譚永水，郭琳，劉新利*，侯麗華

(1.齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，濟(jì)南 250353；2.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457)

三種醬油發(fā)酵曲霉酶活力的比較

譚永水1，郭琳2，劉新利1*，侯麗華2

(1.齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，濟(jì)南 250353；2.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457)

制曲對(duì)醬油釀造至關(guān)重要，影響著醬油的品質(zhì)。因此，本研究對(duì)醬油制曲過(guò)程中的米曲霉A、米曲霉滬釀3.042、米曲霉A100-8 3種曲霉在不同時(shí)間的酶活力進(jìn)行了研究，包括酸性蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶、亮氨酸氨肽酶、谷氨酰胺酶、植酸酶。結(jié)合酶活力的變化趨勢(shì)、原料水解度以及釀造后期淋油的綜合情況，最終確定在制曲42 h對(duì)3株曲霉所制備的大曲進(jìn)行收曲，比較發(fā)現(xiàn)米曲霉A100-8在收曲時(shí)，各種酶活表現(xiàn)最佳。

醬油制曲；米曲霉A；米曲霉A100-8；米曲霉3.042；酶活

制曲直接影響醬油釀造的原料利用及品質(zhì)形成，這一過(guò)程由可分泌多種酶系的曲霉主導(dǎo)完成。 作為底物的植物性原料性質(zhì)決定了制曲過(guò)程多酶系配合的重要性。蛋白酶將原料中的蛋白質(zhì)分解為氨基酸、低分子肽、多肽和胨，這些是醬油中非揮發(fā)性滋味物質(zhì)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前體。淀粉酶與淀粉糖化酶負(fù)責(zé)原料中淀粉的分解，對(duì)醬油品質(zhì)有重大影響。如：糖化作用完全，醬油香氣濃郁、甜味適當(dāng)、體態(tài)濃厚、無(wú)鹽固形物含量高，品質(zhì)也較好[1]。纖維素酶使大豆細(xì)胞壁溶解，細(xì)胞膜膨脹軟化破壞[2]，內(nèi)溶物充分釋放，增加原料利用率。果膠酶可降低釀造體系粘度，利于色素溶出及淋油過(guò)程，增加醬油色澤與感官度，促進(jìn)多種香氣的形成。研究表明：鮮味物質(zhì)谷氨酸的累積量不僅與谷氨酰胺酶有關(guān)，還與亮氨酸氨肽酶有直接關(guān)系[3]。此外，米曲霉在大曲制備階段產(chǎn)生大量的高活力植酸酶與磷酸酶協(xié)同釋放曲料中的植酸結(jié)合磷，為發(fā)酵階段酵母生長(zhǎng)代謝提供所需磷酸鹽。

本研究通過(guò)3種米曲霉在不同制曲時(shí)間產(chǎn)生的酸性蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶、亮氨酸氨肽酶、谷氨酰胺酶、植酸酶8種酶活進(jìn)行了比較，并確定最佳的收曲時(shí)間及表現(xiàn)最優(yōu)的米曲霉，為后續(xù)的醬油發(fā)酵奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料及菌株

原料：麩皮、豆粕。

菌種：米曲霉A、米曲霉滬釀3.042、米曲霉A100-8為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制曲工藝

1.2.1.1 三角瓶種曲的制備

從保藏的米曲霉的米曲汁斜面上挑取3～4環(huán)孢子，無(wú)菌條件下接種到制備好的三角瓶種曲培養(yǎng)基中，充分混勻，堆積后放置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)約15 h左右，將堆積培養(yǎng)的曲料打散，即為第1次搖瓶，以此達(dá)到二次接菌的目的，并將溫度調(diào)至30 ℃，平鋪培養(yǎng)。

培養(yǎng)約22 h后，進(jìn)行第2次搖瓶，繼續(xù)平鋪培養(yǎng)。

培養(yǎng)約72 h后，自然風(fēng)干，裝入袋子中備用。

1.2.1.2 大曲的制備

取300 g大小均勻的黃豆，用自來(lái)水清洗3遍干凈后，加入2.5倍水，浸泡12～15 h，至大豆子葉吸水完全，發(fā)白，無(wú)發(fā)暗。

將潤(rùn)水后的大豆瀝干水分，用曲布包好裝入不銹鋼框內(nèi)，放入壓力滅菌鍋內(nèi)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

滅菌后的曲料取出后，及時(shí)用手(帶上已消毒的橡膠手套)將其打散，使其迅速降溫。

待曲料溫度降至40 ℃左右，按照黃豆∶面粉為6∶4(干重)的比例加入面粉，拌勻后混入原料重量0.3%的種曲。

將充分拌勻后的大曲放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行堆積培養(yǎng)，培養(yǎng)12～16 h，菌絲生長(zhǎng)、結(jié)塊正常、曲料品溫達(dá)到38 ℃時(shí)進(jìn)行第1次翻曲，確保溫度降至30 ℃左右。培養(yǎng)過(guò)程控制濕度95%以上。

第1次翻曲后繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)大約6～8 h左右，曲料品溫進(jìn)一步上升至38 ℃時(shí)，進(jìn)行第2次翻曲。

之后控制溫度在28 ℃進(jìn)一步培養(yǎng)至出曲。

1.2.2 大曲酶活力的測(cè)定

蛋白酶活力的測(cè)定根據(jù)SB/T 10317-1999[4]中的方法進(jìn)行測(cè)定。淀粉酶活力的測(cè)定根據(jù)Young J Yoo等的方法進(jìn)行測(cè)定[5]。糖化酶活力的測(cè)定根據(jù)Satheesh Kumar Gudi和孫淑琴等改良后的方法進(jìn)行測(cè)定[6，7]。纖維素酶活力的測(cè)定根據(jù)Anuradha等的方法進(jìn)行測(cè)定[8]。果膠酶活力的測(cè)定根據(jù)黨敏娜的方法進(jìn)行測(cè)定[9]。亮氨酸氨肽酶活力的測(cè)定根據(jù)李詩(shī)雯的方法進(jìn)行測(cè)定[10]。谷氨酰胺酶活力的測(cè)定根據(jù)袁振遠(yuǎn)等的康維皿法進(jìn)行測(cè)定[11]。植酸酶的測(cè)定根據(jù)彭益強(qiáng)的方法進(jìn)行測(cè)定[12]。

2 討論分析

2.1 蛋白酶活

曲霉具有的強(qiáng)大蛋白酶系是其最重要的特性。這些胞外酶將變性的蛋白質(zhì)進(jìn)行分解，使其從大分子水解為小分子物質(zhì)。這在釀造過(guò)程中對(duì)原料的降解起到了至關(guān)重要的作用。根據(jù)國(guó)標(biāo)的定義，在40 ℃下每1 min水解酪蛋白1 μg的酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。醬油發(fā)酵是在酸性條件下進(jìn)行的，所以本研究測(cè)定了3種曲霉制備大曲過(guò)程中不同時(shí)間的酸性蛋白酶酶活力變化情況，見(jiàn)圖1。

圖1 酸性蛋白酶活力的變化Fig.1 The change of acid protease activity

由圖1可知，在制曲24～36 h期間3株曲霉酸性蛋白酶活力均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，在36 h時(shí)，米曲霉A100-8酶活力已經(jīng)遠(yuǎn)高于其他2株菌，米曲霉A酶活力又高于米曲霉滬釀3.042酶活力，且保持這一優(yōu)勢(shì)到制曲結(jié)束。米曲霉滬釀3.042在制曲36 h后酶活力出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但在42 h后又有增加趨勢(shì)，應(yīng)選擇在酶活力較高的情況下進(jìn)行收曲，大致時(shí)間為40 h左右。此時(shí)米曲霉A100-8酶活力為1600 U/g左右；米曲霉A為1300 U/g左右；米曲霉滬釀3.042為660 U/g左右。

2.2 淀粉酶活

(1)支模前，應(yīng)根據(jù)構(gòu)件尺寸進(jìn)行模板設(shè)計(jì)，對(duì)模板支撐體系進(jìn)行設(shè)計(jì)與驗(yàn)算，保證模板具有足夠的強(qiáng)度和剛度。

淀粉酶在醬油釀造生產(chǎn)的過(guò)程中起到分解淀粉質(zhì)原料的作用。生成還原糖、糊精等成分，為微生物進(jìn)行酒精發(fā)酵、有機(jī)酸發(fā)酵提供底物，并增加醬油中固形物的含量。1 g干重大曲中的淀粉酶在40 ℃，5 min內(nèi)水解1 mg淀粉量定義為1個(gè)淀粉酶活力單位。

圖2 淀粉酶活力的變化Fig.2 The change of amylase activity

由圖2可知，在制曲24～36 h內(nèi)，米曲霉A和米曲霉滬釀3.042酶活力均呈緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，而米曲霉A100-8酶活力呈先升高后降低的趨勢(shì)。在制曲36～42 h內(nèi)，3株曲霉的酶活力均大幅增加。40 h后米曲霉A100-8酶活力逐漸下降，米曲霉滬釀3.042酶活力也增加緩慢。因此，將收曲時(shí)間定為42 h左右較為恰當(dāng)。此時(shí)米曲霉A100-8酶活力最高，為1115.13 U/g；米曲霉滬釀3.042次之，為1034.48 U/g；米曲霉A最弱，為954.91 U/g。

2.3 糖化酶活

醬油生產(chǎn)中糖的代謝水平或產(chǎn)生能力更多地體現(xiàn)在促進(jìn)微生物的醇代謝、酯代謝等代謝活動(dòng)，進(jìn)而表現(xiàn)在產(chǎn)品的芳香性組分的變化上。糖化酶等活力的增加可以增加醬醪中的碳源，加強(qiáng)酵母的碳代謝強(qiáng)度，從而增加芳香物質(zhì)的產(chǎn)生，增加總酯的含量。在40 ℃，pH 4.6條件下，每1 h水解淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖作為1個(gè)酶活力單位。

圖3 糖化酶活力的變化Fig.3 The change of saccharifying enzyme

由圖3可知，在制曲24～48 h之間，3株菌的糖化酶酶活力呈逐漸上升的趨勢(shì)。并且大體上米曲霉滬釀3.042酶活力最高，米曲霉A100-8酶活力次之，米曲霉A酶活力最弱。在制曲48 h時(shí)3株曲霉酶活力均達(dá)到最高值。其中米曲霉滬釀3.042酶活力最高，為1935.5107 U/g；米曲霉A100-8次之，為1708.1099 U/g；米曲霉A最弱，為1565.7674 U/g。

2.4 纖維素酶活

纖維素酶作用于植物細(xì)胞外壁，使其分解，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)等內(nèi)溶物質(zhì)的溶解，進(jìn)而促進(jìn)其他酶的作用效果，提高原料利用率，改善醬油的品質(zhì)。纖維素酶活過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致氨基態(tài)氮水平低的情況，但纖維素酶活力過(guò)高不利于之后的淋油，也應(yīng)對(duì)此注意。纖維素、半纖維素水解后釋放大量的糖類(lèi)，包括葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖等，其中六碳糖易經(jīng)微生物酵解生成乙醇。酵母在無(wú)氧條件下，經(jīng)糖酵解途徑將葡萄糖分解產(chǎn)生丙酮酸，再在脫羧酶的作用下脫羧生成乙醛，在乙醇脫氫酶作用下將乙醛還原成乙醇，因此纖維素酶活力高還可以提高醇類(lèi)的生成量。纖維素水解羧基纖維素分子中β-1,4-葡萄糖苷鍵，釋放出的還原糖(以葡萄糖計(jì))與3,5-二硝基水楊酸(DNS)反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化，這種顏色的變化與釋放還原糖的量成正比，即與酶活性成正比。通過(guò)對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn))可以確定還原糖的含量，從而確定酶的活力單位。1 g干重大曲在40 ℃，pH 4.8條件下，1 h水解CMC產(chǎn)生相當(dāng)于1 mg葡萄糖的還原糖定義為1個(gè)纖維素酶活力單位。

圖4 纖維素酶活力的變化Fig.4 The change of cellulase activity

由圖4可知，在制曲24～36 h期間，3株曲霉酶活力均呈明顯上升趨勢(shì)。在制曲36 h后，米曲霉A酶活力出現(xiàn)下降，其他2株曲霉酶活力依然增加，但纖維素酶活力過(guò)高并不利于之后的淋油過(guò)程，當(dāng)其滿足需要量300 U/g曲即可，因此在40 h左右進(jìn)行收曲較為合適。此時(shí)米曲霉A100-8酶活力較高，為310 U/g左右；米曲霉A緊隨其后，為280 U/g左右；米曲霉滬釀3.042較弱，為240 U/g左右。3株曲霉此時(shí)的纖維素酶活可以保證既能充分水解植物原料中的纖維素，提高原料的利用率，又能保證之后的淋油過(guò)程順利進(jìn)行。

果膠酶是分解植物主要成分——果膠質(zhì)的酶類(lèi)，其起到改善醬醪粘度和過(guò)濾性、增強(qiáng)醬油體態(tài)的作用，但在曲霉分泌該酶的過(guò)程中，其表達(dá)水平逐漸降低，有報(bào)道認(rèn)為該酶產(chǎn)生過(guò)量不利于后期淋油。果膠酶對(duì)果膠質(zhì)有酯解、裂解、水解的作用，能夠作用于α-1,4-糖苷鍵，水解得到D-半乳糖醛酸和寡聚半乳糖醛酸等物質(zhì)，它們都含有一定量的醛基，有還原性，與DNS共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的含量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度成正比。在pH 4.4，45 ℃水浴條件下，每1 min水解果膠質(zhì)產(chǎn)生1 μmol半乳糖醛酸所需的酶量為1個(gè)果膠酶活力單位。

圖5 果膠酶活力的變化Fig.5 The change of pectinase activity

由圖5可知，在制曲24～30 h內(nèi)，米曲霉滬釀3.042與米曲霉A100-8 2株曲霉果膠酶活力呈上升趨勢(shì)，米曲霉A呈降低趨勢(shì)。30～36 h內(nèi)，3株曲霉酶活力均呈下降趨勢(shì)，但36 h后3株曲霉酶活力逐漸上升，除米曲霉A100-8在制曲42 h后酶活力出現(xiàn)小幅下降的情況。由于果膠酶活力過(guò)高同樣不利于之后的淋油，當(dāng)其滿足需要量250 U/g曲即可。因此在制曲42 h左右進(jìn)行收曲，此時(shí)米曲霉滬釀3.042酶活力最高，為252.5 U/g；米曲霉A100-8次之，為241.8 U/g；米曲霉A最弱，為233.8 U/g。該收曲時(shí)間可保證酶的作用充分發(fā)揮。

2.6 氨肽酶活

氨肽酶是外肽酶中的一個(gè)類(lèi)別，它從肽鏈氨基末端逐個(gè)催化水解相應(yīng)的疏水性氨基酸，其中有些不但能水解多肽，甚至具有催化水解完整蛋白質(zhì)分子的能力。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)大分子被酶解時(shí)，肽鏈中的疏水性氨基酸處在肽鏈末端暴露在外面，接觸味蕾后產(chǎn)生苦味。在醬油釀造的過(guò)程中氨肽酶可以大幅提高蛋白質(zhì)利用率，節(jié)省成本，還可提高氨基酸生成率，進(jìn)而提高產(chǎn)品的鮮、香味，并為醬油著色做出貢獻(xiàn)。

圖6 亮氨酸氨肽酶活力的變化Fig.6 The change of leucine aminopeptidase activity

由圖6可知，在制曲24～48 h間3株曲霉酶活力均在逐漸升高，成熟大曲對(duì)亮氨酸氨肽酶的需要量為30 U/g曲，在制曲36 h時(shí)，可以達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)，此時(shí)米曲霉滬釀3.042酶活力最高，為36.1658 U/g；米曲霉A100-8次之，為30.3304 U/g；米曲霉A較弱，為29.1423 U/g。

2.7 谷氨酰胺酶活

谷氨酰胺酶是影響發(fā)酵食品風(fēng)味的一種關(guān)鍵酶，它能夠分解醬油中以谷氨酰胺形式存在的谷氨酸，生成鮮味的谷氨酸和氨。米曲霉和醬油曲霉所制成的醬油曲的浸出液，谷氨酰胺酶的作用最適pH為6.5～7.5，最適溫度為40～45 ℃。在制醪發(fā)酵的初期，借助曲霉蛋白酶的作用，原料中的谷氨酸及谷氨酰胺溶出。谷氨酰胺性質(zhì)不穩(wěn)定，高溫或酸性條件(pH 4.5)下易變?yōu)闊o(wú)味的焦性谷氨酸，在酶的作用下才能變?yōu)楣劝彼?。因此必須選擇具有高活力的肽酶，特別是亮氨酸氨肽酶及高活性谷氨酰胺酶的醬油曲進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵。

圖7 谷氨酰胺酶活力的變化Fig.7 The change of glutaminase activity

由圖7可知，3株曲霉在制曲過(guò)程中谷氨酰胺酶活力在24～42 h均呈上升趨勢(shì)，此時(shí)曲的溫度與pH均適宜積累谷氨酰胺酶。在制曲42 h之后酶活力均開(kāi)始大幅下降，此時(shí)孢子成熟多，消耗曲料碳水化合物等原料，曲料pH略有下降，曲料水分活度下降，呼吸產(chǎn)熱。因此在制曲42 h時(shí)收曲較為合適，此時(shí)米曲霉A100-8酶活力較高，為3.427 U/g；米曲霉滬釀3.042次之，為3.182 U/g；米曲霉A稍弱，為2.938 U/g?；旧夏軌蜻_(dá)到需要量3.3 U/g曲的要求。

2.8 植酸酶活

植酸可以與蛋白質(zhì)絡(luò)合影響蛋白質(zhì)的利用，植酸酶可以將植物原料中的植酸及其鹽分解為肌醇和磷酸，增加了可利用磷的含量，并降低植酸對(duì)礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)合力，從而增加礦物元素的營(yíng)養(yǎng)效價(jià)和蛋白質(zhì)利用率。此外還能夠在醬油發(fā)酵過(guò)程中分解呈味性的核酸類(lèi)物質(zhì)，改善醬油的滋味。

圖8 植酸酶活力的變化Fig.8 The change of phytase activity

由圖8可知，3株曲霉在制曲24～36 h植酸酶活力上升迅速，36 h后開(kāi)始緩慢下降。最終3株曲霉所制備的大曲酶活力差別不大，基本穩(wěn)定在9 U/g曲。在制曲42 h時(shí)，米曲霉滬釀3.042酶活力最高，為9.522 U/g；米曲霉A次之，為9.441 U/g；米曲霉A100-8最弱，為8.951 U/g。

3 結(jié)論

制曲是醬油發(fā)酵至關(guān)重要的步驟，直接影響蛋白利用率等經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。因此本文首先研究了米曲霉A、米曲霉滬釀3.042、米曲霉A100-8在制曲24，30，36，42，48 h時(shí)8種酶活力情況，包括酸性蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶、亮氨酸氨肽酶、谷氨酰胺酶、植酸酶。研究發(fā)現(xiàn)：3株曲霉酸性蛋白酶活力在制曲40 h左右可達(dá)到最佳值，此時(shí)米曲霉A100-8酶活力最高，為1600 U/g。另外，3株曲霉的淀粉酶、谷氨酰胺酶的酶活力在制曲42 h也達(dá)到最大值，且米曲霉A100-8活力最高。纖維素酶活力在制曲40 h時(shí)可達(dá)到最佳酶活力值，且米曲霉A100-8活力最高。亮氨酸氨肽酶活力在制曲36 h即可達(dá)到需要量，米曲霉滬釀3.042活力最高。果膠酶和植酸酶活力在制曲42 h可達(dá)到最佳酶活力值，米曲霉滬釀3.042活力最高。糖化酶活力在制曲48 h時(shí)達(dá)到最大值，且米曲霉滬釀3.042活力最高。綜合上述8種酶的活力情況，確定收曲時(shí)間為42 h，此時(shí)米曲霉A100-8大多數(shù)酶酶活力相對(duì)優(yōu)勢(shì)較明顯。

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ComparisonoftheEnzymeActivityofAspergillusoryzaeFermentedbyThreeKindsofSoySauce

TAN Yong-shui1, GUO Lin2, LIU Xin-li1*, HOU Li-hua2

(1.College of Biological Engineering, Qilu University of Technology, Ji'nan 250353, China;2.New Village Development Research Institute, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Koji making is very important for soy sauce brewing, which affects the quality of soy sauce. In this paper, the enzyme activities ofAspergillusoryzaeA,Aspergillusoryzae3.042,AspergillusoryzaeA100-8 at different koji-making time of soy sauce fermentation are studied. They are acid protease, amylase, saccharifying enzyme, cellulase, pectinase, leucine aminopeptidase, glutamine enzyme and phytase. Combined with the change of enzyme activity,hydrolysis degree and later brewing pour oil, 42 h is determined for ripe koji of three kinds ofAspergillusoryzae. It is found that the enzyme activity ofAspergillusoryzaeA100-8 is the best when the koji is collected.

koji making of soy sauce；AspergillusoryzaeA；AspergillusoryzaeA100-8；Aspergillusoryzae3.042；enzyme activity

TS264.21

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.005

1000-9973(2017)11-0024-05

2017-05-15 *通訊作者

大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201610431015)

譚永水(1990-)，男，山東濰坊人，碩士，研究方向：微生物工程。