曾范利，趙 丹，康元環(huán)，陳 龍，王 惠，單曉楓?，錢(qián)愛(ài)東?

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心，長(zhǎng)春130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130118）

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii，A.veronii）隸屬于氣單胞菌科氣單胞菌屬，廣泛分布于各種水環(huán)境以及土壤中。該菌的毒力有強(qiáng)弱之分，強(qiáng)毒菌株不僅可以感染人，還可以感染包括狐、熊貓等哺乳動(dòng)物以及魚(yú)、蝦、蟹、鱉等多種水生生物，因此，維氏氣單胞菌被認(rèn)為是一種人-獸-魚(yú)共患病原菌［1-5］。該菌可以產(chǎn)生氣溶素、溶血素、胞外蛋白酶等多種毒力因子，其中，氣溶素作為一種溶血性毒素，可以導(dǎo)致多種臟器出血，進(jìn)而引發(fā)感染動(dòng)物死亡，因此，產(chǎn)生氣溶素被認(rèn)為是氣單胞菌具有致病性的重要標(biāo)志之一［6］。

目前，有關(guān)維氏氣單胞菌氣溶素的研究較少，且主要是針對(duì)單一動(dòng)物源性維氏氣單胞菌［7］。因此，本研究對(duì)不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌氣溶素基因（aerA）進(jìn)行了克隆及序列分析，以期為維氏氣單胞菌共同保護(hù)性抗原的篩選、疫苗的制備以及致病機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種 A.veronii ATCC35624（人源）、A.veronii CY0806（框鏡鯉源）、A.veronii NC4122-3（草魚(yú)源）、A.veronii NN725（鲇魚(yú)源）、A.veronii NJ4112-4（鯽魚(yú)源），由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究室保存；A.veronii QXF0711B（青蝦源）由浙江省淡水水產(chǎn)研究所潘曉藝副研究員惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；pMD-18T載體、DL2000 DNA Marker、Hind Ⅲ DNA Marker、ExTaq DNA 聚合酶、EcoRⅠ、HindⅢ購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；RS鑒別培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 aerA基因的克隆 活化不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌，并提取其基因組DNA，以其為模板，用引物P1、P2對(duì)aerA基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5min，34個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNA凝膠回收試劑盒純化回收，純化回收的產(chǎn)物與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，平鋪于含氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)菌落，接種于含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

1.5 重組質(zhì)粒的鑒定與測(cè)序 重組質(zhì)粒DNA以質(zhì)粒小量提取試劑盒提取，并經(jīng)EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送至上海生工科技公司測(cè)序。

1.6 aerA基因的序列分析 應(yīng)用DNAStar Lasergene 7.1、MEGA 5.1、NCBI中的 ORF Finder與 CDD等相關(guān)生物學(xué)軟件對(duì)上述6株不同動(dòng)物源性的維氏氣單胞菌aerA基因序列以及GenBank上的二株維氏氣單胞菌aerA基因序列（登錄號(hào)分別為CP002607.1、EF034117.1）進(jìn)行分析并比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 維氏氣單胞菌aerA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果以不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，在1500 bp處出現(xiàn)與目的片段大小相符的目的條帶（圖1）。

圖1 維氏氣單胞菌aerA基因的PCR擴(kuò)增

2.2 克隆質(zhì)粒的鑒定 提取陽(yáng)性pMD18-T-aerA重組質(zhì)粒，并用EcoRⅠ與HindⅢ雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約1500 bp處可見(jiàn)目的條帶（圖2）。

圖2 pMD18-T-aerA重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.3 維氏氣單胞菌aerA基因結(jié)構(gòu)域分析 利用NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)搜索功能發(fā)現(xiàn)，不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌以及GenBank上的CP002607.1、EF034117.1 aerA基因的核苷酸序列均具有APT Superfamily與Aerolysin Superfamily保守結(jié)構(gòu)域（圖3）。

2.4 維氏氣單胞菌aerA基因序列的同源性分析通過(guò)DNAStar Lasergene 7.1軟件比對(duì)分析不同動(dòng)物源性核苷酸序列及編碼的氨基酸序列，結(jié)果顯示：不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌的aerA基因核苷酸序列同源性均在95.8%以上，其中以ATCC35624與CP002607.1核苷酸序列同源性最高（99.9%），而QXF0711B與CP002607.1、CY0806與EF034117.1核苷酸序列的同源性相對(duì)較低（95.8%），其余核苷酸序列均介于95.8%～99.9%之間（圖4）；各aerA基因編碼的氨基酸序列的同源性均在89.8%以上，其中菌株CY0806的氨基酸序列與其他菌株的同源性均相對(duì)較低（89.8%～91.4%），其余菌株的氨基酸序列的同源性則介于98.0%～99.4%之間（圖5）。

圖3 不同動(dòng)物源性的維氏氣單胞菌aerA基因核苷酸序列的保守結(jié)構(gòu)域

圖4 不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌aerA基因核苷酸序列的同源性比較

圖5 不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌aerA基因編碼的氨基酸序列的同源性比較

2.5 維氏氣單胞菌aerA基因的遺傳演化分析 利用MEGA5.1軟件對(duì)不同動(dòng)物源性的維氏氣單胞菌aerA基因遺傳演化進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：QXF0711B與 EF034117.1處于同一大分支；ATCC35624與CP002607.1親緣關(guān)系較近，處同一小分支，同時(shí)與 NJ4112-4、NN725、CY0806聚為一支，又與NC4122-4共同處于一大分支（圖6）。

3 討論

圖6 不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌aerA基因的進(jìn)化分析

作為一種較為新型的人-獸-魚(yú)共患病原菌，維氏氣單胞菌引發(fā)人與動(dòng)物患病的報(bào)道逐年增多，但有關(guān)該菌的深入研究卻少有報(bào)道，尤其缺少毒力因子與致病機(jī)制的研究。目前已知的維氏氣單胞菌是與其他氣單胞菌成員一樣，可以產(chǎn)生多種毒力因子，其對(duì)其致病性具有重要作用。其中，氣溶素作為氣單胞菌屬中最重要的致病性標(biāo)志之一，可導(dǎo)致感染動(dòng)物全身的廣泛性出血、并致使動(dòng)物死亡［8］。而且，aerA基因在維氏氣單胞菌檢出率也顯著增加：Nawaz等［9］用PCR技術(shù)對(duì)分離的81株維氏氣單胞菌進(jìn)行氣溶素的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有78株攜帶aerA基因；本實(shí)驗(yàn)室也證實(shí)，環(huán)境中維氏氣單胞菌分離株 aerA基因的攜帶率高達(dá) 89.8%（44／49）。因此，較為系統(tǒng)的研究氣溶素對(duì)維氏氣單胞菌的檢測(cè)及防治尤為重要。

本研究首次對(duì)不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌的aerA基因進(jìn)行了比較分析。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，所有序列均具有APT Superfamily與Aerolysin Superfamily保守結(jié)構(gòu)域，它們作為維氏氣單胞菌aerA基因的重要標(biāo)志，在不同維氏氣單胞菌菌株中存在，說(shuō)明aerA基因相對(duì)比較保守，這與其他氣單胞菌對(duì)aerA基因的研究結(jié)果相似［10］。同源性分析結(jié)果證實(shí)，不同維氏氣單胞菌菌株aerA基因的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列同源性均較高，但也存在一定差異，尤其是CY0806株，其aerA基因編碼的氨基酸序列在289位、301位、333位分別多出了L、G、A，這種差異是否會(huì)影響氣溶素的功能以及菌株的毒力仍有待于深入研究。而就本實(shí)驗(yàn)的遺傳演化分析表明，源性不同、地區(qū)差異與aerA基因親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近沒(méi)有太大相關(guān)性，至于什么是影響其親緣關(guān)系的重要因素，仍需要大量菌株進(jìn)一步驗(yàn)證分析。

綜合分析可以看出：不同源性的維氏氣單胞菌氣溶素之間雖然存在一定差異，但其核苷酸序列、氨基酸序列的同源性均較高，且所有基因的核苷酸序列均有APT Superfamily與 Aerolysin Superfamily保守結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明維氏氣單胞菌的氣溶素具有一定的保守性。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果可為維氏氣單胞菌的檢測(cè)及疫苗的研究提供一定的理論依據(jù)。

［1］龔 倩，高淑琴，單曉楓，等.框鏡鯉致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 32（12）：981-983.

［2］潘曉藝，沈錦玉，李建應(yīng)，等.青蝦“軟殼綜合癥”病原及其特性［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2009，36（10）：1571-1576.

［3］Rahman M， Colque-Navarro P， Kuhn I， et al.Identification and characterization of pathogenic Aeromonas veronii biovar sobria associated with epizootic ulcerative syndrome in fish in Bangladesh［J］.Appl Environ Microbiol， 2002， 68 （2）： 650-655.

［4］王意銀，李剛山，朱姝媛，等.維羅納氣單胞菌溫和生物變種分離鑒定及致病性研究［J］.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2011，11（8）：918-919.

［5］李偉杰，趙耘，劉 燕，等.狐貍源致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32（4）：289-292.

［6］吳同壘，單曉楓，孟慶峰，等.維氏氣單胞菌研究進(jìn)展［J］.中國(guó)獸藥雜志，2011，45（7）：41-44.

［7］吳同壘，單曉楓，孟慶峰，等.框鏡鯉維氏氣單胞菌 CY0806株氣溶素基因的生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2011， 33（11）：866-869.

［8］Sung Hung-hung， Hwang Shu-fen， Tasi Fu-ming.Responses of giant freshwater prawn （Macrobrachium rosenbergii） to challenge by two strains of Aeromonas spp.［ J］.J Invertebrate Pathol，2000，76： 278-284.

［9］Nawaz M，Khan S A，Khan A A，et al.Detection and characterization of virulence genes and integrons in Aeromonas veronii isolated from catfish ［J］.Food Microbiol， 2007， 27： 327-331.

［10］Singh V， Somvanshi P， Rathore G， et al.Gene cloning，expression，and characterization of recombinant aerolysin from Aeromonas hydrophila［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2010， 160（7）： 1985-1991.