖尿病患者控制餐后血糖水平具有重要的意義?；钚匝?ROS)是細(xì)胞代謝過程中所產(chǎn)生的自由基，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂肪、DNA等生物大分子的氧化損傷，人如果長期處于氧化損害狀態(tài)，會導(dǎo)致諸如心血管疾病、慢性炎癥、動脈粥樣硬化等慢性疾病[9]。因此，抗氧化劑的研究對治療心血管疾病、慢性炎癥等具有重要的意義。

桑樹內(nèi)生細(xì)菌主要包括芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomouassp.)、歐文氏菌屬(Erwiuiasp.)、短小桿菌屬(Curtobacteriumsp.)以及洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)。武婷婷[10]等人從桑樹中分離出1株具有抑制α-糖苷酶活性的內(nèi)生萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)；路國兵[11]等人曾報道過桑樹內(nèi)生假單胞菌屬(Pseudomonassp.)和歐文氏菌屬(Erwiniasp.)發(fā)酵液的抑菌活性；張飛官[12]等人從桑樹中分離出1株對桑疫病病原菌具有拮抗作用的成團泛菌(Pagglomerans)。桑樹內(nèi)生菌作為一種天然資源庫，具有重要的研究意義。

為了探討桑枝內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)物作為α-糖苷酶抑制劑和抗氧化劑的潛能，本實驗從新一之瀨桑枝中分離出了29株內(nèi)生菌，篩選出3株α-糖苷酶抑制活性和抗氧化活性較好的菌株，并對其發(fā)酵液的乙酸乙酯和正丁醇萃取部分及剩余水相抑制的α-糖苷酶抑制活性和抗氧化活性進行評估，為桑枝內(nèi)生細(xì)菌的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

桑枝(新一之瀨)由重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院提供。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG)、阿卡波糖(Acarbose)，上海源葉生物公司；乙酸乙酯、正丁醇、乙醇：工業(yè)純，重慶川東化工有限公司；奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)、抗壞血酸(ascorbic acid)、K3Fe(CN)6：分析純，成都科龍化工試劑廠； 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：分析純，南京都萊生物技術(shù)有限公司。

細(xì)菌DNA提取試劑盒，PCR體系，生工生物工程(上海)有限公司；16S rDNA基因擴增所用PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；細(xì)菌生化鑒定管，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；純水儀，法國Millipore公司；VS-1300L-U超凈工作臺，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；B-491恒溫水浴鍋，國華電器有限公司； QL-901渦旋儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；BIORAD酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司；紫外分光光度計，德國Thermo公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1 內(nèi)生菌分離與鑒定

1.3.1.1 內(nèi)生菌的分離

將供試桑樹材料用自來水洗凈、晾干備用。參考張飛官[12]等的方法，將桑枝剪成5 cm莖段，在75%乙醇中滅菌1 min，取出，在酒精燈處燃盡酒精。用解剖刀取桑枝表皮、韌皮部組織和木質(zhì)部組織，并將其切面接種在PDA培養(yǎng)基中。以環(huán)境對照和桑枝印跡為對照，確保分離得到的菌株為桑枝內(nèi)生菌。28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察，待桑枝組織周圍出現(xiàn)菌落后，挑取菌落到新的培養(yǎng)基上。平板劃線法反復(fù)純化，直至獲得單菌落。

1.3.1.2 細(xì)菌16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

目的菌株培養(yǎng)12 h后，用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，以通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR擴增細(xì)菌16S rDNA序列。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性：94 ℃，5 min；變性：94 ℃，1 min；退火：50 ℃，1 min；延伸：72 ℃，2 min，25個循環(huán)；再延伸：72 ℃，10 min；10 ℃保溫。

PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)有限公司測序，所得16S rDNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫里進行比對(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下載GenBank中同源性較高序列，利用MEGA 4.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.1.3 生理生化鑒定

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]對其進行生理生化鑒定，包括：菌株培養(yǎng)特征觀察、菌體及菌落形態(tài)觀察；革蘭氏染色、氧化酶試驗、接觸酶試驗、明膠液化試驗、水解淀粉試驗、脂酶(Tween80)試驗、精氨酸雙水解酶試驗、甲基紅(MR)試驗、V-P和膿青素(綠膿菌素)產(chǎn)生的試驗。

1.3.2 活性物質(zhì)提取

挑取單菌落置于200 mL的PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)4 d。獲得的菌液，9 000 r/min，離心20 min，棄菌體，得上清。加3倍體積乙醇沉淀蛋白質(zhì)和多糖；功率60%，超聲波助提40 min。12 000 r/min常溫離心10 min，棄沉淀，得上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到1/8體積。分別用乙酸乙酯和正丁醇萃取，得不同萃取相的萃取物。

1.3.3 抑制α-葡萄糖苷酶活性檢測

參考CHAO和JI[1, 14]等的方法。取不同稀釋濃度的萃取物溶液、α-葡萄糖苷酶溶液(0.5 U/mL)及磷酸鉀緩沖液(67 mmol/L，pH 6.8) 各50 μL混合，充分振蕩，37 ℃預(yù)保溫15 min，加入50 μLpNPG溶液(6 mmol/L)，再于37 ℃酶解15 min，加200 μL Na2CO3溶液(0.2 mol/L)終止反應(yīng)，每個處理分別做3個重復(fù)。各取200 μL反應(yīng)液于96孔板孔中，用酶標(biāo)儀在415 nm波長下測定吸光值。實驗以阿卡波糖(Acarbose)為陽性對照，按公式(1)計算抑制率，并用SPSS軟件計算相應(yīng)IC50值：

抑制率/%=[ 1-(As-Ab) /Ac]×100

(1)

式中：Ac為對照組吸光度；As為樣品組吸光度；Ab為空白組吸光度。

1.3.4 清除DPPH自由基活性檢測

參考GARRY和TAI[15-16]等的方法。取不同稀釋濃度的萃取物溶液和DPPH乙醇溶液(2×10-4mol/L) 各2 mL混合，搖勻，在室溫下，避光反應(yīng)30 min。每個處理分別做3個重復(fù)。移取200 μL反應(yīng)液于96孔板孔中，用酶標(biāo)儀在490 nm下測定吸光值。實驗以抗壞血酸(ascorbic acid)為陽性對照，按公式(2)計算抑制率，并用SPSS軟件計算相應(yīng)IC50值：

抑制率/%=[ 1-(As-Ab)/Ac]× 100

(2)

式中：Ac為對照組吸光度；As為樣品組吸光度；Ab為空白組吸光度。

1.3.5 清除ABTS+·活性檢測

參考MAHAYOTHEE[17]等的方法。 ABTS溶液(7 mmol/L)和過硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L)以2∶1的體積比混合，在室溫避光的條件下，靜置過夜，形成ABTS+·儲備液。加適量磷酸鹽緩沖溶液(0.5 mmol/L，pH 7.4)將ABTS+·儲備液稀釋成工作液，要求其在734 nm波長下的吸光度為0.7±0.02。

取100 mmol/L不同稀釋濃度的萃取物溶液，加入3 mL ABTS+·工作液，準(zhǔn)確振蕩30 s，反應(yīng)6 min，測定734 nm處的吸光值。實驗以奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)為陽性對照，按公式(3)計算抑制率，并用SPSS軟件計算相應(yīng)IC50值：

抑制率/%=[ 1-(As-Ab)/Ac]×100

(3)

式中：Ac為對照組吸光度；As為樣品組吸光度；Ab為空白組吸光度。

1.3.6 總還原力的測定

參考YEN和KOWALSKI[18-19]等的方法。取各萃取物1 000 μg，加入1 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L, pH 6.6) 和1 mL K3Fe(CN)6溶液(10 mg/mL)，在50 ℃下保溫20 min，冰浴終止。向上述混合液中加入1 mL三氯乙酸溶液(100 mg/mL)，再加1 mL FeCl3溶液(1mg/mL)，混合，充分振蕩，在700 nm下測定吸光值(抗壞血酸的質(zhì)量濃度設(shè)置為：1000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、 7.81、0 μg/mL。 按上述步驟操作。)。以抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的總還原力以抗壞血酸的含量表示，記為1 g干重樣品含量抗壞血酸的質(zhì)量，即抗壞血酸當(dāng)量(AEE)，單位為mg AAE/g dw。

1.3.7 統(tǒng)計與分析

每個實驗處理平行3次，試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件、Image Lab軟件分析，作圖使用Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1內(nèi)生菌的分離純化

采用平板稀釋法，從桑枝(新一之瀨)中分離獲得到29株內(nèi)生細(xì)菌，通過初步活性篩選，有3株菌(2s、4b和4c)具有較好的抑制α-葡萄糖苷酶活性和抗氧化活性。

2.2內(nèi)生菌的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)及培養(yǎng)特征

菌種2s的菌落圓扁平形，淡綠色，邊緣整齊，培養(yǎng)基呈現(xiàn)淡綠色；菌種4b的菌落圓形，邊緣半透明，中間白色突起，外邊緣不規(guī)則，有暈圈；菌種4c的菌落圓形，邊緣半透明，中間白色突起，外邊緣不規(guī)則，有暈圈，如圖1。

圖1 菌株形態(tài)觀察圖Fig.1 Morphological examination of strains

2.2.2 16S r DNA 系統(tǒng)發(fā)育分析

以菌株2s、4b和4c基因組DNA為模板，擴增其16S r DNA序列并測序。將其序列相關(guān)信息提交到Gen Bank，獲得相應(yīng)登錄號KY458640、KY458642以及KY458641，結(jié)果詳見表1。

表1 菌株的16S rDNA片段在NCBI上的對比結(jié)果

利用BLAST程序與Gen Bank中已登錄的基因序列進行比對，選取與其同源性較高且已定名的菌株的相關(guān)序列信息，進行系統(tǒng)發(fā)育分析，用MEGA4.0中的N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖2)。由圖2可知，菌株4b和4c親緣關(guān)系相對較近，與菌株2s親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

2.2.3 生理生化鑒定

基于《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]對菌株2s、4b和4c進行生理生化鑒定。檢測結(jié)果表明，菌株2s、4b和4c均能夠水解明膠，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶；均不能水解淀粉；均不能產(chǎn)生脂酶、氧化酶、接觸酶和膿青素；甲基紅(MR)和V-P均顯陰性；均不具有反硝化能力。結(jié)果詳見表2。

圖2 依據(jù)16S r DNA基因序列構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed according to the 16S rDNA gene sequence of strains

表2 菌株2s、4b和4c的生理生化試驗結(jié)果

注：+：陽性(生長成反應(yīng))；-：陰性(不生長或不反應(yīng))。

根據(jù)桑枝內(nèi)生菌株2s、4b和4c的菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征及生理生化特征測定結(jié)果，并結(jié)合基于16S r DNA 的系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定結(jié)果為：菌株2s為綠黃假單胞菌(Pseudomonasviridiflava)，4b和4c為丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)。

2.3抑制α-葡萄糖苷酶活性

為進一步研究菌株2s、4b和4c發(fā)酵液抑制α-葡萄糖苷酶活性物質(zhì)的分段，對其發(fā)酵液進行了不同極性的萃取，結(jié)果如圖3所示。菌株2s、4b和4c發(fā)酵液乙酸乙酯相(ethyl acetate extract，EAE)、正丁醇相(n-Butyl alcohol extract，NBAE)以及剩余水相(water extract，WAE)對α-葡萄糖苷酶具有明顯的體外抑制作用，并呈現(xiàn)量效關(guān)系。

圖3 菌株2s、4b和4c發(fā)酵液不同萃取相α-葡萄糖苷酶抑制活性隨濃度的變化Fig.3 Strains fermented liquid phase in different extraction to inhibit α-glucosidase activity along with the change of the concentration of free radical activity

通過SPSS軟件分析其不同菌株，不同萃取相抑制α-葡萄糖苷酶IC50，結(jié)果如圖4所示。3株內(nèi)生假單胞菌發(fā)酵液不同萃取相中，抑制α-葡萄糖苷酶活性為EAEgt;NBAEgt;WAE(**plt;0.01)。

對于EAE部分抑制α-葡萄糖苷酶IC50，菌株4c(1.749 mg/mL)lt; 2s(3.058 mg/mL)lt;4b(6.576 mg/mL)，說明菌株4c發(fā)酵液EAE部分抑制α-葡萄糖苷酶活性顯著高于菌株2s、4b(plt;0.05)；對于NBAE部分，菌株2s(4.121 mg/mL) lt;4c(9.912 mg/mL)lt;4b(14.088 mg/mL)，菌株2s發(fā)酵液NBAE部分抑制α-葡萄糖苷酶活性顯著高于菌株4b、4c(plt;0.05)；對于WAE部分，菌株2s(29.857 mg/mL)lt;4c(35.962 mg/mL)lt;4b(43.117 mg/mL) ，菌株2s發(fā)酵液WAE部分抑制α-葡萄糖苷酶活性顯著高于菌株4b、4c (plt;0.05)。

圖4 菌株發(fā)酵液不同萃取相抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值Fig.4 The IC50 of strains fermented liquid phase in different extraction to inhibit α-glucosidase

由此可知，桑枝內(nèi)生假單胞菌發(fā)酵液抑制α-葡萄糖苷酶活性的活性物質(zhì)主要分布在乙酸乙酯部分，是一類小極性物質(zhì)。3株假單胞菌發(fā)酵液不同萃取相比較，菌株4c發(fā)酵液乙酸乙酯部分活性最好，但仍顯著差于陽性對照阿卡波糖(IC50：1.749 mg/mLgt;0.011 μg/mL，plt;0.05)。

目前關(guān)于這3株假單胞菌發(fā)酵液抑制α-葡萄糖苷酶抑制活性物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確，有必要進一步在生物活性的指導(dǎo)下開展活性物質(zhì)分離與鑒定的研究，從而發(fā)現(xiàn)高活性α-葡萄糖苷酶抑制劑的先導(dǎo)化合物。

2.4發(fā)酵液抗氧化活性分析

自由基能夠?qū)ι锛?xì)胞分子產(chǎn)生明顯的氧化損傷，所以清除自由基對生物分子抗氧化防御體系非常重要。分別檢測了3株內(nèi)生假單胞菌發(fā)酵液不同萃取相對DPPH·、ABTS+·的清除能力，以及總還原力的檢測。

2.4.1 清除DPPH·活性

如圖5所示，3株內(nèi)生假單胞菌不同萃取相對DPPH·均具有很好的清除效果，并呈現(xiàn)量效關(guān)系。

圖5 菌株2s、4b和4c發(fā)酵液不同萃取相的清除DPPH·活性隨濃度的變化Fig.5 Strains fermented liquid phase in different extraction to remove DPPH free radical activity along with the change of the concentration of free radical activity

由圖6可知，3株內(nèi)生假單胞菌發(fā)酵液不同萃取相中，清除DPPH·自由基能力為EAEgt; NBAEgt; WAE(**plt;0.01)。

對于EAE部分，菌株2s(0.048 mg/mL)lt;4c(0.050 mg/mL)lt;4b(0.149 mg/mL)，菌株2s和4c發(fā)酵液的EAE清除DPPH·能力顯著高于菌株4b(plt;0.05)，菌株2s和4c發(fā)酵液的EAE清除DPPH·能力差異不顯著(pgt;0.05)；對于NBAE部分，菌株2s(0.457 mg/mL)lt;4c(0.589 mg/mL)lt;4b(1.032 mg/mL)，菌株4c發(fā)酵液的NBAE清除DPPH·自由基能力顯著性高于菌株4b、2s(plt;0.05)；對于WAE部分，菌株4c(1.012 mg/mL)lt;2s(2.399 mg/mL)lt;4b(3.012 mg/mL)，菌株4c發(fā)酵液的WAE清除DPPH·能力顯著性高于菌株2s、4b(plt;0.05)。

由此可知，桑枝內(nèi)生菌發(fā)酵液清除DPPH·的活性物質(zhì)主要在乙酸乙酯部分。3株內(nèi)生菌發(fā)酵液活性相比較，菌株2s和4c發(fā)酵液乙酸乙酯部分活性最好，與陽性對照抗壞血酸清除DPPH·的能力無顯著差異(2s: 0.048 mg/mL；4c：0.050 mg/mL；抗壞血酸：0.014 mg/mL，pgt;0.05)。

圖6 菌株發(fā)酵液不同萃取相的清除DPPH·活性的IC50值Fig.6 The IC50 of strains fermented liquid phase in different extraction to remove DPPH free radical activity

2.4.2 清除ABTS+·能力

如圖7所示，3株內(nèi)生假單胞菌不同萃取相對ABTS+·均具有很好的清除效果，并呈現(xiàn)量效關(guān)系。

圖7 菌株2s、4b和4c發(fā)酵液不同萃取相清除ABTS+·活性比較Fig.7 Strains fermented liquid phase in different extraction to remove ABTS free radical activity along with the change of the concentration of free radical activity

由圖8可知，菌株2s、4b和4c菌液不同萃取相中，清除ABTS+·能力為EAEgt;NBAEgt; WAE(**plt;0.01)。

對于EAE部分清除ABTS+·能力的IC50，菌株4c(0.226 mg/mL)lt;2s(0.236 mg/mL)lt;4b(0.393 mg/mL)，菌株4c和2s沒有顯著性差異(pgt;0.05)，但均顯著優(yōu)于菌株4b清除ABTS+·能力(plt;0.05)；對于NBAE部分清除ABTS+·能力的IC50，菌株4c(1.376 mg/mL) lt;2s(1.384 mg/mL)lt;4b(3.317 mg/mL)，菌株4c和2s沒有顯著性差異(pgt;0.05)，但都顯著優(yōu)于菌株4b清除ABTS+·能力(plt;0.05)；對于WAE部分清除ABTS+·能力的IC50，菌株4b(4.658 mg/mL) lt;2s(5.102 mg/mL)lt;4c(9.068 mg/mL)，菌株4b清除ABTS+·能力顯著優(yōu)于菌株2s、4c(plt;0.05)。

桑枝內(nèi)生菌發(fā)酵液清除ABTS+·的活性物質(zhì)主要分布也在乙酸乙酯部分。3株內(nèi)生菌發(fā)酵液清除ABTS+·活性相比較，菌株4c發(fā)酵液乙酸乙酯部分活性最好，但顯著差于陽性對照Trolox清除ABTS+·活性(IC50：0.079 mg/mL)。

圖8 菌株發(fā)酵液不同萃取相清除ABTS+自由基活性的IC50值Fig.8 The IC50 of strains fermented liquid phase in different extraction to remove ABTS+free radical activity

2.4.3 總還原力的檢測

總還原力是評價樣品抗氧化性能的常用方法，通常物質(zhì)的還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)[20]。在本次實驗中，抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9-A所示，R2=0.999，線性關(guān)系良好。根據(jù)回歸方程y=0.031 1x+0.043 4，計算內(nèi)生假單胞菌發(fā)酵液不同萃取相的抗壞血酸當(dāng)量，結(jié)果如圖9-B所示。

在3株內(nèi)生假單胞菌發(fā)酵液不同萃取相中，EAE的總還原力顯著高于NBAE，NBAE的總還原力顯著高于WAE。

圖9 菌株2s,4b和4C發(fā)酸的不同萃取相抗壞血酸當(dāng)量比較Fig.9 Strains 2s,4b anel 4C fermentation broth in defferent extraction phase of ascorbic acid quivalent

發(fā)酵液EAE的抗壞血酸當(dāng)量：菌株2s(191.627 mg AAE/g dw)gt;4c(150.566 mg AAE/g dw)gt;4b(145.389 mg AAE/g dw) (**plt;0.01)。由此可知，菌株2s發(fā)酵液EAE的總還原力顯著高于菌株4b、4c(plt;0.05)；發(fā)酵液NBAE的抗壞血酸當(dāng)量：菌株4c(44.360 mg AAE/g dw)gt;2s(36.225 mg AAE/g dw)gt;4b(21.096 mg AAE/g dw)。由此可知，菌株4c發(fā)酵液NBAE的總還原力顯著高于菌株2s、4b(plt;0.05)；發(fā)酵液WAE的抗壞血酸當(dāng)量：菌株2s(17.069 mg AAE/g dw)gt;4b(15.035 mg AAE/g dw) gt;4c(13.661 mg AAE/g dw)，菌株2s發(fā)酵液WAE的總還原力顯著高于菌株4b、4c(plt;0.05)。

3株內(nèi)生假單胞菌不同萃取相清除DPPH·活性、清除ABTS+·活性以及總還原力的檢測結(jié)果均表明，內(nèi)生菌發(fā)酵液萃取物具有很好的抗氧化活性。且其清除自由基的活性成分多屬于中、小極性物質(zhì)。通過TLC和HPLC檢測，發(fā)現(xiàn)具有多個活性物質(zhì)，且這些活性物質(zhì)極性極為相似，難以分離純化得到單體。因此，我們推測內(nèi)生菌發(fā)酵液抗氧化活性物質(zhì)可能為結(jié)構(gòu)相似的一類化合物。

3 結(jié)論

本研究從新一之瀨桑枝中分離并鑒定出了3株內(nèi)生假單胞菌，其代謝產(chǎn)物具有一定的抑制α-葡萄糖苷酶活性和抗氧化活性，經(jīng)檢測，其活性物質(zhì)主要分布在乙酸乙酯部分，正丁醇部分次之，水相相對較少。其中，菌株4c發(fā)酵液EAE部分抑制α-葡糖糖苷酶活性和清除ABTS+·活性最好，IC50分別為：1.749 mg/mL、1.376 mg/mL。菌株2s發(fā)酵液EAE清除DPPH·自由活性最好，IC50為0.048 mg/mL，總還原力最強，AEE當(dāng)量為191.627 mg AAE/g dw。本研究為利用植物內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)具有降血糖和有抗氧化功能的保健食品提供了理論參考。

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Theinhibitionofα-glucosidaseandantioxidantactivityofendophytemetaboliteisolatedfrommulberry

JIA Ya-nan1, LU Hai-peng1, YU Yan1, LIU Xin-jin1, CHEN Wei1, ZENG Ling-shu2, PAN Min-hui1, XU Li1*

1(College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China) 2(Institute of Sericulture Science and Technology Research, Chongqing 400700, China)

The endophytes were separated and purified from mulberry twigs,and their species were further identified using morphological observation, physiological and biochemical characteristics and molecular biology method. The inhibition of α-glucosidase and the activities of antioxidant in different extractive phases of fermentation broth of the endophytes were examined. The preliminary activities screening showed that three strains of endophytePseudomonasfermentation broth had a good inhibiting activity for α-glucosidase and good antioxidant activities. Two kinds of solvents with different polarity were used, and named as EAE, NBAE and WAE, respectively. The fermentation liquid was extracted and detected. The EAE (ethyl acetate extract) of strain 4c fermentation broth has a good α-glucosidase inhibition and ABTS+· scavenging capacity. IC50was 1.749 mg/mL and 1.376 mg/mL respectively. The EAE of strain 2s fermentation broth had the strongest DPPH· scavenging activity with the IC50of 0.048 mg/mL and the best total reducing power with the ascorbic acid equivalent (AEE) of 191.627 mg AAE/g dw. This research is so vital to offer a reference for the application of mulberry endophytic bacteria in producing function food.

Mulberry Twig; endophytes; Pseudomonas; α-glucosidase; antioxidant; strain identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014921

碩士研究生(徐立副教授為通訊作者，E-mail:mulberry@swu.edu.cn)。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(XDJK2016E104，XDJK2017D115)；重慶市科委民生項目(CSCT2017shms—xdny80083);國家蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-22-ZJ0204)

2017-06-08，改回日期：2017-08-04