張鞠玲，袁 媛，王 歡，鮑春梅，曲 芬

急性肝衰竭肺部感染短帚霉的病原特征研究

張鞠玲，袁 媛，王 歡，鮑春梅，曲 芬

目的探討急性肝衰竭患者肺部感染短帚霉的實(shí)驗(yàn)診斷特征，為臨床診治該菌感染提供科學(xué)依據(jù)。方法2017年1月收集1例藥物性肝損傷導(dǎo)致急性肝衰竭并肺部感染短帚霉患者，對(duì)其標(biāo)本進(jìn)行痰真菌培養(yǎng)，通過觀察菌落生長形態(tài)和光學(xué)顯微鏡下菌株形態(tài)，質(zhì)譜儀檢測及擴(kuò)增ITS序列對(duì)其進(jìn)行鑒定確診；采用E-test方法進(jìn)行真菌體外藥物敏感性（藥敏）試驗(yàn)。結(jié)果結(jié)合不同溫度、不同培養(yǎng)基下真菌生長的形態(tài)學(xué)特征，質(zhì)譜儀分析及rDNA-ITS序列分析確定為短帚霉，該株短帚霉對(duì)伏立康唑和兩性霉素B有較好的敏感性，最小抑菌濃度值分別為≥0.50 μg/ml和≤0.75 μg/ml。結(jié)論 本例為急性肝衰竭患者肺部感染短帚霉的首例報(bào)道，短帚霉有其形態(tài)特征和藥敏特點(diǎn)，臨床應(yīng)正確選用抗菌藥物。

急性肝衰竭；短帚霉；肺部感染；診斷

短帚霉屬于子囊菌門單囊壁菌綱，廣泛存在于空氣、土壤、食品、植物、紙以及木材中[1]，是一種腐生性條件致病真菌。通常認(rèn)為該菌引起甲真菌病，較少引起其他部位的侵襲性感染。但目前國外已有關(guān)于深部組織感染的報(bào)道，如肺移植受體、心內(nèi)膜炎、鼻竇炎等，且感染主要發(fā)生于免疫力低下患者[2-4]。短帚霉生長緩慢，傳統(tǒng)方法不易直接鑒定到種屬水平；感染早期影像學(xué)改變不明顯，且容易被誤診為污染菌。本研究通過對(duì)短帚霉菌落形態(tài)和顯微鏡下形態(tài)特征、質(zhì)譜檢測、DNA測序和藥物敏感性（藥敏）試驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)研究，為實(shí)驗(yàn)室鑒定及臨床明確診斷該菌感染提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者，女，48歲，2017年1月20日出現(xiàn)黃疸，意識(shí)障礙1 d，后以肝硬化合并急性肝衰竭入院。給予支持對(duì)癥治療效果欠佳。患者有藥物性肝損傷病史，1月22日患者出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽等呼吸道癥狀，血常規(guī)示白細(xì)胞總數(shù)為（8.19～10.11）×109/L，中性粒細(xì)胞比例為72.40%～88.10%，降鈣素原為0.476～1.350 ng/ml，G實(shí)驗(yàn)為31.9 pg/ml，GM實(shí)驗(yàn)為0.47。肺部聽診呼吸音粗，雙肺可聞及濕啰音，肺部CT示雙側(cè)胸腔積液伴左側(cè)局限性肺不張。1月23日患者氧飽和度不能維持，改用無創(chuàng)呼吸機(jī)輔助呼吸，高熱持續(xù)，患者總體病情無好轉(zhuǎn)。1月26日連續(xù)床旁纖維支氣管鏡采集肺部支氣管肺泡灌洗液及痰標(biāo)本行病原學(xué)檢測的同時(shí)，進(jìn)行抗感染、保肝、維持水及電解質(zhì)平衡，維持心肺功能的綜合搶救措施?；颊叨嗯K器功能持續(xù)惡化，患者家屬放棄治療，于1月28日出院。出院后于2月2日連續(xù)3次培養(yǎng)結(jié)果均為短帚霉。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 主要為沙保弱（SDA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、真菌Mueller-Hinton（OXOID公司，英國），乳酸酚棉藍(lán)染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），組分Ⅰ、Ⅱ（北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)，ITS1、 ITS4（華大基因），Premix Taq Version2.0（TaKaRa，日本），玻璃珠法柱式真菌DNAout（北京天恩澤基因科技有限公司），50×TAE（北京索萊寶科技有限公司），1.5 ml離心管（Axygen，美國），PCR管（Axygen，美國），藥敏E-test法（鄭州安圖生物工程股份有限公司）。

1.2.2 儀器 主要有光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS-CH，日本），質(zhì)譜儀Clin-TOF MS（北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司），臨床微生物菌種鑒定數(shù)據(jù)庫BioExplorerV2.3（北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），霉菌培養(yǎng)箱（杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司），高速離心機(jī)（Thermo，美國），PCR儀（BIO-RAD，美國）、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)鑒定 連續(xù)多次采集痰液，進(jìn)行病原學(xué)檢測。痰標(biāo)本直接接種于SDA、PDA培養(yǎng)皿，分別進(jìn)行27 ℃和37 ℃培養(yǎng)14 d，連續(xù)觀察菌落變化。光鏡下形態(tài)學(xué)觀察，用方塊法小培養(yǎng)，培養(yǎng)基為PDA，27 ℃培養(yǎng)72 h，用透明膠帶粘取絲狀真菌表面，置于滴有乳酸棉藍(lán)染液的玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子、菌絲和分生孢子形態(tài)、生長方式及菌絲特征等[5]。

1.3.2 質(zhì)譜儀鑒定

1.3.2.1 質(zhì)譜儀檢測 根據(jù)質(zhì)譜儀Clin-TOF MS使用說明，采用直接涂抹法鑒定致病真菌。挑取真菌菌落均勻涂抹在靶板上自然干燥，在樣品點(diǎn)上覆蓋1 μl組分Ⅰ自然干燥，再覆蓋1 μl基質(zhì)液（α-氰基-4-羥基肉桂酸）自然干燥，上機(jī)檢測。質(zhì)控菌株采用ATCC8739（大腸埃希菌）。使用Clin-TOF MS采集圖譜，在線性模式下設(shè)置如下參數(shù)：激光頻率40 Hz、加速電壓20 kV、脈沖電壓2 kV、離子透鏡電壓6 kV、相對(duì)分子質(zhì)量范圍2000～20 000 Da，將質(zhì)譜圖導(dǎo)入BioExplorer2.0軟件搜庫，生成鑒定報(bào)告[6]。

1.3.2.2 結(jié)果判定 Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定分值≥25.00為鑒定結(jié)果可信；分值在20.00～24.99之間建議重新檢測或補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)幫助鑒定；分值＜20.00為結(jié)果不可信。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

1.3.3.1 DNA模板制備 真菌菌株按照玻璃珠法柱式真菌DNAout試劑盒說明書操作方法提取真菌DNA模板，制備的核酸于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 PCR擴(kuò)增 實(shí)驗(yàn)室采用真菌通用引物，參照Lott等[7]報(bào) 道。ITS1（F）：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4（R）：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。 擴(kuò) 增 真 菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。PCR反應(yīng)體系50 μl，參照Premix試劑說明書配置。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察是否有條帶。

1.3.3.3 測序及序列分析 將擴(kuò)增片段的PCR產(chǎn)物送華大基因科技公司進(jìn)行測序。在NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）應(yīng)用Blastn對(duì)基因序列進(jìn)行同源性分析。

1.3.4 藥敏試驗(yàn) 采用E-test條對(duì)致病菌進(jìn)行伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B體外真菌藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行。藥敏結(jié)果依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) M27-S4進(jìn)行判讀。

2 結(jié) 果

2.1 菌落形態(tài)及鏡下特征 短帚霉菌落在3 d后呈白色膜樣菌落，10 d以后呈深褐色、灰褐色粉末狀，菌落邊緣為淡黃色，背面為黃褐色。27 ℃SDA培養(yǎng)菌落表面呈繩狀。37 ℃ PDA培養(yǎng)菌落表面褶皺明顯（見圖1）。乳酸棉藍(lán)染色鏡檢發(fā)現(xiàn)分生孢子梗自菌絲長出，極短或無分生孢子梗。子實(shí)結(jié)構(gòu)不規(guī)則，有的僅菌絲上產(chǎn)生無柄的單個(gè)環(huán)痕子梗。有的具有明顯的帚狀枝，外觀似青霉。分生孢子由環(huán)孢子梗產(chǎn)生，呈球形或檸檬形，壁厚，粗糙有刺，有的成熟的分生孢子脫落在菌絲周圍，孢子較大，直徑可達(dá)10 μm（見圖2）。

2.2 質(zhì)譜儀檢測結(jié)果 質(zhì)譜儀檢測顯示主要有8個(gè)主峰，強(qiáng)度最大的峰為7808，該峰強(qiáng)度為582 mV。質(zhì)譜儀檢測評(píng)分為42，鑒定結(jié)果可信，鑒定結(jié)果及峰圖見圖3。

2.3 DNA序列分析 測序結(jié)果和基因Bank比對(duì)，符合率為98%，鑒定為短帚霉。基因序列見圖4。

2.4 藥敏結(jié)果 該株短帚霉對(duì)伏立康唑和兩性霉素B有較好的敏感性。伏立康唑，最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration, MIC） ≤ 0.50 μg/ml， 兩 性 霉素B，MIC ≤ 0.75 μg/ml。對(duì)伊曲康唑耐藥，MIC ≥ 32.00 μg/ml（見表 1）。

3 討 論

圖1 短帚霉菌落形態(tài)A. 3 d（27 ℃ SDA）；B. 14 d（27 ℃ SDA）；C. 3 d（27 ℃ PDA）；D. 14 d（27 ℃ PDA）； E. 3 d（37 ℃ PDA）；F. 14 d（37 ℃PDA）；G. 3 d（37 ℃ SDA）；H. 14 d（37 ℃ SDA）Figure 1 Colonial morphology of Scopulariopsis brevicaulis

圖2 短帚霉乳酸棉藍(lán)染色光學(xué)顯微鏡下形態(tài)I. 放大倍數(shù) 10×； J. 放大倍數(shù) 40×Figure 2 Morphology of Scopulariopsis brevicaulis under optical microscope by lactic acid cotton blue staining

圖3 短帚霉質(zhì)譜鑒定譜圖Figure 3 Spectrogram of Scopulariopsis brevicaulis by Clin-TOF MS identification

侵入性霉菌感染已經(jīng)成為臨床抗感染治療的棘手問題，早期、快速、準(zhǔn)確的診斷是臨床及時(shí)救治的關(guān)鍵[8]。帚霉也可引起侵入性霉菌感染，多從呼吸道、表皮組織、深層組織或流體樣本中獲得。臨床上最常見的是短帚霉，本實(shí)驗(yàn)中分離的菌種經(jīng)基因測序?yàn)槎讨忝?。以往文獻(xiàn)中有帚霉引起心內(nèi)膜炎、鼻竇炎、腦膿腫、深部皮膚感染、器官移植術(shù)后感染、白血病患者肺部感染并傳播的相關(guān)報(bào)道[9-14]，但急性肝衰竭患者肺部短帚霉感染的病例未見報(bào)道。

圖4 短帚霉基因比對(duì)結(jié)果Figure 4 Gene comparison results of Scopulariopsis brevicaulis

表1 短帚霉藥敏結(jié)果Table 1 Results of Scopulariopsis brevicaulis drug susceptibility

實(shí)驗(yàn)室常采用觀察平板菌落特點(diǎn)和鏡下真菌形態(tài)、產(chǎn)孢方式相結(jié)合的方法來鑒定絲狀真菌。但真菌菌落形態(tài)易受培養(yǎng)平板、培養(yǎng)溫度等影響，易產(chǎn)生人為誤差。本研究的短帚霉分別在PDA、SDA 27 ℃和37 ℃培養(yǎng)下，生長形態(tài)不同。因此，辨識(shí)菌落形態(tài)須要充分了解絲狀真菌在不同培養(yǎng)基和不同溫度下的形態(tài)特征。分子生物學(xué)方法是“金標(biāo)準(zhǔn)”，能夠成功準(zhǔn)確鑒定短帚霉。質(zhì)譜技術(shù)是近年來的研究熱點(diǎn)，以高通量、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)受到微生物實(shí)驗(yàn)室的廣泛關(guān)注。對(duì)酵母真菌達(dá)到屬水平的鑒定率為98.68%，對(duì)絲狀真菌達(dá)到屬水平的鑒定率為96.74%[15]，鑒定短帚霉的分值在種水平的可信度以上。本研究通過對(duì)多種鑒定方法的比較，表明質(zhì)譜鑒定的速度快、準(zhǔn)確度高，有助于臨床早期診斷致病性真菌。

目前臨床沒有治療帚霉感染藥敏的相關(guān)規(guī)范，且短帚霉對(duì)多種常用治療真菌的藥物都具有較強(qiáng)的耐藥性。本文中的短帚霉僅對(duì)伏立康唑，兩性霉素B有較好的敏感性。有研究顯示泊沙康唑加特比萘芬，兩性霉素B加卡泊芬凈聯(lián)合用藥中觀察到協(xié)同作用[16]。還有學(xué)者提出使用泊沙康唑、特比萘芬和卡泊芬凈3種藥物聯(lián)合治療帚霉有較好的效果[17]。早期診斷對(duì)選擇治療藥物至關(guān)重要，由于絲狀真菌生長緩慢的特性，傳統(tǒng)的鑒定方法限制了早期診斷，隨著質(zhì)譜儀和基因測序技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用，不斷認(rèn)識(shí)真菌的實(shí)驗(yàn)室特征并開發(fā)新的檢測技術(shù)是未來研究的方向。

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Pathogen characteristics of Scopulariopsis brevicaulis in acute hepatic failure patients with pulmonary infection

ZHANG Ju-ling, YUAN Yuan, WANG Huan, BAO Chun-mei, QU Fen*
Center of Clinical Laboratory, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

ObjectiveTo investigate the laboratory diagnostic characteristics of Scopulariopsis brevicaulis in a acute hepatic failure patient with pulmonary infection, and provide scientific evidence for clinical diagnosis and treatment .MethodsThe sputum specimen was collected from a patient with acute hepatic failure caused by medicamentous liver lesion and cultivated for fungal in January 2017.The fungi was identified by observing the morphology of colony growth under microscope and confirmed by mass spectrometer and the amplification of ITS sequence. The drug sensitivity test in vitro of fungi was performed with E-test method.ResultsScopulariopsis brevicaulis was diagnosed according to the morphology of fungi growth in different temperatures and media, mass spectrometer detection and rDNA-ITS sequence analysis. It was sensitive to volconazole and amphotericin B, with minimal inhibitory concentration values of ≥ 0.50 μg/ml and ≤ 0.75 μg/ml respectively.ConclusionsIt is the first report of pulmonary infection patients with acute hepatic failure caused by Scopulariopsis brevicaulis. It has morphological characteristics and drug sensitivity.Therefore, antibacterial agents should be selected correctly for clinical treatment.

acute hepatic failure; Scopulariopsis brevicaulis; pulmonary infection; diagnosis

R379

A

1007-8134(2017)05-0272-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.05.007

首都市民健康培育項(xiàng)目（Z151100003915151）

100039 北京，解放軍第三○二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心（張鞠玲、袁媛、王歡、 鮑春梅、曲芬）

曲芬， E-mail： qf302@163.com

*Corresponding author, E-mail: qf302@163.com

（2017-09-05收稿 2017-09-28修回）

（本文編輯 胡 玫）