王 磊，黃敏君，李晶晶，王 非，鄭曉燕，李小麗，鄒 洋

8例輸入性卵形瘧不同亞型的鑒定

王 磊，黃敏君，李晶晶，王 非，鄭曉燕，李小麗，鄒 洋

目的鑒定并分析境外輸入性卵形瘧的2種亞型及其感染的臨床特點。方法 對在北京友誼醫(yī)院2015年1月—2017年3月確診的8例輸入性卵形瘧患者進行蟲種亞型的鑒定，并分析比較不同亞型感染引起的實驗室指標(biāo)的差異。結(jié)果通過對8例患者進行巢氏PCR鑒定及序列分析，結(jié)果顯示卵形瘧curtisi及卵形瘧wallikeri亞型各4例；與curtisi亞型感染相比，wallikeri亞型感染后引起血小板下降程度更低，乳酸脫氫酶及TBIL的上升程度更高。結(jié)論 輸入性卵形瘧的亞型鑒定須通過巢氏PCR鑒定完成，wallikeri亞型感染導(dǎo)致的器官損害更為嚴重。

輸入性瘧疾；卵形瘧curtisi亞型；卵形瘧wallikeri亞型；巢氏PCR；器官損害

瘧疾是全球范圍內(nèi)最為嚴重的感染性疾病之一，截至2015年，全球仍有約43萬人因感染瘧疾而死亡[1]。卵形瘧原蟲是5種主要感染人體瘧原蟲中較為少見的瘧原蟲種[2]。其主要分布在非洲西部、東南亞和南亞等國家的熱帶地區(qū)，因其發(fā)病率低、臨床癥狀較輕等特點一直未引起足夠的重視[3]。

卵形瘧原蟲在形態(tài)學(xué)上和間日瘧原蟲相似，因而使用形態(tài)學(xué)方法較難鑒別，誤診率較高。目前專門針對卵形瘧原蟲的快速檢測試劑還未上市，使用卵形瘧抗原或其抗體制作的快速檢測產(chǎn)品敏感性較低或檢測效果極不穩(wěn)定，因此目前眾多實驗室均使用PCR方法對卵形瘧進行鑒定[3]。近期研究發(fā)現(xiàn)，卵形瘧存在2個亞型，即卵形瘧curtisi和卵形瘧wallikeri[5]。此后又有研究表明不同卵形瘧亞型感染后臨床表現(xiàn)及實驗室檢查指標(biāo)均存在明顯差異[6]。因此，本研究對我院收治的8例輸入性卵形瘧患者的資料進行系統(tǒng)分析并進行巢氏PCR鑒定，明確不同卵形瘧的感染亞型，總結(jié)不同卵形瘧亞型感染的臨床特點，為臨床醫(yī)師提供診治思路，提高針對卵形瘧感染的認知水平。

1 對象和方法

1.1 對象 研究對象為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 2015年1月—2017年3月收治的使用巢氏PCR確診的8例輸入性卵形瘧感染患者。收集患者的性別、年齡、流行病學(xué)史（疫源地、發(fā)病至確診時間），入院期間血常規(guī)、肝臟酶學(xué)功能等實驗室資料。

1.2 儀器及試劑 Giemsa染液、BinaxNOW瘧原蟲乳酸脫氫酶檢測試劑盒、全血DNA 提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit），TaKaRa Ex Taq酶（DRR006A），5×Loading Buffer（GENEray，GR0205）；蔡司Axio Scope A1顯微鏡及 PCR 儀（型號 PTC-200，Bio-Rad，美國）。

1.3 檢測方法

1.3.1 Giemsa染色鏡檢 采集患者EDTA-Na2抗凝全血制作標(biāo)準(zhǔn)血涂片，將其干燥、固定后使用Giemsa染色，再用蔡司Axio Scope A1顯微鏡鏡檢瘧原蟲（放大倍數(shù)×1000）。

1.3.2 免疫學(xué)檢測 使用瘧原蟲乳酸脫氫酶檢測試劑盒對8例患者血樣進行檢測。取5 μl全血，垂直加入檢測卡上加樣孔A內(nèi)，然后在樣品孔B上垂直滴加4滴裂解液，15 min內(nèi)判讀結(jié)果。

1.3.3 巢氏PCR檢測 按文獻報道方法合成引物并進行擴增[7-8]。提取患者抗凝血DNA，針對瘧原蟲18S rRNA進行巢氏擴增，首輪擴增采用瘧原蟲屬特異性引物（rPLU1/rPLU5），2輪擴增采用卵形瘧引物（rOVA1WC/ rOVA2WC）、curtisi亞型引物（rOVA1/ rOVA2）及wallikeri 亞型引物（rOVA1v/ rOVA2v）（見表1）。擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共擴增35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將陽性產(chǎn)物測序后再與GenBank中的相關(guān)序列進行BLAST比對和同源性分析。

表1 巢式PCR檢測瘧原蟲種類的引物Table 1 Primers of nest PCR for Plasmodium spp.

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 患者臨床癥狀、治療和轉(zhuǎn)歸等數(shù)據(jù)和資料，用 Excel 2010 建立數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行描述性分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 確診為卵形瘧的病例為8例，均為男性，年齡25～44歲，平均（32.9±7.4）歲。患者均有國外旅居史及蚊蟲叮咬史。其中包括赤道幾內(nèi)亞5例，尼日利亞1例，科特迪瓦1例，烏干達1例。從發(fā)病到確診瘧疾的時間為7～210 d，平均為（85±84）d。在其他醫(yī)院就診時診斷肺部感染4例，惡性瘧2例，間日瘧2例。

圖1 8例卵形瘧患者血涂片鏡檢結(jié)果（Giemsa染色，×1000倍）A～B. 滋養(yǎng)體；C. 未成熟裂殖體；D. 成熟裂殖體；E～F.配子體Figure 1 Morphology of Plasmodium ovale in blood smears from 8 malaria cases (Giemsa staining, ×1000)

2.2 鏡檢法及免疫學(xué)檢測 8例患者外周血涂片在顯微鏡下檢查瘧原蟲如圖1所示，受感染的紅細胞呈卵圓形，正常大小或稍脹大，均可見薛氏點；滋養(yǎng)體胞漿粗厚，胞漿堅實；裂殖子呈現(xiàn)玫瑰花樣；配子體核居一側(cè)，小配子體核較松散，大配子體核較致密。使用瘧原蟲乳酸脫氫酶檢測試劑盒對8份標(biāo)本進行檢測，結(jié)果均為陰性，提示非惡性瘧或間日瘧感染。

2.3 巢氏PCR鑒定結(jié)果及測序分析 使用巢氏PCR檢測結(jié)果顯示，首輪擴增后以卵形瘧引物rOVA1WC及rOVA2WC進行PCR擴增后發(fā)現(xiàn)8例患者均可見660 bp條帶，提示所有患者均為卵形瘧感染。然后分別以curtisi 和 wallikeri亞型引物rOVA1、rOVA2及rOVA1v、rOVA2v進行PCR擴增，curtisi亞型感染患者擴增片段長度為800 bp，如圖2所示。wallikeri亞型感染患者擴增片段長度為780 bp，提示2種亞型感染患者各有4例，如圖3所示。將上述患者2輪擴增的產(chǎn)物全部進行測序分析，并在NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對發(fā)現(xiàn)，curtisi亞型感染患者片段與數(shù)據(jù)庫中卵形瘧curtisi克隆DC-7的18S rRNA基因部分序列（GenBank編號為KF696375.1）的一致性為100%。wallikeri亞型感染患者片段與數(shù)據(jù)庫中卵形瘧wallikeri克隆RSH10的18S rRNA基因部分序列（GenBank 編號為KF219561.1）的一致性為100%。

圖2 8例卵形瘧患者全血DNA巢氏PCR擴增結(jié)果M. DNA標(biāo)志物；N. 陰性對照；1～8. 病例1～8血樣；pv. 間日瘧原蟲；pm. 三日瘧原蟲；pf . 惡性瘧原蟲Figure 2 Nest PCR amplification products of P. ovale DNA from 8 malaria cases

圖3 8例卵形瘧患者全血DNA不同亞型巢氏PCR擴增結(jié)果M. DNA標(biāo)志物；N. 陰性對照； C. curtisi 亞型引物擴增；W. wallikeri亞型引物擴增；1～8. 病例1～8的血樣Figure 3 Nest PCR amplification products of different subtypes of P. ovale DNA from 8 malaria cases

2.4 不同亞型感染與血小板、乳酸脫氫酶及TBIL之間的關(guān)系 卵形瘧感染后均會引起不同程度血小板的下降，乳酸脫氫酶及TBIL的升高。與curtisi亞型感染相比，wallikeri亞型感染后引起血小板下降程度更低，乳酸脫氫酶及TBIL的上升程度更高。見表2。

2.5 治療方法和預(yù)后 所有患者均采用蒿甲醚（昆明制藥集團股份有限公司 H10900012 規(guī)格80 mg/支）80 mg/次，1次/12 h，首次加倍，深部肌肉注射進行抗瘧治療。此后分別口服雙氫青蒿素哌喹片鞏固及磷酸伯氨喹啉片治療1個療程，上述卵形瘧患者均治愈，未見復(fù)發(fā)。

表2 不同卵形瘧亞型感染與實驗室指標(biāo)之間的關(guān)系Table 2 Correlation of laboratory examination indexes and different subtypes of P. ovale infection

3 討 論

Stephens[9]在1922年對感染患者紅細胞中卵形瘧原蟲的形態(tài)學(xué)特點做了首次描述，但此后針對卵形瘧的研究遠遠少于惡性瘧及間日瘧等，傳統(tǒng)意義上認為，卵形瘧發(fā)病率較低，傳播較為局限，而且卵形瘧的臨床表現(xiàn)較輕，所以未引起重視。實際上由于卵形瘧顯微鏡下形態(tài)與間日瘧相似，以及其典型的瘧疾隔日發(fā)作特點，常被誤診為間日瘧或三日瘧，從而導(dǎo)致其感染率被低估。直到2010年Sutherland[10]才發(fā)現(xiàn)卵形瘧存在2個亞型，即經(jīng)典型的卵形瘧 curtisi 和變異型的卵形瘧wallikeri。隨著國內(nèi)外交流的日益頻繁，目前國內(nèi)已有輸入性卵形瘧變異型（卵形瘧wallikeri）感染的相關(guān)報道[8]，但目前中國人感染這2種亞型的臨床特點尚未見研究。

在瘧疾診斷方法中，血涂片鏡檢作為病原學(xué)方法仍然被WHO認定為“金標(biāo)準(zhǔn)”。但卵形瘧在形態(tài)上與間日瘧僅有細微差別，極易出現(xiàn)漏診或難以鑒別蟲種。本組病例光鏡下形態(tài)見紅細胞呈卵圓形，環(huán)狀體胞漿粗厚，且可見明顯薛氏點，但也有些患者的血涂片并未見典型卵形瘧的形態(tài)學(xué)特征。有文獻顯示，與卵形瘧curtisi的形態(tài)相比，卵形瘧wallikeri在感染紅細胞表面出現(xiàn)薛氏點的可能性較小[11]。但在本組病例中2種卵形瘧亞型均可見明顯薛氏點，這可能與病例數(shù)較少相關(guān)。其次，商品化的免疫學(xué)檢測試劑的靶標(biāo)多針對于惡性瘧原蟲或泛瘧原蟲，尚無專門針對卵形瘧原蟲的快速檢測試劑，檢測敏感性也多表現(xiàn)為對惡性瘧原蟲敏感性高，而對非惡性瘧原蟲檢測敏感性低，尤其對卵形瘧原蟲易出現(xiàn)假陰性或檢測結(jié)果不穩(wěn)定的情況。本組病例中使用瘧原蟲乳酸脫氫酶抗原檢測結(jié)果均為陰性，提示在瘧疾特別是卵形瘧診斷過程中須要綜合診斷。

目前的研究表明，卵形瘧2種亞型從形態(tài)學(xué)上難以區(qū)分，因此分子生物學(xué)方法成為區(qū)分2種亞型的重要方法[4]。由于卵形瘧2種亞型間多個基因存在多態(tài)性，先前對卵形瘧原蟲的多個基因諸如細胞色素b、 細胞色素c氧化酶、 乳酸脫氫酶及核糖體小亞基核糖核酸（SSU rRNA）等基因進行針對性設(shè)計以區(qū)分2種亞型，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)選擇SSU rRNA基因較為可靠[12]。本組病例在瘧原蟲種屬引物擴增后使用卵形瘧通用引物（rOVA1WC/rOVA2WC）進行2輪擴增，結(jié)果均為陽性，提示8例患者均為卵形瘧感染。此后分別使用卵形瘧curtisi及wallikeri亞型引物擴增發(fā)現(xiàn)，各亞型均有4例患者，序列比對與NCBI數(shù)據(jù)庫中2種亞型序列完全吻合，提示上述PCR的實驗體系穩(wěn)定準(zhǔn)確，可以用于卵形瘧與其他類型瘧原蟲的鑒別，以及卵形瘧2種感染亞型間的區(qū)分，彌補了瘧原蟲血涂片鏡檢和抗原檢測造成的誤診和漏診，可以為臨床提供更為精準(zhǔn)的診斷信息。

新近研究發(fā)現(xiàn)，2種亞型卵形瘧感染患者的實驗室檢查結(jié)果均有所不同。Rojo-Marcos等[13]分別對21例curtisi及14例wallikeri亞型感染者的實驗室指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)，血小板的下降程度在wallikeri亞型感染者中更為明顯，2組患者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在本組病例中，卵形瘧感染均能引起血小板的下降，且與curtisi亞型感染相比，wallikeri亞型感染導(dǎo)致血小板下降更為明顯，與上述文獻報道相一致。此外本組病例中wallikeri亞型感染后導(dǎo)致乳酸脫氫酶及TBIL明顯升高，提示wallikeri亞型感染造成更為嚴重的機體器官功能損傷，這可能與這一亞型的毒力、傳播效率及患者易感性有關(guān)。但值得注意的是，由于本組病例數(shù)較少，2種亞型感染患者的臨床指標(biāo)進行統(tǒng)計學(xué)分析可能會產(chǎn)生偏倚，因此須要收集更多患者信息進行進一步評估。

綜上所述，綜合采用病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法可以明確輸入性卵形瘧的診斷和分型，了解不同亞型間可能存在的差異及與實驗室數(shù)據(jù)的不同特點的相關(guān)性；注重分型鑒定和實驗室指標(biāo)的綜合分析，可進一步提高臨床醫(yī)師對不同瘧原蟲及其亞型感染的臨床診斷并指導(dǎo)規(guī)范治療。

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Identification of 8 imported malaria cases with different subtypes of Plasmodium ovale infection

WANG Lei, HUANG Min-jun, LI Jing-jing, WANG Fei, ZHENG Xiao-yan, LI Xiao-li, ZOU Yang*
Beijing Tropical Medicine Research Institute, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University,Beijing Key Laboratory for Research on Prevention and Treatment of Tropical Diseases, 100050, China WANG Lei and HUANG Min-jun are the first authors who contributed equally to the article

ObjectiveTo identify and analyze clinical features of 8 imported malaria cases with 2 subtypes of Plasmodium ovale(P. ovale) infection.MethodsThe subtype identification of 8 imported malaria patients from January 2015 to March 2017 in Capital Medical University was conducted. Laboratory examination indexes were compared and analyzed in different P. ovale subtype infection.ResultsNest PCR identification and sequence alignment results showed that 8 patients determined as P. ovale infection.Four cases were identified as P. ovale curtisi and 4 cases were P. ovale wallikeri infection, respectively. Furthermore, compared to the P.ovale curtisi infection, there were significant levels of laboratory examination indexes, including lower thrombocytopenia, higher lactic dehydrogenase and increased total bilirubin with P. ovale wallikeri infection.ConclusionsThe nest PCR amplification is necessary for identification of P. ovale subtype infection. Severe organ damages are observed with P. ovale wallikeri infection.

imported malaria; P. ovale curtisi; P. ovale wallikeri; nest PCR; organ dysfunction

R531.3

A

1007-8134(2017)05-0290-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.05.011

國家自然科學(xué)基金項目（81702018）；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)計劃（2015-3-010）；北京市醫(yī)院管理局臨床技術(shù)創(chuàng)新項目（XMLX201502）；北京市重點實驗室開放課題項目（2017-3-3）

100050，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所熱帶病防治研究北京市重點實驗室（王磊、黃敏君、李晶晶、王非、鄭曉燕、李小麗、鄒洋）

前兩位作者對本文有同等貢獻，均為第一作者

鄒洋，E-mail： zouyang1027@163.com

*Corresponding author, E-mail: zouyang1027@163.com

（2017-07-20收稿 2017-09-15修回）

（本文編輯 胡 玫）