謝小萍 張海軍 郭藝彬 張茜 常耀明 暴軍香

·實(shí)驗(yàn)研究·

小凹蛋白-1介導(dǎo)阿托伐他汀對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎葉間動(dòng)脈收縮反應(yīng)的抑制作用

謝小萍 張海軍 郭藝彬 張茜 常耀明 暴軍香

目的腎葉間動(dòng)脈收縮反應(yīng)增強(qiáng)是高血壓腎臟損傷的早期表現(xiàn)，是重要的預(yù)防和治療靶點(diǎn)。平滑肌細(xì)胞小凹蛋白-1(caveolin-1)上調(diào)是其發(fā)生機(jī)制之一，阿托伐他汀(atorvastatin，ATVS)可通過(guò)降低膽固醇(cholesterol，CHO)調(diào)控caveolin-1表達(dá)，本研究探討ATVS是否通過(guò)caveolin-1抑制自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)腎葉間動(dòng)脈對(duì)血管緊張素II(angiotensin，Ang II)的收縮反應(yīng)。方法12只SHR大鼠隨機(jī)分為2組：SHR對(duì)照組及ATVS(50 mg·kg-1·d-1)處理組，每組6只，6只Wistar Kyoto (WKY)大鼠作為正常對(duì)照組。采用尾套法測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)，血管環(huán)張力描記技術(shù)檢測(cè)腎葉間動(dòng)脈收縮反應(yīng)，蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)caveolin-1和血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin II type 1 receptor，AT1)蛋白表達(dá)，免疫沉淀和Western blot檢測(cè)caveoin-1與AT1的結(jié)合。結(jié)果與WKY大鼠相比，SHR組SBP 顯著增高(P<0.05)，腎葉間動(dòng)脈對(duì)Ang Ⅱ的收縮反應(yīng)強(qiáng)度及敏感性均顯著增強(qiáng)(P<0.05)；4周ATVS處理顯著降低SHR組SBP(P<0.05)及腎葉間動(dòng)脈對(duì)Ang Ⅱ的收縮反應(yīng)強(qiáng)度及敏感性(P<0.05)。SHR組動(dòng)脈AT1及caveolin-1的蛋白表達(dá)顯著高于WKY大鼠(P<0.05)，AngⅡ孵育所致caveolin-1與AT1的結(jié)合亦較WKY組顯著增多(P<0.05)。ATVS處理可降低SHR組caveolin-1和AT1的蛋白表達(dá)(P<0.05)，并抑制caveolin-1與AT1的結(jié)合(P<0.05)，CHO孵育則可增高ATVS組caveolin-1蛋白含量并促進(jìn)其與AT1的相互作用(P<0.05)，同時(shí)可顯著增加腎葉間動(dòng)脈對(duì)AngⅡ收縮反應(yīng)的強(qiáng)度及敏感性(P<0.05)。結(jié)論ATVS可抑制SHR大鼠腎葉間動(dòng)脈對(duì)Ang Ⅱ的收縮反應(yīng)，其機(jī)制與caveolin-1的蛋白表達(dá)降低及caveolin-1與AT1的結(jié)合減少有關(guān)。

阿托伐他??；高血壓；血管緊張素Ⅱ；小凹蛋白-1

腎臟血管豐富，是高血壓的重要損害靶器官之一。大量研究表明，腎動(dòng)脈的高收縮反應(yīng)性是高血壓腎臟損傷的始動(dòng)和促進(jìn)因素之一，亦是重要的預(yù)防和治療靶點(diǎn)[1-2]。高血壓時(shí)，系統(tǒng)和局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)處于過(guò)度激活狀態(tài)[3]，Ang Ⅱ所致收縮反應(yīng)在容量血管和阻力血管均顯著上調(diào)[4]，我們的前期結(jié)果提示高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)腎臟肌性血管，特別是腎葉間動(dòng)脈對(duì)Ang Ⅱ的收縮反應(yīng)強(qiáng)度和敏感性增高[5]，其機(jī)制與平滑肌細(xì)胞膜穴樣凹陷(caveolae)改變有關(guān)，表現(xiàn)為數(shù)量增多，小凹蛋白-1(caveolin-1)蛋白含量及其與血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1)的結(jié)合增加等[5-6]。膽固醇(cholesterol, CHO)是調(diào)控caveolae的重要因素，耗竭CHO可減少caveolae、降低caveolin-1水平，抑制Ang Ⅱ激活A(yù)T1后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[7-9]。他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A(hydroxy methylglutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA)還原酶抑制劑，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制內(nèi)源性膽固醇合成限速酶阻斷細(xì)胞內(nèi)羥甲戊酸代謝途徑，使CHO合成減少，反饋性刺激細(xì)胞膜表面(主要為肝細(xì)胞)低密度脂蛋白受體數(shù)量，使血清CHO清除增加、水平降低[10]。除此之外，他汀還具有輔助降壓和減輕炎性反應(yīng)的作用[11-12]。在高血壓腎病、糖尿病腎病、腎病綜合征等多種動(dòng)物模型中，他汀可通過(guò)抗炎、抗氧化、抑制水解酶等作用保護(hù)腎功能[13-14]。 鑒于他汀可抑制CHO合成，CHO與caveolae結(jié)構(gòu)、caveolin-1表達(dá)及Ang Ⅱ致平滑肌收縮等過(guò)程密切相關(guān)。我們提出假說(shuō)：他汀可通過(guò)減少caveolin-1表達(dá)及caveolin-1與AT1結(jié)合而抑制SHR腎葉間動(dòng)脈對(duì)Ang Ⅱ的收縮反應(yīng)。本研究觀察阿托伐他汀(atorvastatin，ATVS)對(duì)SHR腎葉間動(dòng)脈小凹蛋白-1的影響，并探討其在動(dòng)脈收縮功能改變中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料與分組

1.實(shí)驗(yàn)材料 SHR大鼠和正常血壓Wistar Kyoto(WKY)大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，約12周齡，雌雄不拘，體質(zhì)量為200～240 g，實(shí)驗(yàn)均遵照第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用規(guī)定進(jìn)行。主要試劑和儀器(除標(biāo)注外均為國(guó)產(chǎn)分析純)： MgSO4、NaHCO3、KCl、NaCl、無(wú)水葡萄糖、 KH2PO4、CaCl2·2H2O、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA，Sigma公司，美國(guó))、血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ，Sigma公司，美國(guó))、CHO(Sigma公司，美國(guó))；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS，Solarbio公司，美國(guó))；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司，美國(guó))、抗caveolin-1一抗(anti-caveolin-1)、抗AT1一抗(anti-AT1，Abcam公司，美國(guó))；Pierce Classic IP Kit(Pierce公司，美國(guó))；半濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)、聚丙酰胺凝膠電泳系統(tǒng)(Invitrogen公司，美國(guó))；微血管張力記錄儀(DMT公司，丹麥)；Tanon紫外線凝膠成像系統(tǒng)(天能科技有限公司，上海)。

2. 分組 12只SHR大鼠隨機(jī)分為2組：SHR對(duì)照組及ATVS(50 mg·kg-1·d-1)處理組，每組6只；6只WKY大鼠作為正常對(duì)照組。ATVS組給予阿托伐他汀鈣片(立普妥，輝瑞制藥有限公司)灌胃，劑量為50 mg·kg-1·d-1，容量為10 ml/kg，SHR對(duì)照和WKY 大鼠給予等量生理鹽水灌胃，每天一次，持續(xù)4周。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.尾動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)測(cè)定 采用Softron動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)BP-98A進(jìn)行測(cè)量。選擇合適的鼠網(wǎng)和鼠袋，將大鼠置于38 ℃保溫桶中預(yù)熱15 min，然后將加壓感應(yīng)器放置于大鼠尾根部，在清醒和安靜狀態(tài)下測(cè)定血壓，每只大鼠測(cè)定6次，取平均值。分別于給藥前和給藥后2、4 周測(cè)量3組大鼠SBP。

2.血管張力測(cè)定 采用CO2將大鼠窒息至麻醉，心臟放血法處死大鼠。迅速將大鼠腎臟取出并置于4 ℃氧合的Krebs 緩沖液中(mmol/L)：NaCl 118.3，KCl 4.7， NaHCO325，KH2PO41.2，MgSO41.2，CaCl22.5，葡萄糖11.1，EDTA 0.026，pH 7.40)；在解剖顯微鏡下仔細(xì)分離并找到腎葉間動(dòng)脈，剪成長(zhǎng)度約為2 mm的血管環(huán)。先用頭發(fā)絲輕穿過(guò)管腔幾次以破環(huán)腎葉間動(dòng)脈血管內(nèi)皮，再將直徑為40 μm的兩根鋼絲穿過(guò)血管環(huán)，分別固定于血管張力記錄儀上下兩端。將血管環(huán)置于充滿Kreb’s緩沖液的恒溫(37 ℃)浴槽中，并通入95% O2和5% CO2，待血管張力平衡且達(dá)到最適靜息張力后，分別加入累積濃度的Ang Ⅱ(10-9～10-6mol/L)，同時(shí)觀察血管收縮反應(yīng)的變化，并記錄所得數(shù)據(jù)制備濃度-效應(yīng)曲線，由此計(jì)算出血管的最大收縮張力(Emax)和半最大效應(yīng)濃度(EC50)，即反應(yīng)達(dá)50%最大效應(yīng)時(shí)血管激動(dòng)劑的濃度。

3.免疫共沉淀 將血管組織在裂解液中勻漿，4 ℃、13 000 r/min離心10 min后取上清，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取至少300 μg蛋白與10 μg 抗-caveolin-1混勻，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。將Protein A/G Agarose震蕩混勻后吸取20 μl至離心柱，離心并洗滌后，棄去洗脫液，加入蛋白與抗體混合物，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育1 h，離心并洗滌后收集洗脫液，進(jìn)行免疫印記分析。

4.蛋白免疫印跡 取血管組織勻漿或免疫共沉淀洗脫液，按照每泳道30 μg蛋白上樣，用Invitrogen 40%～120% SDS-PAGE預(yù)制膠進(jìn)行電泳。之后采用半濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶粉室溫條件封閉1 h，一抗anti-caveolin(1∶500)或anti-AT1(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入HRP goat anti-rabbit(1∶10 000)室溫孵育1 h，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)所得數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件分析，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，濃度效應(yīng)曲線用重復(fù)測(cè)量方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，其余數(shù)據(jù)用組間t檢驗(yàn)或單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、WKY大鼠和SHR血壓變化及ATVS的作用

本研究首先檢測(cè)了4周ATVS處理對(duì)SHR大鼠血壓的影響。給藥前SHR組SBP(187.4±9.5) mmHg顯著高于WKY大鼠(133.3±9.2)(P<0.05)；兩周后，WKY大鼠血壓保持穩(wěn)定，而SHR對(duì)照組血壓升至(190.4±11.1) mmHg， ATVS處理組血壓則降低至(183.5±10.2) mmHg；4周后，WKY大鼠血壓無(wú)明顯改變，SHR組大鼠血壓升至(199.5±9.3) mmHg，而ATVS處理組血壓則保持在(183.2±8.2) mmHg，顯著低于SHR組(P<0.05)。(圖1)

注:與WKY組比較,aP<0.05;與SHR組比較,bP<0.05圖1 WKY及SHR大鼠SBP在ATVS作用前(0周)、2周及4周后的變化比較

二、ATVS抑制SHR腎葉間動(dòng)脈對(duì)Ang Ⅱ的收縮反應(yīng)

本研究接著觀察ATVS對(duì)SHR腎葉間動(dòng)脈對(duì)Ang Ⅱ收縮反應(yīng)的影響。如圖2A所示，在3組大鼠腎葉間動(dòng)脈，隨著劑量增加，Ang Ⅱ所致收縮反應(yīng)先升高后降低，呈拋物線樣改變。對(duì)其上升階段進(jìn)行分析可見(jiàn)，與WKY組相比，SHR腎葉間動(dòng)脈對(duì)Ang Ⅱ收縮反應(yīng)的Emax顯著增加56.1%(圖2B，P<0.05)，EC50顯著降低，提示收縮敏感性顯著增高(圖2B，P<0.05)；ATVS作用4 周后，SHR腎葉間動(dòng)脈對(duì)Ang Ⅱ的收縮反應(yīng)強(qiáng)度仍強(qiáng)于WKY組，但增加程度為20.4%，較SHR組顯著減小(圖2B，P<0.05)；ATVS處理組動(dòng)脈對(duì)Ang Ⅱ收縮敏感性顯著低于SHR組(圖2C，P<0.05)，與WKY組無(wú)明顯差別。

注:與WKY組比較,aP<0.05;與SHR組比較,bP<0.05圖2 WKY,SHR和ATVS處理組大鼠腎葉間動(dòng)脈對(duì)AngⅡ的收縮反應(yīng)曲線(A圖)、最大收縮張力(Emax,B圖)和半最大效應(yīng)濃度(EC50,C圖)

三、ATVS降低SHR腎葉間動(dòng)脈caveolin-1蛋白表達(dá)并抑制caveolin-1 與AT1結(jié)合

如圖3A和3B所示，western blot可檢測(cè)出45 000和23 000條帶，與AT1和caveolin-1相對(duì)分子質(zhì)量一致。與WKY大鼠相比，SHR腎葉間動(dòng)脈caveolin-1和AT1蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.05)，而4 周 ATVS處理可使caveolin-1和AT1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，其中caveolin-1與WKY組無(wú)顯著差別，但AT1仍高于WKY組(P<0.05)。圖3C和3D表示兩種蛋白的相互結(jié)合，通過(guò)計(jì)算AT1與caveolin-1條帶灰度的比值(AT1/caveolin-1)表示每個(gè)caveolin-1分子結(jié)合的AT1量。3組動(dòng)脈中，AngⅡ刺激(10-6mol/L，1 h)均可顯著增加AT1/caveolin-1(P<0.05)，但與WKY組相比，SHR組大鼠腎葉間動(dòng)脈Ang Ⅱ所致AT1/caveolin-1增加程度顯著增高(P<0.05)。ATVS作用4周后，與SHR對(duì)照組相比，腎葉間動(dòng)脈Ang Ⅱ刺激所致AT1/caveolin-1增高程度顯著降低(P<0.05)。

注:與WKY組比較,aP<0.05;與SHR組比較,bP<0.05;與各vehl組比較,cP<0.05圖3 WKY,SHR和ATVS處理組大鼠腎葉間動(dòng)脈caveo-lin-1和AT1蛋白表達(dá)(A圖,B圖)及AngⅡ刺激后二者的結(jié)合(C圖,D圖)

四、caveolin-1及其與AT1的結(jié)合在ATVS抑制 SHR腎葉間動(dòng)脈收縮反應(yīng)中的作用

為闡明ATVS所致caveolin-1 和AT1蛋白含量及二者的結(jié)合的降低是否介導(dǎo)其對(duì)SHR腎葉間動(dòng)脈收縮反應(yīng)的抑制作用，我們?cè)陔x體動(dòng)脈進(jìn)行了CHO孵育(1 mmol/L，37 ℃，12 h)發(fā)現(xiàn)其對(duì)SHR對(duì)照組腎葉間動(dòng)脈caveolin-1和AT1蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，但可顯著增加ATVS組大鼠腎葉間動(dòng)脈caveolin-1蛋白表達(dá)(P<0.05，圖4 A，B)，AT1蛋白含量有增加趨勢(shì)，但未達(dá)到顯著水平。免疫共沉淀結(jié)果表明，CHO孵育對(duì)SHR組caveolin-1 和AT1結(jié)合無(wú)明顯影響，但可顯著增加ATVS處理大鼠腎葉間動(dòng)脈二種蛋白之間的結(jié)合(P<0.05，圖4C，D)。血管收縮功能檢測(cè)結(jié)果顯示(圖5)，在SHR對(duì)照組，CHO孵育對(duì)Ang Ⅱ所致腎葉間動(dòng)脈收縮反應(yīng)的強(qiáng)度(Emax)和敏感性(EC50)無(wú)明顯影響，但可顯著增高ATVS組大鼠動(dòng)脈Emax(P<0.05)，降低其EC50(P<0.05)，表明其收縮強(qiáng)度增高，收縮敏感性增加。

注:與SHR組比較,aP<0.05;與ATVS組比較,bP<0.05;與各ve-hl組比較,cP<0.05圖4 CHO孵育對(duì)SHR及ATVS處理組大鼠腎葉間動(dòng)脈caveolin-1和AT1蛋白表達(dá)(A圖,B圖)及二者結(jié)合(C圖,D圖)的影響

注:與SHR組比較,aP<0.05;與vehl組比較,bP<0.05圖5 CHO孵育對(duì)SHR及ATVS處理組大鼠腎葉間動(dòng)脈對(duì)AngⅡ收縮反應(yīng)曲線(A圖)、最大收縮張力(Emax,B圖)和半最大效應(yīng)濃度(EC50,C圖)的影響

討 論

本研究結(jié)果表明，SHR的血壓和腎葉間動(dòng)脈收縮反應(yīng)均顯著高于WKY大鼠，ATVS可部分降低SHR血壓，抑制腎葉間動(dòng)脈對(duì)AngⅡ的收縮反應(yīng)，同時(shí)降低SHR組 caveolin-1蛋白表達(dá)并抑制caveolin-1與AT1的結(jié)合；離體孵育CHO可增加ATVS組大鼠腎葉間動(dòng)脈caveolin-1蛋白含量，促進(jìn)其與AT1的結(jié)合，同時(shí)增強(qiáng)動(dòng)脈對(duì)AngⅡ收縮反應(yīng)的強(qiáng)度和敏感性。

腎臟是原發(fā)性高血壓損傷最重要的靶器官之一，約18%的原發(fā)性高血壓患者最終會(huì)出現(xiàn)腎功能不全，持續(xù)發(fā)展可至尿毒癥期，甚至危及生命[1,15]。大量證據(jù)提示，腎動(dòng)脈對(duì)血管活性物質(zhì)的收縮反應(yīng)增強(qiáng)是高血壓性腎臟病變的早期促進(jìn)因素。如超聲多普勒腎血流檢測(cè)顯示原發(fā)性高血壓合并腎臟早期損傷的患者腎葉間動(dòng)脈阻力指數(shù)明顯增高[16]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，SHR腎葉間動(dòng)脈對(duì)KCl和PE的收縮反應(yīng)明顯增強(qiáng)，腎小球前小動(dòng)脈的收縮作用比正常大鼠增加40%[17]。RAS是高血壓動(dòng)脈損傷的重要介導(dǎo)分子，高血壓時(shí)動(dòng)脈壁的AT1含量增加，使得動(dòng)脈對(duì)AngⅡ收縮反應(yīng)增強(qiáng)[18]。本實(shí)驗(yàn)室前期工作顯示，與WKY大鼠相比，SHR腎葉間動(dòng)脈AT1表達(dá)增加，對(duì)AngⅡ的收縮反應(yīng)強(qiáng)度增加了32.7%，收縮敏感性也顯著增強(qiáng)，提示在高血壓形成期(SHR12周)，腎肌性血管出現(xiàn)過(guò)度收縮，可能引發(fā)腎缺血改變[5]。鑒于腎動(dòng)脈的收縮反應(yīng)亢進(jìn)在高血壓發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，針對(duì)其的預(yù)防和對(duì)抗措施研究一直受到重視[19]。

他汀類藥物不僅具有調(diào)脂作用，臨床觀察發(fā)現(xiàn)在伴有高血壓的高膽固醇血癥患者中，他汀可使血壓一定程度降低[11]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)則表明ATVS可改善血管內(nèi)皮功能[20]。與其他他汀類藥物相比，ATVS的腎臟保護(hù)作用最為突出，在高血壓早期腎損傷患者中的研究顯示，ATVS可顯著降低24 h尿微量白蛋白和腎葉間動(dòng)脈阻力指數(shù)，且具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性[13,21]，在晚期腎衰竭患者中，ATVS可降低房顫發(fā)生率[22]。本研究中，我們首先采用尾套法測(cè)定了WKY和SHR組大鼠的SBP，此為大鼠血壓測(cè)定的經(jīng)典方法[23]，在檢測(cè)過(guò)程中，大鼠情緒穩(wěn)定，未出現(xiàn)躁動(dòng)和激惹表現(xiàn)，SBP結(jié)果顯示SHR組血壓較WKY大鼠高40.6%，而4周ATVS(50 mg·kg-1·d-1)處理可使SHR血壓顯著降低約8.1%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7,21]。同時(shí)，SHR腎葉間動(dòng)脈對(duì)AngⅡ的收縮強(qiáng)度和收縮敏感性顯著高于WKY大鼠，4周 ATVS處理后，SHR與WKY大鼠腎葉間動(dòng)脈收縮功能的差異顯著縮小，提示ATVS降低血壓和對(duì)腎臟的保護(hù)作用可能與其降低腎動(dòng)脈收縮反應(yīng)有關(guān)。

ATVS降低血壓并改善腎葉間動(dòng)脈收縮功能的機(jī)制并不十分清楚，可能涉及脂質(zhì)調(diào)控、內(nèi)皮穩(wěn)定和抗氧化作用。Caveolae是脂膜上富含鞘酯和膽固醇的特殊結(jié)構(gòu)，caveolin-1為其主要結(jié)構(gòu)蛋白[24]。caveolae可以在細(xì)胞膜上形成相對(duì)分隔的微小區(qū)域，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的一氧化氮合酶磷酸化、平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和動(dòng)脈粥樣硬化形成等重要生理和病理過(guò)程[9]。Ang Ⅱ作用于AT1后，AT1從caveolae外移動(dòng)至caveolae內(nèi)，與caveolin-1結(jié)合激活Gq/11蛋白和下游信號(hào)通路，從而快速而高效的完成信號(hào)傳遞過(guò)程[25]。此外，caveolin-1與AT1結(jié)合是受體脫敏和再循環(huán)的重要途徑[26]。本實(shí)驗(yàn)中Ang Ⅱ致動(dòng)脈收縮的張力曲線呈拋物線型也證實(shí)AT1被激活后將迅速脫敏，這一自我保護(hù)作用可避免動(dòng)脈因持續(xù)收縮發(fā)生損傷，同時(shí)可保證每次收縮時(shí)有更多的AT1參與，使動(dòng)脈收縮的效率增加。本實(shí)驗(yàn)室以往研究證實(shí)cavelae/caveolin-1參與Ang Ⅱ致腎葉間動(dòng)脈的收縮反應(yīng)，SHR腎葉間動(dòng)脈caveolae數(shù)量增多，caveolin-1蛋白表達(dá)增加，與AT1結(jié)合增多，是上調(diào)動(dòng)脈收縮反應(yīng)強(qiáng)度和敏感性的重要機(jī)制[5]。

CHO是caveolae的重要成分，當(dāng)其含量降低時(shí)，細(xì)胞膜caveolae數(shù)量亦明顯減少[27]。由于caveolin-1主要存在于細(xì)胞膜caveolae中，caveolae結(jié)構(gòu)減少亦伴隨caveolin-1蛋白含量的降低，同時(shí)caveolin-1與原本存在于caveolae結(jié)構(gòu)中的受體和信號(hào)分子之間的結(jié)合也受到影響[27]。我們和其他實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果均表明采用甲基-β-環(huán)糊精耗竭CHO的方法抑制caveolae形成后，Ang Ⅱ作用于AT1后則需要更長(zhǎng)時(shí)間激活下游信號(hào)通路，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的強(qiáng)度和效率顯著降低，而CHO孵育則可恢復(fù)caveolae結(jié)構(gòu)，增加caveolin-1蛋白含量，促進(jìn)AT1激活后的信號(hào)傳遞過(guò)程[8,25]。他汀類藥物可抑制體內(nèi)CHO合成過(guò)程中的限速酶HMG-CoA還原酶[10,12,14,28]，還可增加膽管CHO的分泌(經(jīng)膽管排泌途徑)，同時(shí)可刺激經(jīng)腸道CHO排泄途徑，從而增加糞便排出，降低CHO水平[28]。ATVS對(duì)CHO的調(diào)控、CHO與caveolin-1及腎動(dòng)脈功能改變的關(guān)系提示ATVS可能通過(guò)caveolin-1影響SHR腎葉間動(dòng)脈對(duì)Ang Ⅱ的收縮反應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)4 周 ATVS處理可顯著降低SHR腎葉間動(dòng)脈caveolin-1的蛋白表達(dá)，同時(shí)抑制caveolin-1與AT1的結(jié)合，離體CHO孵育后，SHR腎葉間動(dòng)脈caveolin-1和AT1的蛋白表達(dá)以及二者之間的結(jié)合無(wú)明顯改變，而ATVS處理組caveolin-1蛋白表達(dá)部分恢復(fù)，caveolin-1與AT1的結(jié)合增加。動(dòng)脈功能檢測(cè)結(jié)果表明CHO孵育并不影響SHR腎葉間動(dòng)脈對(duì)AngⅡ的收縮反應(yīng)，而在ATVS處理組則顯著增高動(dòng)脈收縮的強(qiáng)度和敏感性，提示ATVS對(duì)腎葉間動(dòng)脈收縮反應(yīng)的抑制作用可能通過(guò)減少平滑肌細(xì)胞膜膽固醇含量，進(jìn)而降低caveolin-1蛋白表達(dá)及減少caveolin-1與AT1二者之間的結(jié)合而介導(dǎo)。以往研究中多采用高濃度(10 mM)短時(shí)(1 h)CHO孵育恢復(fù)cavaolin-1含量，本實(shí)驗(yàn)則采用低濃度(1 mmol/L)較長(zhǎng)時(shí)間(12 h)孵育，即提高了caveolin-1蛋白表達(dá)，也可保證動(dòng)脈功能不受影響。

本實(shí)驗(yàn)中SHR組AT1蛋白表達(dá)較WKY組顯著升高，而ATVS處理可降低SHR組動(dòng)脈AT1蛋白水平，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[29]。但與caveolin-1不同，CHO孵育后AT1的表達(dá)僅呈增高趨勢(shì)，未達(dá)到顯著性差異水平，說(shuō)明與AT1相比，caveolin-1對(duì)CHO更為敏感，而AT1的恢復(fù)則需要更大劑量或更長(zhǎng)時(shí)間CHO孵育[30]。此外，即使CHO孵育后ATVS組AT1受體含量仍少于SHR組，但caveolin-1和AT1的結(jié)合卻已恢復(fù)至與SHR組相當(dāng)?shù)乃剑砻鱟aveolin-1含量在腎葉間動(dòng)脈Ang Ⅱ信號(hào)傳遞和收縮反應(yīng)中可能發(fā)揮更為主要的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究證實(shí)ATVS可抑制SHR腎葉間動(dòng)脈對(duì)AngⅡ收縮反應(yīng)的強(qiáng)度和敏感性，其機(jī)制與減少caveolin-1蛋白表達(dá)及抑制caveolin-1與AT1的結(jié)合有關(guān)。

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InhibitoryeffectsofCaveolin-1-mediatedatorvastatinonvasoconstrictionofinterlobarrenalarteryinSHRrats

XIEXiao-ping,ZHANGHai-jun,GUOYi-bin,ZHANGXi,CHANGYao-ming,BAOJun-xiang.

DepartmentofAerospaceHygiene,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China

BAOJun-xiang,E-mail:baojunx@fmmu.edu.cn

ObjectiveExcessive vasoconstriction of interlobar renal artery (IRA) is one of preliminary manifestations of renal damage in hypertension, during which caveolin-1 plays an important role. Atorvastatin (ATVS) represses cholesterol (CHO) synthesis to down-regulate the expression of caveolin-1, so we aimed to investigate whether the ATVS inhibited vasoconstriction of IRA to angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) by regulating caveolin-1 in spontaneously hypertensive rats (SHR).MethodsTwelve SHR were randomly divided into two groups: SHR control group, and SHR ATVS-treated group. Six Wistar Kyoto (WKY) rats weighing the same were employed as control group. Systolic blood pressure (SBP) was measured with the tail-cuff technique before and 2 or 4 weeks after ATVS treatment. Isometric force recording system was used to detect the vascular function. Western blotting was conducted to examine the protein abundance of caveolin-1 or angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1). Immumoprecipitation was carried out to assess the binding of caveolin-1 and AT1.ResultsSBP, and intensity and sensitivity of vasoconstriction of IRA to Ang Ⅱ were significantly increased in SHR as compared to WKY rats (P<0.05). At 4th week, ATVS treatment could significantly reduce SPB(P<0.05), and the intensity and sensitivity of vasoconstriction of IRA to Ang Ⅱ (P<0.05) in SHR control group. Meanwhile, the protein expression of caveolin-1 or AT1as well as Ang Ⅱ elicited binding of caveolin-1 or AT1in IRA was higher in SHR than in WKY rats, which could also be reduced by ATVS (P<0.05). The ex vivo incubation of CHO raised the caveolin-1 protein content and promoted the binding of caveolin-1 and AT1in IRA of ATVS-treated SHR (P<0.05). At the same time, CHO enhanced the intensity and sensitivity of vasoconstriction of IRA to Ang Ⅱ (P<0.05).ConclusionsATVS mitigated the vasoconstriction of IRA to Ang Ⅱ in SHR, which was mediated by reducing caveolin-1 expression and inhibiting the binding of caveolin-1 and AT1.

Atorvastatin; Hypertension; Angiotensin Ⅱ; Caveolin-1

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.10.012

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(No.81401550；81671856)

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)航空航天衛(wèi)生學(xué)教研室

暴軍香，E-mail：baojunx@fmmu.edu.cn

2017-07-18

2017-09-26 )