厲志偉，王盛莉

(湖南省玉峰食品實(shí)業(yè)有限公司，長(zhǎng)沙 410019)

高效液相色譜法測(cè)定辣椒中辣椒素、二氫辣椒素

厲志偉，王盛莉*

(湖南省玉峰食品實(shí)業(yè)有限公司，長(zhǎng)沙 410019)

采用超聲波輔助甲醇提取辣椒中的辣椒素、二氫辣椒素，高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。色譜條件：色譜柱為Symmetry○RC18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相甲醇∶水為70∶30(V/V)，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果表明：辣椒素含量0.02～100 mg/L，二氫辣椒素含量0.02～50 mg/L，峰面積與待測(cè)物濃度呈良好的線性關(guān)系。辣椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是Y=5.33e+003X+9.42e+002，相關(guān)系數(shù)為0.9999。二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是Y=5.96e+003X+4.71e+002，相關(guān)系數(shù)為0.9999?；厥章蕿?2.75%～105.49%。此方法樣品前處理較國(guó)標(biāo)方法更簡(jiǎn)單、省時(shí)，同時(shí)顯著降低了溶劑成本，縮短了樣品分析時(shí)間，更利于批量操作，具有較大優(yōu)勢(shì)。此方法可以用于HPLC 快速測(cè)定辣椒中辣椒素、二氫辣椒素。

高效液相色譜；測(cè)定；辣椒；辣椒素；二氫辣椒素

辣椒作為一種香辛料和調(diào)味品，在麻辣類休閑食品中起著至關(guān)重要的作用，可以保證產(chǎn)品口感的穩(wěn)定，控制產(chǎn)品的辣感。辣椒中所含有的辛辣成分主要為辣椒素類物質(zhì)，其中辣椒素(Capsaicin)和二氫辣椒素(Dihydrocapsaicin)約占辣椒素總量的90%[1]，是辣椒中的主要活性成分，也是辣椒中辣味的主要來(lái)源，提供了約90%的辣感和熱感，其含量的高低直接影響到辣椒及辣椒制品的辣度。因此，有必要對(duì)辣椒中的辣椒素和二氫辣椒素含量進(jìn)行測(cè)定，以便為食品生產(chǎn)過(guò)程中辣椒配料用量的調(diào)整提供依據(jù)。

目前，辣椒素和二氫辣椒素測(cè)定的方法主要有高效液相色譜(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)、固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用(SPME-GC-MS)法等[2,3]，其中高效液相色譜法的應(yīng)用最為廣泛。國(guó)標(biāo)[4]中所采用的方法也是高效液相色譜法。

國(guó)標(biāo)及相關(guān)文獻(xiàn)[5-11]記錄中，樣品前處理均采用甲醇+四氫呋喃(50+50)混合溶液作提取溶劑，其中四氫呋喃毒性較大[12]，對(duì)操作人員有一定的健康損害，且溶劑成本高；提取操作過(guò)程復(fù)雜，使用超聲波反復(fù)提取多次，提取過(guò)程中多次使用濾紙，整個(gè)提取操作過(guò)程步驟繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)；另外，樣品分析時(shí)間也較長(zhǎng)，不利于大批量的檢測(cè)操作。本研究通過(guò)對(duì)辣椒中的辣椒素、二氫辣椒素的提取方法和色譜條件的選擇和優(yōu)化，采用超聲波輔助甲醇提取辣椒中的辣椒素、二氫辣椒素，確定辣椒中的辣椒素、二氫辣椒素的高效液相色譜紫外檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的準(zhǔn)確性、精密度、回收率進(jìn)行了研究驗(yàn)證。此方法樣品前處理較簡(jiǎn)單，樣品分析時(shí)間較短，色譜分離良好，定性、定量準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

樣品:新一代辣椒、魔鬼椒、廣西辣椒；超純水；甲醇(HPLC)；辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品(純度97.5%)；二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.5%)：中國(guó)食品藥品檢定研究院。

Waters e2695高效液相色譜儀：配在線真空脫氣系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，Waters 2489UV/Vis檢測(cè)器，Empower色譜工作站 美國(guó)沃特世公司；ME204E電子分析天平(感量0.0001 g) 梅特勒-托利多公司；超聲波清洗器(功率100 W) 寧波新芝生物科技股份有限公司；電動(dòng)粉碎機(jī)(粒度≥40目)；離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000 r/min；烘箱；50 mL具塞塑料離心管；0.22 μm有機(jī)微孔濾膜；0.45 μm水系微孔濾膜。

1.3 溶液制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

分別精確稱取辣椒素、二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品0.0103，0.0102 g(精確到0.0001 g)于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配成含量均為1000 mg/L 的辣椒素、二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取辣椒素和二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5,2.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配成濃度分別為500,250 mg/L的辣椒素和二氫辣椒素混合儲(chǔ)備液。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

YU Long-juan, ZHANG Ming-fei, WANG Qin, SU Dong-ying, ZHU Xuan

按表1配成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

表1 辣椒素、二氫辣椒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度Table 1 Concentration of standard working solution of capsaicin and dihydrocapsaicin mg/L

1.3.2 樣品溶液

將辣椒用烘箱在50 ℃下烘干至恒重[13]，用電動(dòng)粉碎機(jī)粉碎，均過(guò)40目篩，稱取2.5 g樣品(精確到0.0001 g)于50 mL離心管中，加入25 mL甲醇，超聲提取30 min，離心機(jī)4000 r/min離心5 min[14]，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中。然后將濾渣重新加甲醇20 mL，超聲提取20 min，4000 r/min離心5 min。將2次收集的上清液合并, 用甲醇定容至50 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行色譜分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：Symmetry○RC18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：甲醇∶超純水為70∶30；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品預(yù)處理?xiàng)l件的選擇

2.1.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)國(guó)標(biāo)及其他參考文獻(xiàn)[15-18]，分別選用甲醇、甲醇+四氫呋喃(50+50)混合溶液和80%乙醇水溶液作提取溶劑，結(jié)果表明用甲醇作提取溶劑提取效果最好，見圖1。

圖1 不同溶劑對(duì)辣椒素和二氫辣椒素提取結(jié)果的影響Fig.1 Extraction effects of different solvents on capsaicin and dihydrocapsaicin

注：1為甲醇+四氫呋喃(50+50)混合溶液；2為甲醇；3為80%無(wú)水乙醇。

2.1.2 提取方法的選擇

國(guó)標(biāo)中推薦的樣品處理方法是用甲醇+四氫呋喃(50+50)混合溶液作提取溶劑，將樣品用保鮮膜封口，用針扎幾個(gè)小孔，然后在60 ℃水浴條件下，超聲波清洗器提取30 min，用濾紙過(guò)濾，收集濾液，然后將濾渣連同濾紙重新用甲醇+四氫呋喃(50+50)混合溶液25 mL，使用超聲波清洗器提取10 min，重復(fù)2次。將3次過(guò)濾收集的濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在70 ℃溫度下濃縮至10～20 mL，再用甲醇+四氫呋喃(50+50)混合溶液定容后進(jìn)行分析。此預(yù)處理操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于批量樣品測(cè)試試驗(yàn)，因此，有必要對(duì)樣品預(yù)處理方法進(jìn)行優(yōu)化。本研究經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：采用常溫水浴超聲輔助甲醇提取30 min，然后4000 r/min離心5 min，收集上清液，定容，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法一致，見表2。

表2 不同提取方法對(duì)分析結(jié)果的影響Table 2 The effects of different extraction methods on analysis results g/kg

2.1.3 提取溫度的確定

對(duì)超聲提取法提取溫度做進(jìn)一步的確定，結(jié)果表明常溫超聲提取和60 ℃超聲提取的檢測(cè)結(jié)果之間差異不顯著，故選擇常溫超聲提取，見表3。

表3 不同提取溫度對(duì)辣椒素和二氫辣椒素分析結(jié)果的影響Table 3 The effects of different extraction temperatures on capsaicin and dihydrocapsaicin analysis results g/kg

2.1.4 提取次數(shù)的確定

對(duì)超聲提取法提取次數(shù)做進(jìn)一步的確定，結(jié)果表明用甲醇提取2次，辣椒素和二氫辣椒素幾乎提取完全，故選擇提取2次，見表4。

表4 不同提取次數(shù)對(duì)辣椒素和二氫辣椒素分析結(jié)果的影響Table 4 The effects of different extraction times on capsaicin and dihydrocapsaicin analysis results g/kg

2.2 流動(dòng)相條件的選擇

設(shè)置流動(dòng)相流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，選擇不同比例的甲醇∶超純水(65∶35～80∶20)作為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：提高甲醇比例可以縮短辣椒素及二氫辣椒素的出峰時(shí)間，降低甲醇比例有利于分離辣椒素及二氫辣椒素，但降低甲醇比例，色譜峰展寬，響應(yīng)值降低,保留時(shí)間明顯增加。當(dāng)甲醇∶超純水比為70∶30時(shí)，出峰時(shí)間合適(較國(guó)標(biāo)方法節(jié)約8 min)，分離效果較好。綜合分離效果、溶劑成本、時(shí)間成本，最終選擇甲醇∶超純水為70∶30作為流動(dòng)相。此條件下的標(biāo)樣及試樣色譜圖見圖2。

圖2辣椒素和二氫辣椒素的色譜圖
Fig.2 Chromatograms of capsaicin and dihydrocapsaicin

2.3 線性回歸方程、線性范圍及檢出限

按1.3.1.2配制工作標(biāo)液。按1.4條件測(cè)試，制作校準(zhǔn)曲線。峰面積與待測(cè)物濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。辣椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是Y=5.33e+003X+9.42e+002，相關(guān)系數(shù)為0.9999。二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是Y=5.96e+003X+4.71e+002，相關(guān)系數(shù)為0.9999。

將空白測(cè)試產(chǎn)生的噪聲的3倍作為儀器的檢出限，辣椒素的儀器檢出限約為0.02 mg/L，二氫辣椒素的儀器檢出限約為0.005 mg/L。對(duì)逐步稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行重復(fù)性分析，當(dāng)辣椒素和二氫辣椒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度均為0.02 mg/L時(shí)，辣椒素RSD=4.13%(n=7)，二氫辣椒素RSD=4.36%(n=7)，符合要求。故辣椒素、二氫辣椒素測(cè)試儀器檢出限均為0.02 mg/L。

2.4 精密度試驗(yàn)

取自配的濃度分別為1.0，0.5 mg/L的辣椒素和二氫辣椒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)樣10 μL，重復(fù)測(cè)試7次，進(jìn)行精密度試驗(yàn)。測(cè)定辣椒素RSD=2.01%(n=7)，二氫辣椒素 RSD=1.25%(n=7)。表明測(cè)試儀器在該色譜條件下有良好的精密度。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次廣西辣椒，按1.3.2條件處理，制備7個(gè)平行樣品溶液進(jìn)行測(cè)定。辣椒素 RSD=1.91%(n=7)，二氫辣椒素RSD=2.10%(n=7)。表明該測(cè)試方法重復(fù)性良好。

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

選用同一批次廣西辣椒分別進(jìn)行中水平濃度監(jiān)控加標(biāo)和基體加標(biāo)試驗(yàn)，按上述方法測(cè)定，回收率為82.75%～105.49%。辣椒素和二氫辣椒素的平均回收率均在允許范圍內(nèi)(80%～110%)，表明測(cè)定方法的準(zhǔn)確度達(dá)到要求，見表5。

表5 辣椒素、二氫辣椒素的回收率測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of recovery rates of capsaicin and dihydrocapsaicin

注：監(jiān)控加標(biāo)-樣品稱取后，加入適量甲醇，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液再超聲萃?。换w加標(biāo)-樣品溶液合并后，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液再定容。

3 結(jié)論

對(duì)辣椒中辣椒素、二氫辣椒素的提取，采用超聲提取法，考察了不同提取溶劑、提取溫度及提取次數(shù)的影響，建立了用甲醇作提取溶劑，常溫條件下超聲波提取(超聲功率100 W)辣椒素、二氫辣椒素，采用高效液相色譜法測(cè)定辣椒中辣椒素、二氫辣椒素的方法。并與國(guó)標(biāo)方法做了比較研究，試驗(yàn)結(jié)果一致。此方法具有簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確度好、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)。此方法樣品前處理使用甲醇常溫超聲提取2次，使用溶劑體積為50 mL，較國(guó)標(biāo)方法使用溶劑體積為100 mL的(甲醇+四氫呋喃為50∶50)混合溶液，節(jié)約了70%(四氫呋喃價(jià)格昂貴)的溶劑成本。在此方法色譜條件下，辣椒素的保留時(shí)間約為8.5 min，二氫辣椒素的保留時(shí)間約為11.6 min，與國(guó)標(biāo)方法相比，單個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間大約能縮短8 min，在大批量的樣品分析中能節(jié)省大量的時(shí)間和成本，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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DeterminationofCapsaicinandDihydrocapsaicininCapsicumbyHighPerformanceLiquidChromatography

LI Zhi-wei, WANG Sheng-li*

(Hunan Yufeng Food Industry Co., Ltd., Changsha 410019, China)

Capsaicin and dihydrocapsaicin are extracted by ultrasonic with methanol as solvent, and then are detected by high performance liquid chromatography (HPLC). The conditions of HPLC are taken as follows: the chromatographic column is Symmetry○RC18(5 μm, 4.6 mm×250 mm), and the mobile phase methanol∶ water is 70∶30 (V/V), the flow rate is 1.0 mL/min, and the ultraviolet detector wavelength is 280 nm, the column temperature is 35 ℃, and the sample injection volume is 10 μL.The results show that the content of capsaicin is in the range of 0.02～100 mg/L, the content of dihydrocapsaicin is in the range of 0.02～50 mg/L, it has a good linear relationship between peak area and concentration of the analyte. The regression equation of capsaicin standard curve is Y=5.33e+003X+9.42e+002, and the correlation coefficient is 0.9999. The regression equation of dihydrocapsaicin standard curve is Y=5.96e+003X+4.71e+002, and the correlative coefficient is 0.9999. The recovery rates are in the range of 82.75%～105.49%.The pretreatment of this method is simpler and less time consuming than the national standard method. It also reduces the solvent cost and shortens the sample analysis time and it is more convenient for batch operation. The method can be used for rapid determination of capsaicin and dihydrocapsaicin in capsicum by HPLC.

HPLC；determination；capsicum；capsaicin；dihydrocapsaicin

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.027

1000-9973(2017)11-0123-04

2017-06-17 *通訊作者

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016TP2028)

王盛莉(1978-)，女，碩士，研究方向：食品科學(xué)。