于 穎 劉佳欣 周美琪 趙磊飛 王 超

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

用于植物基因研究的mCherry表達(dá)載體構(gòu)建及定位表達(dá)

于 穎 劉佳欣 周美琪 趙磊飛 王 超*

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

熒光蛋白在生物學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用和重要的作用，其中紅色熒光蛋白mCherry因其顏色和良好的特性，對(duì)于植物基因研究具有重要的使用價(jià)值，本研究將mCherry基因構(gòu)建到pBI121植物表達(dá)載體系統(tǒng)中，構(gòu)建了pBI121MCS-mCherry載體。利用基因槍轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入洋蔥表皮進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，顯微鏡觀察結(jié)果顯示整個(gè)洋蔥細(xì)胞具有紅色熒光，證明該載體能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)紅色熒光蛋白。利用雙酶切連接法將轉(zhuǎn)錄因子BpMYB4基因構(gòu)建到該載體上，得到融合表達(dá)載體pBI121MCS-mCherry-BpMYB4，在洋蔥表皮中表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞核具有紅色熒光，證明該載體能夠準(zhǔn)確表達(dá)融合蛋白，進(jìn)行亞細(xì)胞定位。同時(shí)融合基因時(shí)不再需要中間載體，構(gòu)建簡便，引入的KpnⅠ酶切位點(diǎn)，增加了可選擇性。因此該載體可用于植物基因表達(dá)定位及轉(zhuǎn)基因植株篩選研究中，為今后的白樺基因組學(xué)研究提供了材料。

mCherry；紅色熒光蛋白；植物表達(dá)載體構(gòu)建；細(xì)胞定位

熒光蛋白的最早發(fā)現(xiàn)是在1962年，是Shimomura等人在維多利亞多管水母(Aequorea victoria)中發(fā)現(xiàn)的野生型綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,avGFP)[1～2]。自熒光蛋白被發(fā)現(xiàn)以來，研究人員就從生物體內(nèi)分離出了多種熒光蛋白，并在此基礎(chǔ)上利用分子生物技術(shù)研究出幾乎覆蓋整個(gè)熒光光譜的突變體。按熒光蛋白的最大發(fā)射波長分類，可將熒光蛋白分為：藍(lán)色熒光蛋白(BFPs；440.470 rim)、青色熒光蛋白(CFPs；471.500 rim)、綠色熒光蛋白(GFPs；501.520 nm)、黃色熒光蛋白(YFPs；521.550)、橙色熒光蛋白(OFPs；551-575 rim)、紅色熒光蛋白(RFPs；576.610 nm)、遠(yuǎn)紅外熒光蛋白(FRFPs；611-660 nm)[3～4]。熒光蛋白的研究可用于分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等諸多方面，它還能夠與熒光顯微技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生熒光蛋白標(biāo)簽等諸多的生物學(xué)研究技術(shù)，從而使熒光蛋白成為生物學(xué)研究中非常重要的一項(xiàng)生物技術(shù)。

mCherry蛋白的最大激發(fā)光和發(fā)射光分別為587和610 nm[5～6]，常用于標(biāo)記和示蹤某些分子和細(xì)胞組分，具有熒光強(qiáng)度及光穩(wěn)定性良好的優(yōu)點(diǎn)[7～9]。相對(duì)于其他熒光，mCherry的好處在于它的顏色可與BFPs、CFPs、GFPs、YFPs或OFPs組合，用于多熒光標(biāo)記成像系統(tǒng)[10]，并且mCherry相對(duì)于其他單體熒光蛋白來說也具有卓越的光穩(wěn)定型。將mCherry熒光蛋白基因與目的基因蛋白進(jìn)行融合，產(chǎn)生的新型蛋白可用于目的基因的細(xì)胞定位和組織定位[3]。在所有的紅色熒光蛋白中mCherry相當(dāng)受歡迎，已經(jīng)被超過200篇文章引用。因此，構(gòu)建一種通用的進(jìn)行植物基因功能及表達(dá)研究的mCherry表達(dá)載體，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

pBI121質(zhì)粒是一種適用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體[11]，是雙元T-DNA載體，它攜帶組成型強(qiáng)啟動(dòng)子:CaMV35S，具有在原核生物和植物中篩選的抗性標(biāo)記，因此被廣泛使用[12]。本研究將mCherry基因序列，構(gòu)建到pBI121載體系統(tǒng)中，經(jīng)過表達(dá)鑒定，構(gòu)建了一種適用于植物的通用紅色熒光蛋白表達(dá)載體，為植物基因細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)基因植株篩選研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 pBI121-mCherry表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)pmCherry載體(Clontech,America)基因序列及pBI121MCS-GFP載體(本實(shí)驗(yàn)室保存)序列設(shè)計(jì)引物，同時(shí)在正向引物5′端插入一個(gè)KpnⅠ酶切位點(diǎn)，正向引物為：5′-GGGACTCTAGACGGGGTACCCTGGTACCCGGGTCGACTGACTAGTATGGTG-AGCAAGGGCGAGG-3′，反向引物為：5′-CGAGCTCTCACTTGTACAGCTCGTCCAT-3′，劃線部分為KpnⅠ酶切位點(diǎn)。以pmCherry載體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR的反應(yīng)體系為20 μL，其中模板為0.5 μL，5′端引物1 μL，3′端引物1 μL，dNTP 0.4 μL，Ex 10×Buffer 2 μL，Ex Taq酶(TaKaRa,大連寶生物)0.25 μL，ddH2O 15 μL。反應(yīng)程序是：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s,72℃延伸43 s，變性、退火、延伸重復(fù)35次，72℃保溫7 min。用膠回收試劑盒(Omega,America)回收目的片段。

用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XbaⅠ(Promega,America)切割pBI121MCS-GFP載體，用純化試劑盒(Omega,America)將得到的酶切產(chǎn)物純化回收。將目的基因片段與線性載體用T4DNA連接酶(Promega,America)連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆進(jìn)行測序檢驗(yàn)(華大，中國)。

1.2 mCherry：BpMYB4融合表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室克隆的白樺BpMYB4基因序列及pBI121MCS-mCherry載體序列設(shè)計(jì)引物，正向引物為：5′-CTAGTCTAGAATGGGAAGGTCTCCTTGCTG-3′，反向引物為：5′-CTAGACTAGTCACATTAATCCTGCAGCT-3′。以BpMYB4-T載體質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.1。用質(zhì)粒提取試劑盒(Omega,America)提取pBI121MCS-mCherry質(zhì)粒。

用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SpeⅠ(Promega,America)分別雙酶切回收得到的BpMYB4目的基因片段和pBI121MCS-mCherry質(zhì)粒，利用T4DNA連接酶(Promega,America)進(jìn)行連接，得到pBI121MCS-mCherry-BpMYB4融合表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆進(jìn)行測序檢驗(yàn)(華大，中國)。

1.3 pBI121MCS-mCherry表達(dá)載體轉(zhuǎn)化驗(yàn)證

撕取新鮮的洋蔥表皮，在1/2MS培養(yǎng)基中，室溫條件下，光培養(yǎng)1～2 d。用PDS-1000臺(tái)式基因槍(Bio-Rad)將pBI121MCS-mCherry質(zhì)粒和pBI121MCS-mCherry-MYB4質(zhì)粒包埋的微載體以高壓氦氣為動(dòng)力分別導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)部。黑暗條件下培養(yǎng)2～3 d。在激發(fā)波長為578 nm，發(fā)射波長為610 nm下，用激光共聚焦顯微鏡分別觀察其表達(dá)效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 pBI121MCS-mCherry表達(dá)載體構(gòu)建

利用PCR擴(kuò)增得到目的片段，通過EB/瓊脂糖凝膠電泳，以Marker DL2000為對(duì)照檢驗(yàn)擴(kuò)增的片段大小。結(jié)果顯示，擴(kuò)增的基因片段與目的基因長短一致，約為711 bp(圖1)。

用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XbaⅠ雙酶切PCR獲得的mCherry基因片段和pBI121MCS-GFP載體，去除pBI121MCS-GFP載體上的GFP基因，得到線性載體。酶切后的載體經(jīng)凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示酶切成功(圖2)。將雙酶切得到的pBI121MCS線性載體與目的片段用T4DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌當(dāng)中，在篩選平板中篩選陽性克隆，在篩選平板上挑取單克隆，進(jìn)行菌液PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的EB/瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3)。結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增的基因片段長度與目的基因長度一致。經(jīng)華大科技測序檢驗(yàn)，將測序結(jié)果與原基因序列利用Multiple Alignment Tool(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi?)進(jìn)行序列比對(duì)，一致性達(dá)到99%，表明pBI121MCS-mCherry表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖4)。

圖1 mCherry-pBI121MCS PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of mCherry-pBI121MCS PCR product M. DNA Maker DL2000; 1. mCherry-pBI121MCS

圖2 pBI121MCS-GFP載體酶切檢驗(yàn)圖 1.未酶切載體；2.酶切后載體Fig.2 pBI121MCS-GFP vector digested pictures 1.Cyclic carrier；2.Linear vector

圖3 mCherry-pBI121MCS菌液PCR結(jié)果Fig.3 mCherry-pBI121MCS broth PCR results M.DNA Maker DL2000; 1.mCherry-pBI121MCS

圖4 mCherry基因與pBI121MCS載體融合示意圖Fig.4 mCherry gene and pBI121MCS vector fusion diagram

圖5 MYB4-pBI121MCS-mCherry PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of MYB4-pBI121MCS-mCherry PCR product M. DNA Maker DL2000; 1.MYB4-pBI121MCS-mCherry

圖6 pBI121MCS-mCherry載體酶切檢驗(yàn)圖 1.未酶切載體；2.酶切后載體Fig.6 pBI121MCS-mCherry vector digested pictures1.Cyclic carrier; 2.Linear vector

圖7 MYB4-pBI121MCS-mCherry菌液PCR結(jié)果Fig.7 MYB4-pBI121MCS-mCherry broth PCR results M.DNA Maker DL2000; 1.MYB4-pBI121MCS-mCherry

2.2 mCherry：MYB4融合表達(dá)載體構(gòu)建

利用PCR反應(yīng)所擴(kuò)增得到的目的片段，通過EB/瓊脂糖凝膠電泳，以Marker DL2000為對(duì)照檢驗(yàn)擴(kuò)增的基因片段大小。結(jié)果顯示，擴(kuò)增的基因片段與目的基因大小一致，約為654 bp(圖5)。

用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SpeⅠ雙酶切PCR獲得的MYB4基因片段和pBI121MCS-mCherry載體。酶切后的載體經(jīng)凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示酶切成功(圖6)。將雙酶切得到的pBI121MCS-mCherry線性載體與目的片段用T4DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌當(dāng)中，在篩選平板中篩選陽性克隆，在篩選平板上挑取單克隆，進(jìn)行菌液PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的EB/瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖7)。結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增的基因片段長度與目的基因長度一致。經(jīng)華大科技測序檢驗(yàn)，將測序結(jié)果與原基因序列利用Multiple Alignment Tool(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi?)進(jìn)行序列比對(duì)，一致性達(dá)到99%，表明pBI121MCS-mCherry-MYB4表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 mCherry表達(dá)載體活性檢測

用核酸測定儀檢測用質(zhì)粒提取試劑盒提取的pBI121MCS-mCherry載體和pBI121MCS-mCherry-MYB4載體的質(zhì)粒DNA濃度，使其質(zhì)粒DNA濃度達(dá)到1 μg·μL-1。利用基因槍轉(zhuǎn)入洋蔥表皮中。激光共聚聚焦顯微鏡下檢查mCherry蛋白與mCherry-BpMYB4融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的表達(dá)情況(圖8)，可以看出pBI121MCS-mCherry載體能夠在洋蔥表皮細(xì)胞表達(dá)出紅色熒光，且在整個(gè)細(xì)胞中表達(dá)，說明本研究構(gòu)建的載體在植物細(xì)胞中具有表達(dá)活性。將與BpMYB4轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建的融合表達(dá)載體在在洋蔥表皮細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，可以看出，熒光主要出現(xiàn)在細(xì)胞核中，說明BpMYB4是核定位蛋白，這與其轉(zhuǎn)錄因子特性及之前的研究相符[13]，以上結(jié)果證明本研究構(gòu)建的pBI121MCS-mCherry載體能夠?qū)χ参锏鞍走M(jìn)行準(zhǔn)確細(xì)胞定位并可以用來篩選轉(zhuǎn)基因植株。

圖8 激光共聚焦顯微鏡鏡檢結(jié)果 a. pBI121MCS-mCherry載體；b. pBI121MCS-mCherry-MYB4載體Fig.8 Laser scanning confocal microscopy results a. pBI121MCS-mCherry vector; b. pBI121MCS-mCherry-MYB4 vector

3 討論

利用GUS基因來作為報(bào)告基團(tuán)，在檢測時(shí)存在對(duì)材料的破壞性，這一局限對(duì)于需要進(jìn)一步做基因表達(dá)的材料來說很不方便[14]。因此大量的轉(zhuǎn)基因植物篩選中，都應(yīng)用了熒光蛋白報(bào)告基因，與GUS基因相比較，它不需要固定材料和前處理，并且可在各種熒光顯微鏡下觀察到，同一細(xì)胞可在不同條件下進(jìn)行反復(fù)觀察[12,15～17]。與GFP基因相比較，其最大的優(yōu)點(diǎn)在于其顏色的不同，可與廣泛應(yīng)用的綠色熒光蛋白(GFP)進(jìn)行共同標(biāo)記。其中mCherry熒光蛋白因其顏色，穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)具有廣泛的應(yīng)用。將mCherry與HPT載體進(jìn)行融合，構(gòu)建HPT-mCherry融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到水稻中，可以快速有效地鑒定并得到轉(zhuǎn)基因陽性植株[18～19]。在大豆的研究中，將目的基因同時(shí)與綠色熒光蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白mCherry-HDEL進(jìn)行共定位，可探究基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況[20]。以mCherry紅色熒光蛋白為報(bào)告基因,由玉米泛素啟動(dòng)子(P-Ubi)和豌豆T3A-poly A序列組成過量表達(dá)框的轉(zhuǎn)基因載體，可將4個(gè)水稻類受體激酶的編碼序列插入表達(dá)框轉(zhuǎn)化水稻品種泰粳394。運(yùn)用該載體系統(tǒng)，能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因后代大規(guī)模篩選，獲得目的基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系[21]。本研究構(gòu)建的pBI121MCS-mCherry載體應(yīng)用了pBI121載體系統(tǒng)，因其具有強(qiáng)啟動(dòng)子及在原核生物和植物中篩選的抗性標(biāo)記，可以進(jìn)行植物基因的組織定位和亞細(xì)胞定位研究，也可以進(jìn)行植物過表達(dá)轉(zhuǎn)基因研究。該pBI121MCS-mCherry載體，成功引入了一個(gè)KpnⅠ酶切位點(diǎn)，增加了酶切位點(diǎn)的可選擇性，可使外源基因更有效的插入。因此本研究構(gòu)建的pBI121MCS-mCherry載體，在進(jìn)行植物基因表達(dá)及功能研究中具有一定的使用價(jià)值。

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National High Technology Research and Development Program 863(2013AA102704)

introduction：YU Ying(1992—),female,master,mainly engaging in Forest genetic engineering.

date:2016-11-08

ConstructionandExpressionofmCherryExpressionVectorUsedinPlant

YU Ying LIU Jia-Xin ZHOU Mei-Qi ZHAO Lei-Fei WANG Chao*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

Fluorescent proteins were widely used and played important roles in the biological research. The red fluorescent protein mCherry is valuable to the plant research because of its color and stability. The mCherry gene was inserted into pBI121 plant expression vector, and the pBI121MCS-mCherry vector was constructed. The vector were transferred into onion epidermis by particle bombardment, and the whole onion cells showed red fluorescence under the microscope, which suggested that the vector could express red fluorescent protein in plant cells. The transcription factor BpMYB4 gene was constructed in this vector using double enzyme digestion, and the fusion expression vector pBI121MCS-mCherry-BpMYB4 was obtained and expressed in onion epidermis. Only the nucleus showed red fluorescence, which indicated that the vector can be used to express the fusion protein and used in the subcellular localization accurately. While the fusion expression vector can be constructed simply, and the intermediate vectors are no longer required. TheKpnⅠ sites was introduced which can help the fusion of more genes. Therefore, mCherry vector can be used in cell localization of plant genes and screening of transgenic plants. This study would provide materials for genomics research of birch in future.

mCherry；red fluorescent protein；plant expression vector construction；cell localization

國家“863”課題(2013AA102704)資助

于穎(1992—)，女，碩士研究生，主要從事林木基因工程研究。

* 通信作者：E-mail:nefuwangchao@yahoo.com

2016-11-08

* Corresponding author：E-mail:nefuwangchao@yahoo.com

Q75

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.02.006