張亦南，朱宇航，張 超，劉德行，朱昭瓊

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，貴州遵義 563000；2.貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室，貴州遵義 563000)

異氟醚吸入麻醉對大鼠海馬腦源性神經營養(yǎng)因子與Bcl-2表達的影響

張亦南1，2，朱宇航1，2，張 超1，2，劉德行1，2，朱昭瓊1，2

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，貴州遵義 563000；2.貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室，貴州遵義 563000)

異氟醚；海馬；腦源性神經營養(yǎng)因子；Bcl-2

異氟醚(isoflurane，ISO)是臨床常用的吸入麻醉藥之一，其作用于中樞神經系統(tǒng)導致意識障礙、遺忘等確切麻醉效應。但ISO對學習記憶功能是否有影響，以及有怎樣的影響目前仍無法定論。本研究以吸入ISO的大鼠模型為研究對象，從麻醉后海馬內與認知功能密切相關的腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)及B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)分子水平入手，探討ISO對學習記憶的影響，分析其影響是否與海馬內的重要蛋白有著直接或間接的聯(lián)系，為全身麻醉后認知功能障礙的研究提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠與分組 清潔級SD大鼠54只，體質量(360±25)g，分為對照組(n=6)、氧氣(O2)組(n=24)和ISO組(n=24)。根據取材時間不同(6、12、24、72 h)再將O2組和ISO組各分為4個亞組，每組6只大鼠。

表1 大鼠麻醉前后SpO2及呼吸頻率比較

*：P<0.05，與麻醉前比較

1.2方法

1.2.1構建大鼠模型 自制吸入麻醉箱主要由麻醉機、麻醉箱、氣體檢測儀3個部分組成，將麻醉箱連接于麻醉呼吸機螺紋管回路中，麻醉呼吸機工作狀態(tài)為手控模式，調節(jié)排氣閥接近最小壓力，調節(jié)麻醉機ISO揮發(fā)罐輸出濃度為3%行麻醉誘導，麻醉機輸出O2總流量為2 L/min，接氣體監(jiān)測儀監(jiān)測麻醉箱中O2、二氧化碳(CO2)、ISO等氣體的濃度，待大鼠翻正反射消失后調節(jié)ISO揮發(fā)罐至所需要的維持濃度，在此過程中，應用氣體濃度檢測儀對箱內濃度進行檢測，保證箱內濃度的穩(wěn)定性和準確性。3組大鼠均在實驗前進行環(huán)境適應1周，將實驗大鼠每日放入自制的大鼠吸入麻醉箱內15 min，不進行任何處理，以減少活動環(huán)境變化對實驗大鼠的影響。1周后，對照組直接處死留取標本；O2組均給予吸入40% O2和空氣混合氣體1 h；ISO組均應用3% ISO誘導，待翻正反射消失后再吸入1.8% ISO，維持1 h，麻醉過程中吸入40% O2，分別于麻醉前、誘導后、麻醉后30 min、麻醉后60 min、蘇醒即刻觀察大鼠呼吸頻率及經皮血氧飽和度(SpO2)。ISO組和O2組分別于6、12、24、72 h后處死大鼠取標本(各6只)。

1.2.2觀察指標與檢測方法

1.2.2.1大鼠基礎數(shù)據和麻醉中的生命體征 整個實驗過程始終保持環(huán)境溫度在28～30 ℃，濕度50%～80%。麻醉過程中觀察所有實驗大鼠肢端部位、尾部和鼻唇顏色，確定是否出現(xiàn)發(fā)紺等缺氧現(xiàn)象；為避免實驗結果受麻醉缺氧等干擾因素影響，分別于麻醉前、誘導后、麻醉30 min、60 min及蘇醒即刻抽取6只大鼠檢測并記錄其SpO2和呼吸頻率。

1.2.2.2主要觀察指標的檢測 1周適應環(huán)境后，將O2組(n=24)、ISO組(n=24)按上述方法在麻醉箱內吸O2或ISO麻醉，分別于自然清醒6、12、24、72 h后經腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后斷頭取腦，于冰上快速剝離腦組織，取海馬組織稱質量后，按50～100 mg組織加入1 mL Trizol溶液，置入1.5 mL EP管，半定量反轉錄PCR(RT-PCR)法檢測大鼠海馬中BDNF及Bcl-2 mRNA的表達。對照組直接處死(方法和取材同O2組和ISO組)。

2 結 果

2.1大鼠麻醉前后生命特征 所有實驗大鼠在麻醉誘導及維持過程中均無明顯發(fā)紺、缺氧表現(xiàn)，無大鼠死亡。大鼠SpO2測量結果顯示：誘導后、麻醉后30、60 min與麻醉前比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。大鼠呼吸頻率監(jiān)測結果顯示：誘導后、麻醉后30、60 min及蘇醒即刻與麻醉前比較均有不同程度的降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2大鼠海馬BDNF mRNA表達水平比較 ISO組大鼠BDNF mRNA表達水平在12、24 h均低于O2組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。ISO組大鼠BDNF mRNA表達水平在12、24 h均低于對照組(110.27±8.99)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ISO組大鼠海馬BDNF mRNA表達水平隨時間的變化趨勢見圖1。

表2 不同時間點ISO組與O2組大鼠海馬BDMF mRNA表達水平比較

*：P<0.05，與O2組比較

圖1 ISO組大鼠海馬BDMF mRNA表達水平變化趨勢

2.3大鼠海馬Bcl-2 mRNA表達水平比較 與O2組比較，ISO組大鼠Bcl-2 mRNA表達水平在6、12、24、72 h分別有不同程度的下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。大鼠Bcl-2 mRNA表達水平在6、12、24、72 h均低于對照組(118.62±9.31)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ISO組大鼠海馬Bcl-2 mRNA表達水平隨時間的變化趨勢見圖2。

表3 不同時間點ISO組與O2組大鼠海馬Bcl-2 mRNA表達水平比較

*：P<0.05，與O2組比較

圖2 ISO組大鼠海馬Bcl-2 mRNA表達水平變化趨勢

3 討 論

本研究以ISO麻醉大鼠模型為實驗對象。由于按標準夾尾法測定的大鼠ISO最低肺泡有效濃度(MAC)約為1.8%[1]，因此本實驗選取ISO維持濃度為1.8%，并在整個麻醉過程中監(jiān)測麻醉大鼠的生命體征、SpO2和呼吸頻率。結果發(fā)現(xiàn)，麻醉誘導后及麻醉維持階段，大鼠呼吸頻率較麻醉前及麻醉蘇醒時有明顯降低，但整個麻醉過程中均吸入O2和ISO混合氣體，充分供氧后整個過程中SpO2并無大幅度改變，確保實驗大鼠ISO麻醉的安全性，同時對實驗的質量控制提供保障。

BDNF是海馬新突觸發(fā)生、改建及傳遞效能等功能的重要調節(jié)因子，在突觸可塑性的變化中發(fā)揮重要作用[2-3]；而bcl-2是重要的抗凋亡基因，它可穩(wěn)定線粒體，阻斷內質網釋放鈣離子(Ca2+)，調節(jié)線粒體信號分子的轉導，最終中斷DNA凋亡，保護細胞[4]。前者對于促進神經元再生、分化成熟，以及突觸傳遞和可塑性起重要調控作用，后者則是抗神經細胞凋亡的主要參與因子。同時有研究提出，二者聯(lián)系密切，Bcl-2家族的調節(jié)可能是BDNF抵抗神經元凋亡的機制之一[5]。

由此，本研究以吸入ISO全身麻醉大鼠為研究對象，提取吸入ISO后不同時間點大鼠海馬組織，檢測BDNF mRNA、Bcl-2 mRNA水平，結果顯示：相同時間點ISO組與O2組大鼠比較，BDNF mRNA、Bcl-2 mRNA表達水平均有不同程度的降低，其中BDNF mRNA表達水平在麻醉后12、24 h下降明顯，Bcl-2 mRNA表達水平在麻醉后6、12、24、72 h均下降明顯。本研究中設定O2組以避免O2對神經細胞的影響，因此O2濃度與ISO組麻醉過程中的吸氧濃度相同，均為40%，使兩組條件位于同一水平，增加比較的可靠性。此外，為了研究隨時間推移海馬內神經因子的改變，設定對照組并進行比較，結果顯示：BDNF mRNA和Bcl-2 mRNA表達水平均于麻醉后6 h開始下降，72 h開始恢復，不同的是前者于麻醉后12、24 h下降明顯，而后者在麻醉后6、12、24、72 h與對照組比較均明顯降低。根據上述研究結果推測，吸入ISO全身麻醉可能引起海馬內神經突觸發(fā)生一過性改變，同時引發(fā)神經元細胞的凋亡，這與Dalla Massara等[6]的研究結果相似，認為ISO麻醉會導致BDNF和表觀遺傳組蛋白的改變。

影響B(tài)DNF及Bcl-2水平變化的因素有多種。有研究表明，增加體內谷氨酸的成份，可進一步促使組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，t-PA)從神經元細胞突觸前囊泡釋放，使BDNF前體(proBDNF)裂解為成熟的BDNF[7]；上游刺激因子2及甲基化CpG結合蛋白等多種轉錄因子也將對BDNF的轉錄調控發(fā)揮重要功能[8]；BDNF還可能作為一種自分泌激活物，進一步加強自身的活化[9]；同時，當神經細胞因外界因素受到一定損傷時，機體調動內源性保護機制，通過激活Janus蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)通路，抑制半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)而增加Bcl-2的表達。以上因素均可影響B(tài)DNF及Bcl-2在機體中的表達，但其是否在吸入ISO后對BDNF及Bcl-2的恢復起作用，還需進一步研究。

目前研究認為，ISO對大腦的抑制作用主要是抑制突觸前谷氨酸釋放、增強谷氨酸再攝取，以及抑制由N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)介導的興奮性突觸后電位[10-11]。其中，NMDAR為神經元突觸傳遞的長時程增強(long-term potentiation，LTP)的重要離子型通道受體，而LTP則是目前公認的學習、記憶的神經基礎之一，是研究學習與記憶的理想模式，它的激活可進一步激活cAMP反應元件結合蛋白(cAMP responsive element binding protein，CREB)信號傳導通路，調節(jié)BDNF轉錄，直接影響海馬突觸的塑形及功能，而BDNF也能誘導CREB的磷酸化，進一步加強CREB傳導功能，形成正反饋循環(huán)通路[12]。此環(huán)路可增加Bcl-2的合成，進一步影響突觸可塑性和神經元的生存[13]。越來越多的研究證實，腦內BDNF與Bcl-2水平的關系密切[14]。本研究顯示，在吸入ISO 72 h內BDNF和Bcl-2發(fā)生一過性改變，可能進一步抑制CREB傳導通路，最終導致LTP的一過性抑制，進而對大腦的學習記憶功能產生抑制作用。這與Jevtovic-Todorovic等[15]的研究相似，認為新生期大鼠在進行ISO麻醉后，可出現(xiàn)大腦神經元細胞的凋亡并誘導LTP的抑制。此外，Gentry等[16]認為，在新生期接受ISO麻醉后，其認知功能和行為學的改變將持續(xù)至成年。

本研究也存在一定不足，筆者將進一步研究與認知功能相關的其他突觸抑制蛋白，同時選用其他定性、定量的實驗手段，更深入地分析ISO全身麻醉對海馬及認知功能的影響。

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EffectsofisofluraneinhalationanesthesiaontheexpressionsofBDNFandBcl-2inrathippocampus*

ZhangYinan1，2，ZhuYuhang1，2，ZhangChao1，2，LiuDexing1，2，ZhuZhaoqiong1，2

(1.DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalUniversity,Zunyi,Guizhou563000,China；2.GuizhouKeyLaboratoryofBasicResearchforAnesthesiaandOrganProtection,Zunyi,Guiyang563000,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of isoflurane (ISO) inhale anesthesia on the expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and Bcl-2 of hippocampal in rats.MethodsA total of 54 SD rats were divided into 3 groups:control group (n=6),O2group (n=24) and ISO group (n=24).All rats were given 1 week to adapt the environment.Then,rats in the control group were directly sacrificed to collect hippocampi specimens;rats in the O2group inhaled mixed gas containing 40% O2and air for 1 hour;rats in the ISO group anesthetized with 3% ISO and maintained for 1 h with 1.8% ISO after righting reflex disappeared,inhaling 40% O2in the whole process of anesthesia.Respiratory rate and percutaneous oxygen saturation (SpO2) of the rats were observed before anesthesia,after induction,30 min after anesthesia,60 min after anesthesia and at the moment of analepsia,respectively.Rats in the O2group and ISO group were sacrificed to extract hippocampi specimens at 6,12,24 and 72 h after treatment,respectively.The BDNF and Bcl-2 mRNA expression levels in hippocampus of rats were detected using the semi-quantitative reverse transcription PCR (RT-PCR).ResultsCompared to that before anesthesia,the respiratory rates after induction,30 min after anesthesia and 60 min after anesthesia were decreased (P<0.05),while no apparent changes was found in the SpO2(P>0.05).Compared to the O2group,the relative expressions of BDNF mRNA in hippocampi of rats in the ISO group were obviously decreased at 12 and 24 h after the treatment (P<0.05).After anesthesia,the relative expression of BDNF mRNA in rat hippocampus in the ISO group was decreased as time goes on,and the expression levels at 12 and 24 h after the treatment were lower than those in the control group (P<0.05).Compared to the O2group and control group,the relative expression levels of Bcl-2 mRNA in hippocampi of the rats in the ISO group were lower at all time points for detection (P<0.05).ConclusionISO can generate transient inhibition effect on expressions of BDNF and Bcl-2 in hippocampus of rat.

isoflurane；hippocampus；brain-derived neurotrophic factor；Bcl-2

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.29.004

貴州省科學技術基金資助項目(黔科合J字LKZ[2011]29)。

張亦南(1978-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事認知功能及心血管麻醉研究。

目的觀察異氟醚(ISO)吸入麻醉對大鼠海馬腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)及B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)分子表達的影響。方法將54只SD大鼠分為對照組(n=6)、氧氣(O2)組(n=24)和ISO組(n=24)，對照組直接處死留取標本，O2組給予吸入40% O2和空氣混合氣體1 h，ISO組以3% ISO誘導麻醉并以1.8% ISO維持1 h。分別于麻醉前、誘導后、麻醉后30 min、麻醉后60 min、蘇醒即刻觀察大鼠呼吸頻率及經皮血氧飽和度(SpO2)。O2組和ISO組分別于處理后6、12、24、72 h處死大鼠取海馬，采用半定量反轉錄PCR(RT-PCR)檢測海馬BDNF mRNA、Bcl-2 mRNA的表達。結果大鼠呼吸頻率在誘導后及麻醉后30、60 min較麻醉前均有不同程度降低(P<0.05)；SpO2在誘導后、麻醉后30、60 min及蘇醒即刻與麻醉前比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。ISO組大鼠海馬BDNF mRNA表達水平與O2組比較在麻醉后12、24 h降低(P<0.05)；麻醉后ISO組大鼠海馬BDNF mRNA表達水平隨時間呈下降趨勢，在12、24 h明顯低于對照組(P<0.05)。ISO組大鼠海馬Bcl-2 mRNA表達水平在所有時間點均低于對照組與O2組(P<0.05)。結論ISO麻醉可對大鼠海馬BDNF及Bcl-2的表達產生抑制作用。

R614.2

A

1671-8348(2017)29-4044-03

2017-03-22

2017-06-20)