連 菲，陳靜娜，楊永泉，張瑩瑩，李 曉，張 蓉，劉娟子，黃秀娜，張志英，孫朝暉，李林海

1730例女性健康體檢者高危型和低危型人乳頭瘤病毒感染情況調(diào)查

連 菲，陳靜娜，楊永泉，張瑩瑩，李 曉，張 蓉，劉娟子，黃秀娜，張志英，孫朝暉，李林海

目的通過對(duì)1730例健康體檢女性的人乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染情況進(jìn)行分析，推測(cè)廣州地區(qū)女性HPV感染狀況。方法采用HPV核酸分型流式熒光雜交法，對(duì)來我院體檢的1730例健康女性宮頸分泌物進(jìn)行17種高危型HPV和10種低危型HPV核酸檢測(cè)，并對(duì)不同年齡組的感染情況進(jìn)行比較，總結(jié)該人群不同HPV型別及亞型感染率。結(jié)果高危型HPV感染率10.17%（176/1730），低危型HPV感染率為5.90% （102/1730）。各年齡段高危型HPV感染率最高的為＞60歲年齡段，其次為＜30歲年齡段。HPV感染模式最常見為高危型單一，最少見的感染模式為低危型多重合并高危型單一。高危型HPV感染率前8位依次為HPV53型、58型、52型、39型、16型、18型、51型、56型，低危型HPV感染率前4位依次為HPV43型、61型、81型、42型。結(jié)論 廣州地區(qū)女性HPV感染率較高，并且以高危型HPV感染為主。定期進(jìn)行HPV篩查，有利于預(yù)防和早期發(fā)現(xiàn)宮頸病變。

人乳頭瘤病毒；高危型；低危型；廣州

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV）是雙鏈環(huán)狀DNA病毒，具有嗜皮膚性和嗜黏膜性[1]?，F(xiàn)已報(bào)道的HPV亞型約有200種，其中40余種HPV亞型與女性的生殖道感染相關(guān)[2-3]。HPV亞型可分為高危型和低危型，15種高危型HPV（16、18、31、 33、 35、39、 45、51、52、56、58、59、68、73、82型）和3種可能高危型HPV（26、53、 66型）的持續(xù)感染是引起子宮上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的危險(xiǎn)因素。12種低危型HPV（6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、CP6108型）與尖銳濕疣、尋常疣及黏膜的乳頭狀瘤等良性病變密切相關(guān)[4-5]。本文對(duì)來我院體檢的1730例健康女性宮頸分泌物中的17種高危型HPV亞型和10種低危型HPV亞型進(jìn)行分析，以推測(cè)廣州地區(qū)女性HPV感染情況。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 研究對(duì)象為2016年4月1日—2017年3月31日在解放軍廣州總醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的女性，共1730例，年齡17～77歲，平均為（42.62±9.81）歲，均進(jìn)行宮頸分泌物HPV分型檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 擴(kuò)陰器充分暴露宮頸口，棉拭子擦去宮頸口分泌物，宮頸刷伸入宮頸口，緊貼宮頸口順時(shí)針輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)4～5周，抽出宮頸刷，置入裝有細(xì)胞保存液的洗脫管，管口處沿刷柄折痕折斷宮頸刷，宮頸刷頭留在洗脫管中，旋緊管蓋，做好樣本標(biāo)識(shí)，并保持洗脫管直立放置。

1.2.2 試劑與儀器 核酸提取試劑盒和HPV 核酸分型檢測(cè)試劑盒（流式熒光雜交法）均購自上海透景生命科技股份有限公司，PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司），多功能流式點(diǎn)陣儀（美國(guó)luminex200）。

1.2.3 檢測(cè)原理 通過引物多重PCR擴(kuò)增，流式熒光雜交分型檢測(cè)的方法，同時(shí)檢測(cè)27種HPV DNA。試劑盒設(shè)置了2類探針，28顆分類微球。其中，與HPV DNA雜交的探針包被在27個(gè)分類微球上，對(duì)應(yīng)型別特異性探針的信號(hào)為陽性將被判定為該型別HPV陽性。質(zhì)控微球是與人微球蛋白基因雜交的探針，它的結(jié)果提示取樣、抽提、PCR擴(kuò)增和雜交整個(gè)過程是否符合要求。檢測(cè)時(shí)，首先PCR擴(kuò)增待檢測(cè)樣品DNA，得到的PCR產(chǎn)物和微球上交聯(lián)的探針根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理雜交，加入熒光標(biāo)記物，最后在多功能流式點(diǎn)陣儀上檢測(cè)熒光信號(hào)。如果PCR產(chǎn)物和探針完全配對(duì)，則微球上相應(yīng)探針捕獲到標(biāo)有生物素的PCR產(chǎn)物，加入標(biāo)記了鏈霉親和素的藻紅蛋白后，形成微球-探針-PCR產(chǎn)物-生物素-鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物，在多功能流式點(diǎn)陣儀上即可檢測(cè)到分類微球的熒光信號(hào)。如果PCR產(chǎn)物與探針不配對(duì)，則分類微球的熒光信號(hào)為背景信號(hào)，所得到生物數(shù)據(jù)經(jīng)分析后可直接判斷結(jié)果。

1.2.4 HPV分型檢測(cè)

1.2.4.1 樣本及對(duì)照品反應(yīng)模板制備 取200 μl的宮頸洗脫液加到1.5 ml的離心管中，14 000 rpm 離心3 min。吸棄上清，每管中加入200 μl 的核酸提取試劑。振蕩混勻，于100 ℃金屬浴中保溫15 min后，14 000 rpm離心5 min。上清用于擴(kuò)增反應(yīng)。

1.2.4.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)混合液每份為10 μl預(yù)混液，5 μl引物，0.8 μl擴(kuò)增酶。取 5 μl的樣品加入到PCR反應(yīng)液中，蓋緊蓋子后以2000 rpm的轉(zhuǎn)速離心10 s，使反應(yīng)液集中在PCR反應(yīng)管的底部。將PCR反應(yīng)管放入PCR儀，按照下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。并按照2個(gè)退火溫度的熱循環(huán)條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，5 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min，1 個(gè)循環(huán)。

1.2.4.3 雜交檢測(cè) 微球雜交液試劑瓶倒置于漩渦儀上振蕩30 s，然后再正立振蕩30 s，使微球充分混懸在溶液中，并在每一個(gè)雜交孔中加入22 μl。每個(gè)樣本吸取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 μl，依次加入到相應(yīng)的雜交孔中，并抽吸幾次加以混勻。剪取相應(yīng)大小的透明封口膜，將微孔板覆蓋封口。將雜交板置于金屬恒溫浴，把儀器的蓋子壓緊已經(jīng)封口的雜交板，以防在高溫變性和雜交時(shí)液體蒸發(fā)。變性和雜交過程運(yùn)行程序?yàn)?5 ℃ 5 min 變性，48 ℃ 30 min雜交，48 ℃15 min孵育；將透明封口膜重新粘好，繼續(xù)在48 ℃下孵育15 min。將微孔雜交板快速轉(zhuǎn)移至預(yù)熱好的多功能流式點(diǎn)陣儀上進(jìn)行檢測(cè)和分析報(bào)告。

1.2.4.4 結(jié)果判定 如果陽性內(nèi)對(duì)照微球蛋白的信號(hào)大于150，即代表整個(gè)實(shí)驗(yàn)成功。如果不符合前述條件，代表實(shí)驗(yàn)失敗。如果有任何HPV型別特異性探針的信號(hào)大于150，即判斷為該探針對(duì)應(yīng)的型陽性。如果不符合前述條件的，即判斷為陰性。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。年齡呈正態(tài)分布，用x±s表示。各年齡組HPV感染率比較用R×Cχ2檢驗(yàn)。P＜0.050.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 總體感染情況 1730例女性中，HPV陽性者278例，陽性率為16.07%，其中高危型HPV的陽性率為10.17%（176/1730），低危型HPV的陽性率為5.90%（102/1730）。

2.2 各年齡組HPV陽性率 將1730例健康體檢女性按年齡段分為5個(gè)年齡組，40～49年齡組陽性率最低，為13.90%，60～77年齡組HPV 陽性率最高，為21.43%，但各年齡組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各年齡組HPV陽性率Table 1 HPV infection rate in different age groups

2.3 各年齡組HPV感染模式構(gòu)成比 各年齡組的HPV感染模式有7種，分別為低危型單一、低危型多重、高危型單一、高危型多重、低危型單一合并高危型單一、低危型多重合并高危型單一、低危型單一合并高危型多重。各年齡組常見的感染模式為高危型單一模式（56.47%）和低危型單一模式（24.82%），最少見的感染模式為低危型多重合并高危型單一模式。高危型單一模式主要分布在30～39年齡組，低危型單一模式主要分布在40～49年齡組。見表2。

表2 各年齡組HPV感染模式構(gòu)成比 [例（%）]Table 2 Constituent ratio of HPV infection pattern in different age groups [cases(%)]

2.4 HPV各亞型陽性率 共檢出16種高危型HPV和9種低危型HPV，未檢出高危型HPV26和低危型HPV40。17種高危型陽性率從高到低依次為 HPV53（2.02%），HPV58（1.91%），HPV52（1.73%），HPV39（1.27%），HPV16（1.21%），HPV18（1.04%），HPV51（0.69%），HPV56（0.64%），HPV59（0.64%），HPV66（0.64%），HPV33（0.52%），HPV45（0.35%），HPV31（0.23%），HPV35（0.23%），HPV68（0.23%），HPV82（0.06%），HPV26（0）。10種低危型HPV陽性率從高到低依次為HPV43（2.20%），HPV61（0.92%），HPV81（0.92%），HPV42（0.69%），HPV55（0.69%），HPV6（0.35%），HPV44（0.29%），HPV11 （0.17%），HPV83（0.17%），HPV40（0）。見圖1。

圖1 HPV各亞型陽性率A.高危型；B.低危型Figure 1 HPV positive rate in different subtypes

3 討 論

本研究通過對(duì)我院1730份健康體檢女性宮頸分泌物中17種高危型HPV亞型和10種低危型HPV亞型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示低危型HPV的陽性率為5.90%，高危型的陽性率為10.17%，以高危型感染為主。Zeng等[6]報(bào)道廣東地區(qū)低危型HPV的陽性率為9.12%，高危型HPV的陽性率為27.01%。Tang等[7]報(bào)道重慶地區(qū)低危型HPV陽性率為2.90%，高危型HPV陽性率為30.90%。本研究與上述2個(gè)報(bào)道都是采用流式熒光雜交法進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)，HPV感染率的差異可能是研究的人群和地區(qū)的差異導(dǎo)致的。

各年齡組的HPV感染率經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從陽性率看，HPV的2個(gè)感染高峰出現(xiàn)在＜30歲年齡組和＞60歲年齡組，陽性率分別為20.38%和21.43%。30～60歲之間女性HPV感染率大約為16%。60歲以上女性HPV高感染率的原因可能是隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)針對(duì)HPV的特異性免疫能力下降以及絕經(jīng)后激素水平的下降，最終導(dǎo)致潛伏在體內(nèi)的HPV重新活化[7]。

本研究中各年齡層的HPV感染模式主要是單一高危型HPV感染和單一低危型HPV感染，多重高危型HPV的僅占很少一部分。Spinillo等[5]報(bào)道單一高危型HPV感染、單一高危型合并低危型HPV感染、多重低危型HPV感染不增加宮頸上皮不典型增生以及宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。另外，多重高危型HPV感染與中度和重度的宮頸上皮不典型增生以及宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。

De等[4]報(bào)道全球38個(gè)地區(qū)宮頸癌患者最常見的8種HPV型別依次是HPV16型、18型、31型、33型、35型、45型、52型、58型。Mu?oz等[2]報(bào)道全球9個(gè)地區(qū)最常見型別依次是HPV16型、18型、45型、31型、33型、52型、58型、35型。Zeng等[6]報(bào)道中國(guó)最常見的型別依次是HPV52型、16型、58型、56型、39型、18型、59型、68型。Zhang等[11]報(bào)道上海最常見的型別依次是HPV16型、58型、52型、51型、68型、18型、56型、33型。Xu等[12]報(bào)道臺(tái)州最常見的型別依次是HPV52型、16型、58型、39型、18型、56型、51型、33型。本研究中最常見的8種高危型HPV依次是HPV53型、58型、52型、39型、16型、18型、51型、56型。目前上市的HPV疫苗有3種，分別是二價(jià)疫苗（HPV16/18），四價(jià)疫苗（HPV6/11/16/18），九價(jià)疫苗（HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58）[13-14]。由于不同地區(qū)的高危型HPV亞型感染率存在差異，因此開發(fā)新的多價(jià)疫苗或通用疫苗才能夠更好的預(yù)防HPV感染。大量的研究表明注射HPV疫苗可以降低由HPV持續(xù)感染引起的子宮上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的發(fā)病率[15-18]。

綜上，本研究分析了1730例健康體檢女性17種高危型和10種低危型HPV的感染情況，為本地區(qū)的HPV的診斷和防治提供了一定的參考依據(jù)。廣州地區(qū)女性HPV感染率較高，并且以高危型HPV感染為主，定期進(jìn)行HPV篩查，有利于預(yù)防和早期發(fā)現(xiàn)宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌。

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Analysis of high-risk and low-risk human papillomavirus infection among 1730 women receiving healthy examination

L
I
AN Fei, CHEN Jing-na, YANG Yong-quan, ZHANG Ying-ying, LI Xiao, ZHANG Rong, LIU Juan-zi, HUANG Xiu-na,ZHANG Zhi-ying, SUN Zhao-hui, LI Lin-hai*
Department of Laboratory Medicine, Guangzhou General Hospital of PLA, 510010, China Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital, Shantou University Medical College, 515041, China LIAN Fei and CHEN Jing-na are the first authors who contributed equally to the article

ObjectiveTo investigate the prevalence of human papillomavirus (HPV) infection among 1730 women receiveing healthy examination in our hospital, and speculate the prevalence of HPV infection among female population in Guangzhou.MethodsA total of 1730 woman who

healthy examination in our hospital underwent 17 high-risk HPV and 10 low-risk HPV genotype screening of cervical specimen using flow cytometry fluorescence hybridization method. Different HPV genotypes and subtype infection rate were summarized.ResultsThe infection rate of high-risk HPV was 10.17% (176/1730), and the infection rate of low-risk HPV was 5.90% (102/1730). The highest infection rate of high-risk HPV was ＞ 60 years age group, followed by ＜ 30 years age group. The most common HPV infection pattern was single high-risk HPV infection, while the least pattern was multiple low-risk merged single high-risk HPV infection. HPV type 53, 58, 52, 39, 16, 18, 51, 56 (in descending order of frequency) were 8 most common highrisk HPV types, while HPV type 43, 61, 81, 42 were 4 most common low-risk HPV types.ConclusionsHPV infection rate is high among females in Guangzhou, and high-risk HPV is the most common infection genotype. Regular HPV screening of cervical specimens is useful for prevention and early detection of cervical cancer.

human papillomavirus; high-risk; low-risk; Guangzhou

R373.9

A

1007-8134(2017)05-0286-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.05.010

廣州市產(chǎn)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)（201604040003）

510010 ，解放軍廣州總醫(yī)院檢驗(yàn)科（連菲、楊永泉、張瑩瑩、李曉、張蓉、劉娟子、黃秀娜、張志英、孫朝暉、李林海）；515041，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科（陳靜娜）前兩位作者對(duì)本文有同等貢獻(xiàn)，均為第一作者

李林海，E-mail： mature303@126.com

*Corresponding author, E-mail: mature303@126.com

（2017-09-02收稿 2017-10-17修回）

（本文編輯 張?jiān)戚x）