陸夢(mèng)瑩，胡秀彩，呂愛軍，孫敬鋒，陳成勛，王曉梅，YEONG Yiksung，宋亞嬌

(1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

鯰源維氏氣單胞菌的分離鑒定及藥敏特性

陸夢(mèng)瑩1，胡秀彩1，呂愛軍1，孫敬鋒1，陳成勛1，王曉梅1，YEONG Yiksung1，宋亞嬌2

(1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

為探明發(fā)病懷頭鯰Silurussoldatovi的病原及其生物學(xué)特征，從發(fā)病懷頭鯰體內(nèi)分離出1株革蘭氏陰性細(xì)菌SG-1，通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、理化特性、16S rDNA測(cè)序和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析對(duì)其進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明：分離菌SG-1菌株葡萄糖產(chǎn)氣、氧化酶、硝酸鹽還原為陽(yáng)性，鳥氨酸脫羧酶、硫化氫為陰性；進(jìn)一步采用PCR方法擴(kuò)增其16S rDNA序列，測(cè)序獲得片段大小為1409 bp，與維氏氣單胞菌Aeromonasveronii模式菌株ATCC35624序列相似性達(dá)99.86%；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，分離菌與維氏氣單胞菌自然聚為一支，最終判定SG-1菌株為維氏氣單胞菌；人工感染斑馬魚Daniorerio、鯰S.soldatovi，其死亡率均達(dá)100%，病魚呈現(xiàn)體表出血、肛門紅腫、腹水等癥狀；藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、諾氟沙星、左氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考等藥物敏感，對(duì)阿莫西林、氨芐西林、磺胺異惡唑、甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明等耐藥。本研究結(jié)果為了解維氏氣單胞菌感染鯰的致病機(jī)理及其該病的預(yù)防治療提供了科學(xué)參考。

鯰；維氏氣單胞菌；16S rDNA；系統(tǒng)發(fā)育樹；藥敏試驗(yàn)

維氏氣單胞菌Aeromonasveronii是一類兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，隸屬于氣單胞菌科Aeromonadaceae、氣單胞菌屬Aeromonas[1]。維氏氣單胞菌廣泛分布于自然界土壤、水環(huán)境和水生動(dòng)物體中，是一種新型的對(duì)人魚具有感染性的條件致病菌[2]，常常給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，維氏氣單胞菌能感染鯉Cyprinuscarpio[3]、斑點(diǎn)叉尾鮰Ictaluruspunctatus[4]、長(zhǎng)吻鮠Leiocassislongirostris[5]等多種魚類發(fā)病，臨床癥狀表現(xiàn)為體表出血、腹水等，也會(huì)引起人腹瀉、腦膜炎和敗血癥等。目前，關(guān)于鯰源維氏氣單胞菌的分離鑒定研究鮮有報(bào)道[6]。2016年4—5月，天津市某養(yǎng)殖場(chǎng)鯰Silurussoldatovi發(fā)病，病魚主要表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍，不攝食，體表潰爛出血，鰓絲、鰭條充血，肛門紅腫突出，腹部膨大，自然感染死亡率達(dá)80%以上。本研究中，從自然發(fā)病鯰肝臟等組織中分離出1株細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行了理化特性分析、16S rDNA基因序列分子鑒定及其藥物敏感性研究，旨在了解維氏氣單胞菌的致病機(jī)理，并為該病的預(yù)防治療提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1材料

患病鯰取自天津市寧河區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)。LB瓊脂、藥敏紙片購(gòu)自上海捷瑞生物工程，腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管GYZ-11e購(gòu)自環(huán)凱微生物公司。細(xì)菌總基因組提取試劑盒(DNA)、膠回收試劑盒(離心柱型)均購(gòu)自上海生工工程有限公司。2 ×Taq PCR MixPCR預(yù)混體系、DNA Marker DL2000均購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1 細(xì)菌的分離純化 參照胡秀彩等[7]的方法，通過無菌操作取病鯰肝臟等組織，接種于LB培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取優(yōu)勢(shì)單菌落于固體培養(yǎng)基中接種純化，經(jīng)過2～3次純化后得到純菌種，放置于冰箱(4 ℃)中保存?zhèn)溆谩＜兓笈囵B(yǎng)的菌液按照1∶1的比例加入40%的甘油于冰箱(-21 ℃)中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌形態(tài)特征及理化特性分析 將分離菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)18～24 h，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢菌體形態(tài)。將分離到的菌株無菌操作接種于細(xì)菌生化編碼鑒定管中，按照常規(guī)方法進(jìn)行硝酸鹽還原、糖(醇、苷)類代謝等19種理化特性測(cè)定。

1.2.3 動(dòng)物感染試驗(yàn) 健康鯰Silurussoldatovi體質(zhì)量約40 g，購(gòu)自天津某養(yǎng)殖場(chǎng)；斑馬魚Daniorerio體質(zhì)量約0.5 g，購(gòu)自天津某水產(chǎn)市場(chǎng)。參照田照輝等[8]的方法，將分離到的菌株用0.65% NaCl溶液配制成2.0×108cfu/mL的菌懸液。將健康鯰和斑馬魚作為試驗(yàn)對(duì)象，每組10尾魚，采取腹腔注射的方法，給試驗(yàn)組鯰每尾注射0.15 mL菌懸液，斑馬魚每尾注射10L，對(duì)照組鯰和斑馬魚等量注射0.65%無菌生理鹽水。試驗(yàn)魚經(jīng)過感染后連續(xù)觀察7 d，統(tǒng)計(jì)鯰和斑馬魚的發(fā)病情況和死亡數(shù)量。

1.2.4 細(xì)菌基因組DNA提取 將分離菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃下以120 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后期，菌液渾濁。取2 mL菌液于2 mL離心管中，以12 000 r/min離心 2 min，棄去上清液，向離心管中加入 500L無菌雙蒸水，渦旋 30 s，95 ℃下水浴 5 min，以12 000 r/min離心 2 min，以上清液作為模板。

1.2.5 細(xì)菌16S rDNA基因序列的擴(kuò)增及測(cè)序 細(xì)菌16S rDNA采用通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物來自上海生工。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(共20 μL)：2×Taq PCR Master Mix 10L，上下游引物各1L，DNA模板1L，無菌雙蒸水7L。PCR反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下變性40 s，55 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送金唯智生物科技有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過Blast軟件進(jìn)行同源性分析，采用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片法對(duì)分離菌株進(jìn)行30種常用抗生素藥物的敏感性檢測(cè)，采用涂布法將200 μL分離菌懸液涂布于LB固體培養(yǎng)基上，涂抹均勻，依次貼上待檢驗(yàn)的藥敏紙片，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，測(cè)量抑菌圈直徑，通過抑菌圈直徑大小來判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1鯰病原菌的分離及理化特性

病鯰主要表現(xiàn)為皮膚潰爛、出血點(diǎn)明顯，肛門紅腫外突、鰭條充血等臨床癥狀(圖1-A)。解剖發(fā)現(xiàn)，腹腔中有大量腹水，腸道內(nèi)無內(nèi)容物，腸壁充血出血，肝臟有壞死灶等病變(圖1-B)。從其肝臟組織分離純化獲得1株細(xì)菌，編號(hào)為SG-1，革蘭氏染色為短桿狀陰性菌，兩端鈍圓，該菌株在LB固體培養(yǎng)基上形成圓形、透明、表面濕潤(rùn)、邊緣整齊的小菌落。細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明，SG-1菌株葡萄糖產(chǎn)氣、氧化酶、硝酸鹽還原為陽(yáng)性，鳥氨酸脫羧酶、硫化氫為陰性等，結(jié)合該菌株的菌體形態(tài)和生理生化特性，基本符合氣單胞菌屬細(xì)菌特征(表1)。

表1 菌株SG-1的生理生化特性Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain SG-1

注：+為陽(yáng)性，-為陰性，d為不確定
Note：+,positive; -,negative; d,uncertainty

2.2分離菌的16SrDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

以分離菌SG-1基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增16S rDNA序列，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小約為1500 bp的目的條帶(圖2)，16SrDNA測(cè)序獲得1409 bp片段。Blast比對(duì)表明，與維氏氣單胞菌模式菌株ATCC35624[X74684.1]的16S rDNA序列相似性達(dá)99.86%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，分離菌SG-1與維氏氣單胞菌自然聚為一支(圖3)，最終判定SG-1為維氏氣單胞菌。

圖1 病鯰臨床癥狀Fig.1 Clinic signs of diseased northern sheatfish Silurus soldatovi

圖2 SG-1菌株的16S rDNA PCR檢測(cè)Fig.2 Fragment size of 16S rDNA sequence in strain SG-1 amplified by PCR

圖3 菌株SG-1的16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The 16S rDNA sequence phylogenetic tree of the strain SG-1

2.3動(dòng)物感染試驗(yàn)結(jié)果

人工回感染鯰72 h死亡率達(dá)100%，感染病鯰出現(xiàn)體表出血、肛門紅腫、腸壁充血、腹水等癥狀。人工腹腔注射斑馬魚感染4 h后出現(xiàn)發(fā)病死亡，48 h死亡率達(dá)100%；人工感染發(fā)病死亡鯰、斑馬魚與患病鯰自然發(fā)病癥狀基本相同，并且從發(fā)病魚肝臟中再次分離到與SG-1菌株特征一致的細(xì)菌。對(duì)照組魚則無發(fā)病死亡現(xiàn)象。

2.4藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選用30種抗生素對(duì)SG-1菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算平均值見表2。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、諾氟沙星、左氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考等藥物敏感，對(duì)阿莫西林、氨芐西林、磺胺異惡唑、甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明等耐藥，圖4為氯霉素、呋喃妥因、利福平、諾氟沙星、恩諾沙星的藥敏圖譜。

注：1為氯霉素，2為呋喃妥因，3為利福平，4為諾氟沙星，5為恩諾沙星Note：1,chloramphenicol; 2,nitrofurantoin; 3,rifampicin; 4,norfloxacin; 5,enrofloxacin圖4 菌株SG-1藥敏試驗(yàn)圖Fig.4 Susceptibility pattern of strain SG-1

3 討論

3.1維氏氣單胞菌的致病性

近幾年，關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物維氏氣單胞菌的研究報(bào)道備受關(guān)注[3-5]，該菌能引發(fā)魚類疾病發(fā)生，不僅影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，而且對(duì)人類飲食安全構(gòu)成潛在威害。維氏氣單胞菌廣泛存在于淡水、海水、污水和土壤等環(huán)境中，主要能引起敗血癥、胃腸炎等疾病，對(duì)人和多種水產(chǎn)動(dòng)物具有較強(qiáng)的感染致病力，被認(rèn)為是一種新型人魚共患條件致病菌[9-10]。唐毅等[11]從患爛尾病華鯪Sinilabeorendahli體內(nèi)分離到2個(gè)致病性維氏氣單胞菌優(yōu)勢(shì)菌株。房海等[12]從自然發(fā)病中華絨螯蟹Eriocheirsinensis肝胰腺中分離到維氏氣單胞菌，動(dòng)物試驗(yàn)顯示，單獨(dú)感染蟹發(fā)病死亡。沈文英等[13]從患病鱉Trionyxsinensis肝臟中分離得到1株高致病力細(xì)菌，經(jīng)生理生化及16S rDNA鑒定為維氏氣單胞菌。宋振輝等[14]從發(fā)病死亡鯽Carassiusauratus肝臟中分離出1株致病菌，并通過16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等鑒定為維氏氣單胞菌。本研究首次從國(guó)內(nèi)自然發(fā)病鯰肝臟中分離到SG-1菌株，通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和16S rDNA序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，最終鑒定為維氏氣單胞菌。Evangelista-Barreto等[15]從水體中分離到維氏氣單胞菌，認(rèn)為該菌能導(dǎo)致腸胃炎。秦國(guó)民等[16]從發(fā)病錦鯉Cyprinuscarpio病變組織中分離到維氏氣單胞菌，經(jīng)人工感染試驗(yàn)證實(shí)可引起鱗片脫落、體表出血等癥狀。Yu等[3]報(bào)道維氏氣單胞菌可感染以色列鯉C.carpio，病魚表現(xiàn)為腸炎、腹部腫脹明顯，且伴有皮膚潰爛等臨床癥狀。馬志宏等[17]報(bào)道維氏氣單胞菌感染鱘Acipenserbaeri死亡率達(dá)65%以上。宋振輝等[14]通過動(dòng)物感染試驗(yàn)表明，該菌能導(dǎo)致鯽C.auratus鱗片脫落、鰭條充血、肛門紅腫外突等癥狀，死亡率高達(dá)100%。迄今，維氏氣單胞菌感染鯰魚研究報(bào)道較少[5-6]。本研究中對(duì)維氏氣單胞菌SG-1菌株人工感染斑馬魚、鯰的死亡率均達(dá)100%，病魚呈現(xiàn)體表出血、肛門紅腫、腹水等癥狀，這與其他學(xué)者報(bào)道的感染癥狀基本一致[3,14,17]。以上研究不僅為維氏氣單胞菌感染魚類的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，而且為該病的預(yù)防治療提供了科學(xué)參考。值得一提的是，本研究中獲得的鯰源維氏氣單胞菌其生化特征鑒定出現(xiàn)了枸櫞酸鹽陽(yáng)性、尿素酶陽(yáng)性、苯丙氨酸酶陰性，這與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照株ATCC35624有所不同，可能與菌株來源、區(qū)域分布、水環(huán)境狀況等因素有關(guān)。此外，鯰源維氏氣單胞菌SG-1菌株與沈文英等[13]、黃文明等[18]的研究結(jié)果苯丙氨酸酶陰性一致，甚至還可能影響菌株的致病性，這有待進(jìn)一步研究。

表2 菌株SG-1的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Susceptibility test results of strain SG-1

3.2維氏氣單胞菌的藥敏特性

隨著抗生素類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖和疾病防治中廣泛使用，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象日益增強(qiáng)，已成為疾病防治過程中面臨的新難題。Nawaz等[6]從發(fā)病鯰體內(nèi)分離到81株維氏氣單胞菌，其中所有菌株均對(duì)四環(huán)素、氨芐青霉素和青霉素耐藥，絕大多數(shù)菌株對(duì)桿菌肽耐藥，7%菌株均對(duì)甲氧芐啶、磺胺異惡唑耐藥。沈文英等[13]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，鱉病原性維氏氣單胞菌對(duì)四環(huán)素、氟哌酸、慶大霉素、呋喃類藥物敏感，對(duì)紅霉素、青霉素等耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，錦鯉、鱘和蝦等源維氏氣單胞菌對(duì)鏈霉素、氧氟沙星、恩諾沙星等常用抗生素敏感[9，18]。黃文明等[19]研究顯示，胭脂魚維氏氣單胞菌對(duì)四環(huán)素、恩諾沙星等藥物高度敏感，對(duì)頭孢曲松、復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑等耐藥。上述研究結(jié)果，除四環(huán)素外，其余抗生素的抑菌效果均與本研究結(jié)果相同[6,13]，其中的耐藥性差異可能由于細(xì)菌來源不同，從而造成對(duì)藥物敏感性的影響也具有明顯差異[6,13]。本研究中，分離的SG-1菌株對(duì)頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、諾氟沙星、左氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考等藥物敏感，這與國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果基本一致[6,8]。以上研究報(bào)道不僅為魚類細(xì)菌性疾病防治提供了科學(xué)依據(jù)，而且為維氏氣單胞菌感染鯰致病機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究中從患病鯰體內(nèi)分離到1株致病性維氏氣單胞菌，首次人工感染證實(shí)對(duì)鯰、斑馬魚等有致死性。關(guān)于鯰源維氏氣單胞菌致病機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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Isolation,identificationandsusceptibilityofAeromonasveroniifromdiseasednorthernsheatfishSilurussoldatovi

LU Meng-ying1, HU Xiu-cai1, Lü Ai-jun1, SUN Jing-feng1, CHEN Cheng-xun1, WANG Xiao-mei1, YEONG Yiksung1,SONG Ya-jiao2

(1.Tianjin Key Laboraory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2.College of Fisheries, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China)

A bacterial strain, called as strain SG-1, isolated from liver of diseased northern sheatfishSilurussoldatoviwas shaped-rod and gram-negative bacterium by Gram-staining and identified asAeromonasveroniiby morphological, physiological and biochemical characteristics as well as the 16S rDNA gene sequencing and phylogenetic tree analysis. The isolated strain was shown to be characterized by glucose gas production, positive oxidase, nitrate reduction, negative ornithine decarboxylase and hydrogen sulfide. Further fragment size of 16S rDNA sequence amplified by PCR was 1409 bp, and had 99.86% similarity withAeromonasveroniiATCC35624 type strain. Phylogenetic tree analysis revealed that the isolate was clustered withAeromonasveronii. The northern sheatfish and zebrafishDanioreriochalenged withAeromonasveroniihad mortality rate of 100%, showing surface bleeding, anal swelling, and ascites. Susceptibility test showed that the isolate was sensitive to cefixime, cefoperazone, cefotaxime, norfloxacin, levofloxacin, enrofloxacin, and florfenicol, but resistant to amoxicillin, ampicillin, sulfisoxazole, methoxy pyrimidine, and cotrimoxazole.

Silurussoldatovi;Aeromonasveronii; 16S rDNA; phylogenetic tree; susceptibility test

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.05.010

2095-1388(2017)05-0563-05

S917.1

A

2017-01-12

天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(16JCZDJC33500，15JCZDJC34000，15JCZDJC33500)；天津農(nóng)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610061047)；天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(ITTFRS2017009);天津市高等學(xué)?！艾F(xiàn)代水產(chǎn)生態(tài)健康養(yǎng)殖”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(TD12-5018);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31272692)

陸夢(mèng)瑩(1995—)，女，本科生。E-mail：lumyac@163.com

呂愛軍(1973—)，男，教授。E-mail:lajand@126.com