徐一軻,孫愉宸,盛強(qiáng)龍,李宏,馬香,唐燕瓊,劉柱

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維氏氣單胞菌的及敲除菌株減毒活疫苗篩選

徐一軻,孫愉宸,盛強(qiáng)龍,李宏,馬香,唐燕瓊*,劉柱

海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院, 海南 ?？?570228

為篩選維氏氣單胞菌減毒活疫苗，為水產(chǎn)重要細(xì)菌性病害的防控提供新策略，本文通過熒光實時定量PCR檢測三種敲除型菌株、及中毒力相關(guān)基因表達(dá)；并采取腹腔注射法對尼羅羅非魚進(jìn)行野生型及三種敲除型感染，觀察染病羅非魚癥狀，計算累計死亡率及LD50。結(jié)果表明，維氏氣單胞菌野生型與三種敲除型菌株相比，細(xì)菌毒力相關(guān)蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)顯著差異，部分毒力相關(guān)基因顯著下調(diào)；三種敲除型菌株LD50分別增加1.24、5.32和19倍。由此可見，三種敲除型維氏氣單胞菌可作為候選減毒疫苗，下調(diào)顯著的菌株是制備減毒疫苗的首選。

維氏氣單胞菌; 基因敲除; 毒力測定; 減毒疫苗

維氏氣單胞菌（）隸屬氣單胞菌科，氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌[1]，其普遍存在于淡水、污水、土壤乃至海水中[2]。維氏氣單胞菌是一種重要的人、獸及水生生物共患病原菌，可引起羅非魚等多種魚類發(fā)病，導(dǎo)致器官衰竭乃至死亡，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失；還可引起人腦膜炎、敗血癥等[3]。近年的研究表明，污染的家畜肉類、水產(chǎn)品、蔬菜等均為維氏氣單胞菌的重要傳染源，因此一些國家已經(jīng)將其作為水體質(zhì)量和食品安全的檢疫對象[4,5]。目前對維氏氣單胞菌尚缺乏有效的防治辦法，主要依賴抗菌藥物等，導(dǎo)致耐藥性病原菌的形成、藥物殘留、環(huán)境污染等諸多弊端，而疫苗則是解決此類問題的有效途徑之一。常用的疫苗種類包括減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗等，其中減毒活疫苗具有保護(hù)力強(qiáng)、保護(hù)時間長、成本低廉、易于生產(chǎn)等優(yōu)點，因此選擇使用基因工程的方法構(gòu)建維氏氣單胞菌減毒活疫苗。

反式翻譯系統(tǒng)是細(xì)菌中普遍存在的核糖體拯救機(jī)制，其核心分子為轉(zhuǎn)移-信使RNA（Transfer-messenger RNA，）和Small protein B（），前者為包含tRNA樣結(jié)構(gòu)域（TLD）以及編碼8-35個氨基酸短肽的信使樣結(jié)構(gòu)域（MLD）的小分子RNA[6]，后者是一種特異性親和的小RNA結(jié)合蛋白。反式翻譯系統(tǒng)一方面可以釋放滯留的核糖體，以保證細(xì)胞的正常生理活性，另一方面可以在未完成正常翻譯的肽段后端添加標(biāo)記肽，使其被水解酶識別并降解[7]。由于反式翻譯系統(tǒng)對細(xì)菌的生存具有重要意義，因此選擇了及作為構(gòu)建減毒活疫苗的候選基因。

(Host Factor for RNA Phage Qβ)是細(xì)菌中普遍存在的RNA伴侶蛋白[8]。是一個全局性調(diào)控因子，在細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮著巨大的作用。有研究表明對細(xì)菌的生長、運動能力、基因的整體表達(dá)、生物膜的形成及毒力均有重要影響[9]。多種革蘭氏陰性致病菌，如流產(chǎn)布魯桿菌（）、沙門氏菌（spp）和霍亂弧菌（），其缺失突變株感染小鼠時表現(xiàn)毒力減弱[10-14]。

為了篩選用于制備維氏氣單胞菌減毒活疫苗的潛在菌株，以本實驗室先前制備的維氏氣單胞菌、及敲除株為研究對象，通過實時定量PCR檢測其毒力相關(guān)基因的表達(dá)變化，并通過腹腔注射尼羅羅非魚，測定其半致死濃度（LD50），評價其免疫效果。本研究的結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)研制高效、安全的維氏氣單胞菌減毒活疫苗奠定了理論基礎(chǔ)，對于嚴(yán)重危害水產(chǎn)的細(xì)菌性病害的防治具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

尼羅羅非魚魚苗及飼料購自海南寶路水產(chǎn)科技有限公司，維氏氣單胞菌菌株（C4）野生型、敲除型、敲除型以及敲除型由本課題組自行分離、制備并保存。

1.2 敲除型菌株驗證

解凍維氏氣單胞菌C4野生型、敲除型、敲除型以及敲除型后，直接接種于添加了氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板中，30 ℃過夜活化。長出菌落后分別隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗證菌株，使用的引物為本課題組自行設(shè)計的維氏氣單胞菌特異性引物以及、和的敲除型驗證引物（表1）。

表 1 各敲除型驗證引物及維氏氣單胞菌特異性引物

1.3 熒光實時定量PCR

表 2 熒光實時定量PCR檢測的基因及其引物

選取維氏氣單胞菌中18個毒力相關(guān)基因，設(shè)計相應(yīng)的實時定量PCR引物（表2）。提取維菌野生型及各敲除型的總RNA，采用TaKaR公司生產(chǎn)的反試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到模板cDNA，利用TaKaRa公司生產(chǎn)的TB Green染料，通過嵌合熒光法進(jìn)行檢測。使用儀器為羅氏（Roche）公司的LightCycler?96qPCR儀。使用“相對表達(dá)量=2-ΔΔCq”公式計算得到各基因的表達(dá)變化，并且使用GraphPad prism7.0進(jìn)行作圖以及校驗。

1.4 尼羅羅非魚注射感染維氏氣單胞菌

采用腹腔注射方式對尼羅羅非魚（）魚苗進(jìn)行維氏氣單胞菌感染。首先，將各菌種活化后以0.02 OD/mL接種于添加了氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)20 h達(dá)到穩(wěn)定期后，收集菌體并用生理鹽水配制成濃度分別為109cfu/mL、108cfu/mL、107cfu/mL的菌懸液。然后，以體重為1 g的羅非魚魚苗為實驗對象，向每條魚體內(nèi)各注射10 μL的菌懸液，并置于容積60 L的玻璃缸中養(yǎng)殖，水溫控制在26~28 ℃，每天投喂魚苗專用粉劑飼料2次，每隔2 d換水1次。感染后首日每隔1 h觀察一次羅非魚發(fā)病或死亡情況，之后每隔1日觀察記錄1次，并及時撈出死魚。持續(xù)觀察1周。

1.5 半致死濃度（LD50）的測定

羅非魚魚苗被感染后，觀察1周記錄累積死亡率，并且利用改良寇氏法計算維氏氣單胞菌野生型及各敲除型的半致死濃度（LD50）[15]。比較LD50以驗證各菌株毒力的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型及敲除型菌株驗證

使用維氏氣單胞菌特異性引物以及各敲除型驗證引物驗證菌株。圖1A為維氏氣單胞菌敲除型驗證，1~6泳道為野生型，7~12泳道為敲除型，從條帶可以看出敲除型比野生型減少了約400 bp，證明敲除成功。圖1B為維氏氣單胞菌敲除型驗證，1~6泳道為野生型，7~12泳道為敲除型，結(jié)果顯示敲除型比野生型減短了約500 bp，證明敲除成功。圖1C則為對圖1A、B中24個菌株的維氏氣單胞菌特異性引物驗證結(jié)果，結(jié)果顯示24株菌均為維氏氣單胞菌。圖1D為對維氏氣單胞菌敲除型驗證，1、2泳道為野生型，3、4泳道為敲除型，可以看出敲除型較野生型減短了約500 bp，證明敲除成功，5~8泳道則為維氏氣單胞菌特異性引物驗證，證明得到1~4泳道的4株菌均為維氏氣單胞菌。

2.2 熒光實時定量PCR檢測毒力相關(guān)基因表達(dá)

實時定量PCR結(jié)果表明，與維氏氣單胞菌野生型相比較，敲除型菌株中，氣溶素（Aerolysin）與III型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白表達(dá)極顯著地上調(diào)，而彈性蛋白酶（Elastase）表達(dá)極顯著地下調(diào)（圖2）；在敲除型菌株中僅檢測到上調(diào)的毒力及相關(guān)基因，包括氣溶素（Aerolysin）、外膜蛋白、外膜蛋白組裝因子、RNA結(jié)合蛋白、應(yīng)激保護(hù)蛋白、應(yīng)激蛋白（圖3）；而在敲除型菌株中同時檢測到上調(diào)和下調(diào)的毒力基因，其中，氣溶素（Aerolysin）、III型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白及，多重耐藥性調(diào)控蛋白均極顯著上調(diào)，而脂肪酶、外膜蛋白、應(yīng)激蛋白等基因的表達(dá)量明顯下調(diào)（圖4）。

圖 2 維氏氣單胞菌smpB敲除型中差異變化極顯著的基因?qū)崟r定量PCR結(jié)果

*：=0.05；**：=0.01 (下同）

Fig.2 The Quantitative Real-time PCR results fromΔ

*:=0.05；**:=0.01 （The same as follows）

圖 3 維氏氣單胞菌tmRNA敲除型中差異變化顯著的基因?qū)崟r定量PCR結(jié)果

圖 4 維氏氣單胞菌hfq敲除型中差異變化顯著的基因?qū)崟r定量PCR結(jié)果

2.3 菌株半數(shù)致死量（LD50）測定

圖 5 各菌株腹腔注射羅非魚后的累計死亡率

經(jīng)過改良寇氏法計算得到，維氏氣單胞菌野生型的半致死濃度為1.41×107cfu/mL（圖5A）；維氏氣單胞菌敲除型的半致死濃度為3.16×107cfu/mL（圖5B），與野生型相比毒力下降了2.24倍；維氏氣單胞菌敲除型的半致死濃度為8.91×108cfu/mL（圖5C），與野生型相比毒力下降了6.32倍；維氏氣單胞菌敲除型菌株的半致死濃度為2.82×108cfu/mL（圖5D），與野生型相比毒力下降了20倍。

3 討論

目前，國內(nèi)最近幾年由維氏氣單胞菌感染引起水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的報道逐年增多，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失；同時在公共健康領(lǐng)域關(guān)于維氏氣單胞菌的報道也逐年增多，尤其以腹瀉和肺炎等病例為甚。根據(jù)中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫（CNKI）的數(shù)據(jù)，2001年至2015年間國內(nèi)分離并報道的維氏氣單胞菌病例呈現(xiàn)逐年上升趨勢，如2011年廣東省某鯰魚養(yǎng)殖場爆發(fā)的潰瘍綜合征、2014年8月四川雅安某水庫加州鱸魚的大面積死亡等，經(jīng)過分離鑒定其優(yōu)勢菌株均為維氏氣單胞菌[16]。因此無論是從水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，還是公共衛(wèi)生安全角度出發(fā)，維氏氣單胞菌的防治都應(yīng)該被重視。本實驗探索通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建維氏氣單胞菌的減毒株，并且取得了一定的成效，為以后維氏氣單胞菌疫苗的研發(fā)提供了理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

減毒活疫苗可以引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，刺激特異性的記憶B細(xì)胞和T細(xì)胞的產(chǎn)生，使機(jī)體獲得長期或終生保護(hù)作用。與滅活疫苗相比，減毒活疫苗具有免疫力強(qiáng)、作用時間長的優(yōu)點。減毒活疫苗發(fā)展初期主要由物理和化學(xué)方法制備而成[17]。而隨著近年來分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因工程已經(jīng)成為更加精準(zhǔn)和便捷的減毒活疫苗制備方法。本實驗旨在通過敲除反式翻譯拯救系統(tǒng)的核心元件和，以及起到廣泛調(diào)控作用的RNA結(jié)合蛋白，篩選可用于研發(fā)有效減毒疫苗的潛在菌株。一方面通過實時定量qPCR驗證相應(yīng)基因敲除后，包括氣溶素（Aerolysin）、耐熱溶血素（Thermostable hemolysin）、脂肪酶（Lipase）、彈性蛋白酶（Elastase，），以及外膜蛋白、應(yīng)激蛋白、III型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白、多重耐藥性調(diào)控蛋白等毒力相關(guān)基因的表達(dá)情況；另一方面通過注射感染羅非魚，測定LD50的變化情況。本研究結(jié)果表明，氣溶素（Aerolysin）的表達(dá)在各敲除型菌種均明顯上調(diào)，但是注射結(jié)果卻均顯示LD50呈現(xiàn)不同程度的下降。在維氏氣單胞菌敲除型中，僅檢測到3個毒力基因的表達(dá)發(fā)生了顯著性變化，相應(yīng)地其毒力也僅下降2.24倍；而敲除型中，具有顯著差異的基因表達(dá)量均為上調(diào)，但是注射羅非魚后的LD50卻下降6.32倍，這些結(jié)果表明反式翻譯系統(tǒng)核心元件和可能對于維氏氣單胞菌的毒力影響不大。敲除型中，較多毒力相關(guān)基因的表達(dá)量均發(fā)生變化，并且LD50下降了20倍，表明可以對維氏氣單胞菌的毒力產(chǎn)生顯著影響。本研究所檢測毒力相關(guān)基因表達(dá)量變化趨勢與相應(yīng)菌株LD50的變化趨勢看上去不一致，這可能是由于本研究檢測的毒力相關(guān)基因有限所導(dǎo)致的。這樣的結(jié)果暗示，細(xì)菌的毒力受到十分復(fù)雜的因素影響，可能包括我們所檢測的毒力相關(guān)基因以外的其他更復(fù)雜的生物途徑，僅通過檢測有限基因的表達(dá)量變化可能并不能真實反映細(xì)菌毒力水平?；诒狙芯康慕Y(jié)果，敲除型表現(xiàn)減毒效果最佳，證明了其具有進(jìn)一步研發(fā)作為減毒活疫苗的潛力。

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Screening out Live Attenuated Vaccine fromStrain withoutor

XU Yi-ke, SUN Yu-chen, SHENG Qiang-long, LI Hong, MA Xiang, TANG Yan-qiong*, LIU Zhu

570228,

In order to screen out live attenuated vaccines fromso as to provide a new strategy for controlling against bacterial diseases of aquatic products, toxic gene expressions ofstrainsdeletedorwere detected by Quantitative Real-time PCR. The symptom, accumulative death rate and LD50 of the wildandsome infected with deleted strains by Intraperitoneal injection were recorded or calculated. The resulted showed there were significant differences among bacterial toxicity relative protein expressions of three deleted strains and wildsome of them obviously went down, LD50 of three strains added up to 1.24, 5.32 and 19 times, respectively. Therefore the deletedstrains could be developed for candidates of attenuated vaccines,strain was a first choice.

; gene deletion; toxicity detection; attenuated vaccine

S943

A

1000-2324(2019)02-0186-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.02.002

2018-05-12

2018-08-20

國家自然科學(xué)基金項目(31560021;31772887;31860676);海南省自然科學(xué)基金(317015);海南省重點研發(fā)計劃(ZDYF2017020)

徐一軻(1992-),男,碩士研究生,研究方向:農(nóng)業(yè)生物技術(shù). E-mail:xuyike1992@foxmail.com

Author for correspondence. E-mail:tyq68@126.com