劇檸，趙梅梅，柯媛，陳玲，趙智慧，馬艷

1(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏回族自治區(qū)銀川，750021) 2(寧夏紅枸杞產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司，寧夏回族自治區(qū)銀川，750000)

枸杞果酒用非釀酒酵母的分離篩選及香氣成分分析

劇檸1,2 *，趙梅梅1，柯媛2，陳玲2，趙智慧2，馬艷2

1(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏回族自治區(qū)銀川，750021) 2(寧夏紅枸杞產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司，寧夏回族自治區(qū)銀川，750000)

研究顯示非釀酒酵母在果酒發(fā)酵前期可產(chǎn)生更多的香氣成分，有助于果酒風(fēng)味的提高。為獲得適合枸杞果酒發(fā)酵的非釀酒酵母，從枸杞果園土壤、枸杞鮮果及枸杞果自然發(fā)酵液中分離出酵母82株。經(jīng)香氣初步篩選及耐受性研究，確定3株酵母各方面性能良好。經(jīng)26S rDNA序列分析，確定GF-60和GF-80為葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)，GB-1為戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)。將GF-60與商用釀酒酵母以3∶1比例進(jìn)行混合發(fā)酵枸杞果酒，經(jīng)GC-MS測(cè)定分析，結(jié)果顯示與釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵相比，混種發(fā)酵含有更多種類的香氣成分。

非釀酒酵母；耐受性；枸杞果酒；香氣成分

枸杞含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分及生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)人體免疫力, 以及抗衰老、防腫瘤等功效，被國(guó)家列為藥食同源物品[1-3]。枸杞果酒是以寧夏枸杞果為原料，經(jīng)酵母菌發(fā)酵制成的低度酒，較完整的保留了枸杞的主要營(yíng)養(yǎng)成分[4-5]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)果酒接受度的提高，枸杞發(fā)酵果酒也越來(lái)越被大眾所歡迎。然而，目前生產(chǎn)枸杞果酒使用的酵母多為葡萄酒專用的釀酒酵母。該類酵母具有較強(qiáng)的發(fā)酵能力，但產(chǎn)生香氣的能力不足。此外，與其他果酒生產(chǎn)不同，考慮到季節(jié)性因素，枸杞果酒中生產(chǎn)中常使用枸杞干果復(fù)水的方法進(jìn)行發(fā)酵；同時(shí)為去除表面農(nóng)藥殘留，生產(chǎn)中枸杞原料發(fā)酵前需進(jìn)行清洗，這使得大量枸杞果表面的非釀酒酵母被除去，發(fā)酵前期非釀酒酵母的作用無(wú)法得以發(fā)揮。因此，枸杞果酒存在著果香不突出、典型性欠佳的缺陷，影響了枸杞果酒的品質(zhì)及銷量。

大量研究表明，非釀酒酵母在葡萄酒釀制過(guò)程中，通過(guò)與釀酒酵母的共同發(fā)酵來(lái)控制酒體不理想的風(fēng)味或者降低乙醇含量來(lái)賦予葡萄酒復(fù)雜的香氣，從而增加葡萄酒感官質(zhì)量特征的復(fù)雜性[6-8]。這些非釀酒酵母包括美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)[9]、戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)[10]、季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniasporaguilliermondii)[6]、嗜高壓有孢漢遜酵母(Hanseniasporaosmophila)[11]、檸檬形克勒克酵母(Klockeraapiculata)[12]、德巴利酵母(Debaryomycesvanriji)[13]及葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)[14]等。 這些酵母在發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生一些高級(jí)醇、低級(jí)脂肪酸和酯類等芳香化合物，使得果酒的氣味芬芳，酒體典型性更加突出。

為此，本項(xiàng)目從枸杞果表面、枸杞果園土壤及枸杞自然發(fā)酵醪液中分離出非釀酒酵母菌，經(jīng)過(guò)感官評(píng)價(jià)及耐受性篩選獲得性能較為優(yōu)良的酵母，通過(guò)26S rDNA序列分析進(jìn)行菌種鑒定確定其歸屬，并對(duì)其與釀酒酵母混種發(fā)酵的枸杞酒香氣成分進(jìn)行分析，從而篩選出能夠改善枸杞酒香氣的酵母菌。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 樣品采集

針對(duì)不同時(shí)節(jié)、不同樹齡、不同從枸杞樹品種的果園土壤、枸杞鮮果進(jìn)行采樣。樣品無(wú)菌采集后送至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基與溶液配制方法

YPD(酵母膏胨葡萄糖)培養(yǎng)基：按葡萄糖2.0 %，蛋白胨2.0 %，酵母浸粉1.0 %，蒸餾水配置，自然pH值，121 ℃高壓滅菌20 min；固體培養(yǎng)基則加入2.0 %瓊脂粉。

PDA培養(yǎng)基：土豆去皮洗凈，稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛，用雙層紗布過(guò)濾，加熱，再據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要加1～10 g瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后在補(bǔ)足水分至1 000 mL，分裝試管或者錐形瓶，加塞、包扎，121 ℃滅菌20 min后取出試管擺斜面或者搖勻，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 菌種及主要儀器

釀酒酵母AC(Saccharomycescerecisiae522 Davis)，由法國(guó)Laffort公司生產(chǎn)；日本島津GCMS-TQ8040三重四極桿型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；美國(guó)supelco 公司手動(dòng)固相微萃取(SPME)裝置。

1.2方法

1.2.1 酵母菌的分離

(1)土壤及枸杞果表面的分離

① 增菌：取5.0 g樣品于45 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)24～48 h或更長(zhǎng)時(shí)間，直至液體培養(yǎng)基變渾濁，鏡檢有活菌存在后進(jìn)一步分離純化。

② 計(jì)數(shù)：將經(jīng)過(guò)增菌的液體進(jìn)行10倍梯度稀釋，并分別吸取0.1 mL均勻涂布于加有30 mg/L亞硫酸鈉(以抑制細(xì)菌生長(zhǎng))的YPD培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h。

③ 分離：選取2天后生長(zhǎng)于YPD培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落，根據(jù)菌落形態(tài)特征及鏡檢結(jié)果，挑取單菌落于PDA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)分純。

(2)枸杞自然發(fā)酵液中酵母菌的分離

① 自然發(fā)酵：無(wú)菌狀態(tài)下稱量約100 g新鮮成熟度好的枸杞，放入無(wú)菌的500 mL錐形瓶中，用無(wú)菌的研錘搗碎，用封口膜封好，置于28 ℃培養(yǎng)，每2 h觀察1次。

② 計(jì)數(shù)：在發(fā)酵前、中、后3個(gè)時(shí)期，分別提取汁液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取0.1 mL樣品稀釋液均勻涂布于酸化PDA培養(yǎng)基上，28 ℃ 培養(yǎng)48 h。

③ 分離：同1.2.1(1)。

(3) 保藏

鏡檢為純種后進(jìn)行4 ℃斜面保藏，每隔3個(gè)月轉(zhuǎn)接1次；同時(shí)進(jìn)行甘油-40 ℃菌種長(zhǎng)期保藏。

1.2.2 產(chǎn)香酵母的篩選

將分離菌株劃線接種于YPD 平板上， 28 ℃培養(yǎng) 3～5 d，通過(guò)嗅聞法[15]初步判斷是否有酯香或醇香，篩選具有較濃酯香氣或特殊果香氣的菌株。將初篩獲得的酵母菌接種于枸杞汁培養(yǎng)基中， 28 ℃活化培養(yǎng)24 h后，以4.0 %接種量接種于裝有200 mL枸杞汁的三角瓶中，28 ℃培養(yǎng) 3～5 d，再次通過(guò)嗅聞法[15]判定具有較濃酯香氣或特殊果香氣的菌株。

1.2.3 產(chǎn)香酵母的耐受性研究

制備不同初始葡萄糖濃度、不同pH、不同SO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)及不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的滅菌YPD液體培養(yǎng)基，按4.0 % 的接種量接種， 28 ℃培養(yǎng)48 ～72 h觀察并記錄結(jié)果。其中，乙醇耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果需通過(guò)分光光度計(jì)在560 nm下檢測(cè)OD值獲得。同時(shí)將相同接種量的枸杞汁培養(yǎng)基在不同溫度下培養(yǎng)48 h ，觀察并記錄其產(chǎn)期情況。

1.2.4 26S rDNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

分離的酵母菌純種送基因公司測(cè)序，將測(cè)序后結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，篩選相似度高的18序列，采用Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對(duì)，MEGA 5.05繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 枸杞果酒的釀制及操作要點(diǎn)

圖1 枸杞果酒發(fā)酵工藝流程Fig.1 The fermentation process of wolfberry wine

操作要點(diǎn)：

(1)干果復(fù)水：干枸杞和水按照質(zhì)量比為1∶10的比例進(jìn)行混合復(fù)水。

(2)浸提：將復(fù)水好的液體煮沸30 min，冷卻后留清汁備用。

(3)預(yù)處理：30～40 ℃下，添加30 mg/kg果膠酶和50 mg/kg果汁復(fù)合酶進(jìn)行酶解。酶解后的枸杞汁，添加40 mg/kg SO2處理。

(4)調(diào)整成分：在枸杞汁中添加檸檬酸至酸度值為3 g/L；同時(shí)，為使目標(biāo)酒精體積分?jǐn)?shù)在8.0 %～10.0 %，在發(fā)酵前期及發(fā)酵中進(jìn)行分批次補(bǔ)加白砂糖。

(5)酵母活化：將酵母菌分別接種于干果復(fù)水的枸杞汁培養(yǎng)基中活化。枸杞汁培養(yǎng)基按1.2.5(1)操作。

(6)發(fā)酵：采取清汁發(fā)酵的方式，發(fā)酵溫度設(shè)為20 ℃。分別發(fā)酵兩種酒，一種為單獨(dú)接種釀酒酵母AC，另一種為葡萄汁有孢漢遜酵母GF-60與釀酒酵母AC以3∶1的比例同時(shí)接種發(fā)酵。接種量按體積分?jǐn)?shù)8%接種。

(7)分離：當(dāng)比重達(dá)0.992～0.996，殘?zhí)堑陀? g/L時(shí)發(fā)酵結(jié)束，采用虹吸法進(jìn)行分離。

(8)澄清過(guò)濾：抽濾機(jī)進(jìn)行精濾。

(9)理化檢測(cè)：測(cè)定揮發(fā)酸、殘?zhí)?、酒度、總酸、游離SO2、總SO2。

1.2.6 香氣成分分析

(1)揮發(fā)性化合物的萃取

利用手動(dòng)頂空固相微萃取(HS-SPME)法對(duì)枸杞酒樣品中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行富集，取20 mL頂空瓶，用無(wú)菌移液管加8 mL于40 ℃恒溫磁力攪拌器上平衡10 min，插入CAR/DVB/PDMS纖維頭40 ℃吸附15 min，GC解吸3 min，用于GC-MS分析。

(2)氣相色譜質(zhì)譜工作條件

色譜條件為：色譜柱為RTX-WAX (30 m×0.25 mm×0.25 μm )，程序升溫：40 ℃保持2 min，以5 ℃/min 升至180 ℃，再以8 ℃/min 升至220 ℃，保持1 min。載氣為He，體積流量為1.40 mL/min，進(jìn)樣口溫度為210 ℃。質(zhì)譜條件為：EI 電離源，電子能量為70 eV，燈絲流量為0.20 mA。檢測(cè)器電壓為350 V。掃描范圍為20～450 AMU，離子源溫度為200 ℃。

對(duì)采集到的質(zhì)譜圖利用NIST 02譜庫(kù)進(jìn)行檢索。

2 結(jié)果與討論

2.1產(chǎn)香酵母的分離及初篩結(jié)果

通過(guò)分離純化共獲得純種酵母菌82株。其中6株分離自土壤，13株分離自枸杞果表面，63株分離枸杞自然發(fā)酵液的不同時(shí)期(發(fā)酵前期9株，中期48株，后期4株)。

通過(guò)嗅聞法初篩后獲得24株酵母菌，進(jìn)一步接入枸杞汁發(fā)酵后篩選出9株果香和酒香味較濃的酵母菌，分別為GB-1、GB-21、GB-23、GB-26、GB-40、GF-60、GF-65、GF-85、和GG-8。

2.2產(chǎn)香酵母的對(duì)葡萄糖的耐受性

針對(duì)上述9株產(chǎn)香酵母進(jìn)行葡萄糖、pH、SO2及溫度耐受性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。從表1的結(jié)果可知，菌GB-1、GB-26、GB-40和GF-85在對(duì)糖的耐受性最好，在100～400 g/L的糖質(zhì)量濃度下，24 h內(nèi)生長(zhǎng)旺盛。GG-8可耐受100 g/L的糖，24 h內(nèi)生長(zhǎng)旺盛；延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至48 h，GG-8在100～400 g/L 的糖質(zhì)量濃度下可生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)旺盛。GB-21和GF-60可在100～400 g/L 的糖濃度下生長(zhǎng)，48 h后生長(zhǎng)達(dá)到旺盛。100～400 g/L 的糖質(zhì)量濃度下，GF-23和GF-60在24 h內(nèi)未生長(zhǎng)，然而在48 h后觀察這2株菌可耐受在100～300 g/L 的糖質(zhì)量濃度，且生長(zhǎng)良好。GF-65在100～400 g/L的糖質(zhì)量濃度下均無(wú)法生長(zhǎng)。

表1 不同酵母菌糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：“+++++”表示氣體充滿整個(gè)杜氏管，“++++”表示氣體充滿杜氏管4/5，“+++”表示氣體充滿杜氏管3/5，“++”表示氣體充滿杜氏管2/5，“+”表示氣體充滿杜氏管1/5，“-”表示氣體充滿杜氏管lt;1/5，“--”表示未起酵。

2.3產(chǎn)香酵母的對(duì)SO2的耐受性

表2給出了菌株耐受SO2的情況。所有供試的9菌株耐受SO2的能力都很強(qiáng)。其中GB-1，GB-21，GB-23，GB-26和GB-40在24 h內(nèi)即可在含100～250 mg/L SO2的培養(yǎng)基中旺盛生長(zhǎng)。GF-60、GF-65、GF-85和GG-8在24 h內(nèi)即可在含100～250 mg/L SO2的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，48 h后生長(zhǎng)達(dá)到旺盛。

2.4產(chǎn)香酵母的對(duì)乙醇的耐受性

酵母菌OD值越大，則表示該酵母菌生長(zhǎng)越旺盛，即對(duì)該濃度乙醇的耐受性越強(qiáng)。因此，根據(jù) OD 值測(cè)定結(jié)果，以酵母菌 OD 生長(zhǎng)值的平均值為標(biāo)準(zhǔn)，將各類酵母菌生長(zhǎng)情況設(shè)定為4個(gè)等級(jí)，即I不生長(zhǎng)(0lt;ODlt;0.03)，II生長(zhǎng)(0.05lt;ODlt;0.09)，III良好生長(zhǎng)(0.150lt;ODlt;0.200)，IV旺盛生長(zhǎng)(ODgt;0.200)，生長(zhǎng)結(jié)果見表3。

表2 不同酵母耐SO2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：“+++++”表示氣體充滿整個(gè)杜氏管，“++++”表示氣體充滿杜氏管4/5，“+++”表示氣體充滿杜氏管3/5，“++”表示氣體充滿杜氏管2/5，“+”表示氣體充滿杜氏管1/5，“-”表示氣體充滿杜氏管lt;1/5，“--”表示未起酵。

從結(jié)果可以看出，GB-1和GF-60耐受乙醇的能力最強(qiáng)，即使在14%的乙醇體積分?jǐn)?shù)下，24 h內(nèi)依然可以旺盛生長(zhǎng)。其次為GB-21、GF-65和GF-85，在12%的乙醇濃度下，24 h內(nèi)依然可以旺盛生長(zhǎng)。GF-40雖然生長(zhǎng)不旺盛，但在10%～14%的乙醇體積分?jǐn)?shù)下均可得以生長(zhǎng)。其余菌株，GB-21、GB-23、GB-26、GG-8在10%～12%的乙醇下均可得以生長(zhǎng)，不能耐受14%的乙醇。

表3 不同酵母耐受乙醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5產(chǎn)香酵母的對(duì)溫度的耐受性

表4給出了9株酵母對(duì)溫度的耐受性。除GB-23、GF-60和GF-65在40 ℃下不生長(zhǎng)外，所有菌株都可在10～40 ℃的范圍內(nèi)生長(zhǎng)。GB-1在果酒常用的低溫發(fā)酵的范圍(15～20 ℃)24 h內(nèi)即可達(dá)到旺盛生長(zhǎng)。此外，GB-21、GB-23、GB-40、GF-65和GF-85在15～20℃的范圍內(nèi)，36 h產(chǎn)氣充滿杜氏管，說(shuō)明生長(zhǎng)旺盛。

2.6優(yōu)良產(chǎn)香酵母的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

研究顯示，非釀酒酵母在果酒發(fā)酵的前期發(fā)酵可以產(chǎn)生更多的香氣成分，因此其發(fā)酵前期菌種本身的特性非常重要。根據(jù)耐受性結(jié)果，菌株GB-1，GF-85，GF-60性能較為優(yōu)良。對(duì)該3株菌進(jìn)行26S rDNA基因序列測(cè)定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖 2。根據(jù)菌體形態(tài)、菌落形態(tài)特征以及序列對(duì)比分析，菌株GF-85與GF-60鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)，菌株GB-1鑒定為戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)。

表4 不同溫度下酵母菌的生長(zhǎng)情況

注：“++++”表示氣體充滿整個(gè)杜氏管，“+++”表示氣體充滿杜氏管3/4“++”表示氣體充滿杜氏管2/4，“+”表示氣體充滿杜氏管1/4，“-”表示氣體充滿杜氏管lt;1/4，“--”表示未起酵。

圖2 基于26S rRNA D1 /D2 區(qū)域序列構(gòu)建的酵母菌菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of yeast strains based on 26S rRNA D1/D2 domain sequence analyses

2.7香氣成分分析

采用釀酒酵母AC單獨(dú)發(fā)酵及GF-60與AC以3∶1的方式進(jìn)行混合發(fā)酵生產(chǎn)枸杞發(fā)酵果酒，發(fā)酵結(jié)束后采用GC-MS對(duì)其中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析比較。總離子流圖見圖3，圖4。

所檢測(cè)到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索后，獲得不同樣品揮發(fā)性化合物的種類及相對(duì)含量見表5。實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出揮發(fā)性化合物46種，其中酯類25種、醇類8種、烷烴類6種、酮類2種、酸類2種、烯烴類1種、醛類1種。與釀酒酵母AC單獨(dú)發(fā)酵的枸杞酒樣相比，葡萄汁有孢漢遜酵母GF-60與釀酒酵母AC混合發(fā)酵枸杞酒所檢出的香氣成分更為復(fù)雜。

圖3 釀酒酵母AC單獨(dú)發(fā)酵枸杞果酒的GC-MS總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of wolfberry wines with Saccharomyces cerecisiae AC fermentation

圖4 葡萄汁有孢酵母GF-60與釀酒酵母AC(3∶1)混種發(fā)酵枸杞果酒的GC-MS總離子流圖Fig.4 Total ion chromatograms of wolfberry wines with Hanseniaspora uvarum GF-60 and Saccharomyces cerecisiae AC mixed fermentation (3∶1)

酯類物質(zhì)是構(gòu)成枸杞酒香氣的主要成分?；旌习l(fā)酵所檢測(cè)到的酯類物質(zhì)無(wú)論從種類(20種)還是含量(31.58%)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵時(shí)酒樣中酯類種類(13種)及含量(15.14%)。且混合發(fā)酵產(chǎn)生的主要的酯類物質(zhì)辛酸乙酯(13.00%)和癸酸乙酯(8.36%)均高于釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵所產(chǎn)生的辛酸乙酯(9.21%)和癸酸乙酯(2.33%)。其中辛酸乙酯具有白蘭地酒香氣，癸酸乙酯具有果香和花香的香氣。此外，混合發(fā)酵還檢出多種單獨(dú)發(fā)酵未檢出的酯類，這些酯類物質(zhì)大多具有花香和果香氣，雖然含量很低，但較低的閾值使得混合發(fā)酵枸杞果酒具有比釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵更為豐富的香氣。因此，混合發(fā)酵的枸杞果酒具有更加濃郁的花香和果香味。

表5 兩種枸杞果酒的主要香氣成分

除酯類物質(zhì)外，醇類物質(zhì)也是枸杞酒揮發(fā)性成分的重要組成部分?；旌习l(fā)酵所檢測(cè)到的醇類物質(zhì)種類(7種)和含量(35.41%)低于釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵的種類(8種)及含量(71.42%)。其中，枸杞果酒種主要的醇類物質(zhì)1,3-丁二醇在混合發(fā)酵枸杞酒中含量(24.94%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵的酒體(51.49%)。異戊醇是枸杞果酒種另一種主要醇類，同樣其在混合發(fā)酵枸杞酒中的含量(7.95%)低于釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵的酒體(13.10%)。1,3-丁二醇略有苦甜味，異戊醇具有酒香和果香的味道。因此，混合發(fā)酵酒體的苦味沒(méi)有釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵時(shí)的明顯。

烷烴類化合物相對(duì)含量較低且烷烴香味閾值較高，對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的直接貢獻(xiàn)不大，但其可能是形成雜環(huán)化合物的重要中間體，有助于提高酒體的整體風(fēng)味。

4-羥基-2-丁酮具有芳香氣味，混合發(fā)酵酒樣中相對(duì)含量為10.18%，而AC發(fā)酵酒樣未檢出。檢出的另一物質(zhì)，3-羥基2-丁酮具有令人愉快的奶香氣，其在混合發(fā)酵酒樣中的相對(duì)含量略高于單獨(dú)發(fā)酵酒樣。

此外，GF-60的混合發(fā)酵樣品中還檢測(cè)到乙酸和4-羥基-丁酸兩種酸類，癸醛一種醛類，這些物質(zhì)雖然含量低，但都對(duì)復(fù)雜的香氣做出了貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

從枸杞果園土壤、枸杞鮮果及枸杞自然發(fā)酵液中分離出酵母82株。經(jīng)感官初篩獲得9株果香和酒香味較濃的酵母菌。經(jīng)葡萄糖耐受性、SO2耐受性、乙醇耐受性、溫度耐受性實(shí)驗(yàn)，確定GF-60和GF-80和GB-1各方面性能良好。經(jīng)26S rDNA序列分析，確定菌GF-60和GF-80為葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)，GB-1為戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)。將GF-60與商用釀酒酵母以3∶1進(jìn)行混合發(fā)酵枸杞果酒，經(jīng)GC-MS測(cè)定分析，結(jié)果顯示與釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵相比，混種發(fā)酵含有更多種類的香氣成分；與釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵相比，具有更加復(fù)雜的花香與果香氣，原有苦味減弱，有助于提高改善枸杞酒的風(fēng)味。

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Isolation,screeningandanalysisofaromacomponentsofnon-Saccharomycesforwolfberrywine

JU Ning1,2*, ZHAO Mei-mei1, KE Yuan2, CHEN Ling2, ZHAO Zhi-hui2, MA Yan2

1 (School of Agriculture Ningxia University, Yinchuan 750021, China) 2 (Ningxia Hong Gouqi Industry Group Co., Ltd, Yinchuan 750000, China)

Studies have shown that nonSaccharomycescan produce more aroma components at the pre- fermentation stage of fruit wine, which contributes to the improvement of wine flavor. In order to obtain the non-Saccharomycessuitable for wolfberry wine, 82 strains of yeast were isolated from wolfberry orchard soil, fresh fruit of wolfberry and naturally fermented wolfberry liquid. 3 strains showed good performance in aroma and tolerance after preliminary screening and tolerance study. By the analysis of 26S rDNA sequence, GF-60 and GF-85 were identified asHanseniasporauvarum, GB-1 was identified asTorulasporadelbrueckii. Through GC-MS analysis, the wolfberry wine fermented by GF-60 and commercial yeast (ratio 3∶1) produced more kinds of aroma components than which was fermented only by commercial yeast.

non-Saccharomyces; tolerance; wolfberry wine; aroma components

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014953

博士，副教授(本文通訊作者,E-mail:juning1122@163.com。第1、第2單位對(duì)本文具有同等作用)。

中央財(cái)政支持地方高校改革發(fā)展資金項(xiàng)目(2017)

2017-06-13，改回日期：2017-08-05