馬亞東,白世安,宋紅雄,強(qiáng)亞勇,胡海峰

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科,延安 716000;*通訊作者,E-mail:wangziming201415@126.com)

miR-106a在腎癌組織中的表達(dá)及對腎癌細(xì)胞系A(chǔ)498增殖的影響

馬亞東*,白世安,宋紅雄,強(qiáng)亞勇,胡海峰

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科,延安 716000;*通訊作者,E-mail:wangziming201415@126.com)

目的 研究miR-106a在腎癌、癌旁正常組織表達(dá)情況及其在腎癌細(xì)胞系A(chǔ)498中的作用。 方法 運(yùn)用real-time PCR檢測33例腎癌及相應(yīng)的癌旁正常組織中miR-106a的表達(dá)，分析其與臨床病理特征的相關(guān)性;在腎癌A498細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-106a過表達(dá)載體及其抑制劑,實(shí)驗(yàn)分為4組:空載體對照組、miR-106a過表達(dá)載體組、陰性對照組、miR-106a抑制劑組;MTT實(shí)驗(yàn)檢測miR-106a對腎癌A498細(xì)胞增殖的影響;應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析miR-106a對細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果 miR-106a在腎癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01),并與腎癌的T分期有相關(guān)性(P<0.05)。miR-106a過表達(dá)載體與空載體對照組相比,促進(jìn)了細(xì)胞增殖,G0/G1期細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.01),S和G2/M期細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01);而miR-106a抑制劑組與陰性對照組相比,細(xì)胞增殖抑制,G0/G1期細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01),S和G2/M期細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.01)。 結(jié)論 miR-106a在腎癌組織中上調(diào),通過促使細(xì)胞進(jìn)入S和G2/M期而促進(jìn)腎癌細(xì)胞分裂、增殖。

miR-106a; 細(xì)胞增殖; 細(xì)胞周期; 腎癌

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,在泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率僅次于膀胱癌位居第二位,占腎臟惡性腫瘤的85%[1]。腎癌的發(fā)病率逐年升高,早期沒有特異性癥狀,許多患者發(fā)現(xiàn)時已進(jìn)入晚期[2]。目前,手術(shù)仍然是腎癌的主要治療方法,而放療、化療和生物靶向治療效果差強(qiáng)人意。因此,加強(qiáng)對腎癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制和早期診斷相關(guān)的分子標(biāo)志物的研究尤為重要。

微小RNAs(microRNAs,miRNAs,miR)是一類高度保守的非編碼單鏈RNA分子,約由21-25個核苷酸組成[3]。miRNAs與靶mRNA特異性地堿基互補(bǔ)配對結(jié)合,促進(jìn)靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯,從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá),參與細(xì)胞存活、增殖、分化、凋亡,機(jī)體的發(fā)育、代謝,及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等多種生物學(xué)過程[4]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,miRNAs會通過調(diào)控與腫瘤相關(guān)的癌基因或抑癌基因的表達(dá)來發(fā)揮其作用[5]。因此,本研究采用real-time PCR方法檢測miR-106a在腎癌組織與癌旁正常對照組織中的表達(dá)情況,在腎癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-106a過表達(dá)載體及miR-106a抑制劑,分析miR-106a對腎癌細(xì)胞增殖的影響,為探索腎癌發(fā)病機(jī)制及診斷治療的研究提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2015-03～2016-05延安大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除的腎癌組織及其相對應(yīng)的癌旁正常組織33對,手術(shù)后均經(jīng)病理檢查確認(rèn)。收集的樣本在液氮中長期保存。采集樣本前經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)以及獲得患者知情同意。人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)498購于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心。

1.2 主要試劑與儀器

1.3 實(shí)時熒光定量PCR(real-time PCR)

將臨床腎癌樣本組織、癌旁正常組織、A498細(xì)胞(分別轉(zhuǎn)染空載體、miR-106a過表達(dá)載體、陰性對照、miR-106a抑制劑)利用RNA提取試劑盒,提取細(xì)胞RNA。分別加入特異性莖環(huán)引物(內(nèi)參U6-RT:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;miR-106a-RT:5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTACCTG-3′),依照試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)錄cDNA,反應(yīng)溫度:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。real-time PCR反應(yīng),按照序列設(shè)計(jì)引物。內(nèi)參U6引物Forward:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,U6引物Reverse:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;miR-106a引物Forward:5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′,Reverse:5′-TGCTAAAAGTGCTTACAGTG-3′。擴(kuò)增條件:95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環(huán),72 ℃延伸5 min終止反應(yīng)。所有樣品均設(shè)立4個復(fù)孔,通過2-ΔΔCt法分析real-time PCR數(shù)據(jù)。腎癌組織中miR-106a相對值>1認(rèn)定為高表達(dá),≤1認(rèn)定為低表達(dá)。分析miR-106a表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。

1.4 構(gòu)建miR-106a過表達(dá)載體及合成其抑制劑

從miRbase數(shù)據(jù)庫獲得hsa-miR-106a的前體序列(5′-CCTTGGCCATGTAAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGCTTTTTGAGATCTACTGCAATGTAAGCAC-TTCTTACATTACCATGG-3′),在兩端分別構(gòu)建EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn),將該序列插入到真核表達(dá)載體pcDNA6.2-GW/EmGFP質(zhì)粒中,再由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行篩選、測序鑒定。miR-106a抑制劑的陰性對照(5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)和miR-106a抑制劑(5′-CUACCUGCACUGUAAGCACUUUU-3′)由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)498細(xì)胞采用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在5%CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期的A498細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組為:空載體對照組、miR-106a過表達(dá)載體組、陰性對照組、miR-106a抑制劑組(僅轉(zhuǎn)染miR-106a抑制劑)。細(xì)胞在培養(yǎng)24 h時,各組依照TurboFect轉(zhuǎn)染說明書瞬時轉(zhuǎn)染。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)檢測miR-106a對A498細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染前24 h以5 000個/孔將A498細(xì)胞種植于96孔板。分別轉(zhuǎn)染空載體、miR-106a過表達(dá)載體、陰性對照、miR-106a抑制劑,每組設(shè)5個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后24，48，72 h分別加入5 mg/ml MTT溶液20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄上清液,活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚,而死細(xì)胞無有活性的琥珀酸脫氫酶,然后加入150 μl DMSO溶解甲瓚,用微板測試儀在490 nm波長處檢測OD值,以此來分析細(xì)胞生長活力。OD值越高表示細(xì)胞的生長活力增加,反之則表示細(xì)胞的生長活力降低。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測miR-106a對A498細(xì)胞周期的影響

上述各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h時收集單細(xì)胞懸液,每組均3個復(fù)孔,預(yù)冷的PBS洗滌,用75%乙醇固定12 h;再加入濃度為100 μg/ml碘化丙啶染液0.5 ml染色,室溫下靜置10 min;采用流式細(xì)胞儀檢測,利用隨機(jī)軟件Modfit LT分析A498細(xì)胞的DNA含量變化,進(jìn)而分析細(xì)胞周期變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腎癌中miR-106a的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

應(yīng)用real-time PCR檢測33對腎癌組織及癌旁正常組織miR-106a的表達(dá)變化。結(jié)果表明,miR-106a在腎癌組織中有24例高表達(dá),9例低表達(dá);統(tǒng)計(jì)分析顯示,與癌旁正常組織相比,miR-106a在腎癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01,見圖1)。miR-106a的表達(dá)與腎癌的T分期有關(guān)(P<0.05),而在不同年齡、性別、組織類型、M分期和N分期等患者中miR-106a表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

圖1 miR-106a在腎癌組織中表達(dá)上調(diào)Figure 1 The miR-106a expression increases in renal carcinoma tissues

表1miR-106a的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Table1CorrelationofmiR-106aexpressionwithclinicopathologicalcharacteristics

臨床病理特征nmiR?106a表達(dá)水平高表達(dá)(n=24)低表達(dá)(n=9)χ2P 年齡03860653 ≥60歲21165 <60歲1284 性別04050518 男23176 女1073 組織類型02160137 透明細(xì)胞癌19145 乳頭狀細(xì)胞癌642 其他類型癌862 T分期53820016 T118117 T2981 T3、T4651 M分期02160252 M020146 M113103 N分期01280376 N024186 N1、N2963

2.2 miR-106a對腎癌A498細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果表明,與空載體對照組相比,miR-106a過表達(dá)載體組miR-106a表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01),上調(diào)至73.62倍;轉(zhuǎn)染抑制劑后miR-106a表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),下調(diào)至0.71倍(見圖2)。應(yīng)用MTT比色法實(shí)驗(yàn)分析miR-106a對腎癌A498細(xì)胞增殖活力的影響，結(jié)果顯示，與空載體對照組相比,miR-106a過表達(dá)載體在轉(zhuǎn)染48,72 h時A498細(xì)胞的增殖活力顯著增強(qiáng),促進(jìn)了細(xì)胞增殖(P<0.01);與陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染miR-106a抑制劑48,72 h時A498細(xì)胞的增殖活力顯著降低,抑制了細(xì)胞增殖(P<0.01,見圖3),這證明miR-106a可促進(jìn)腎癌A498細(xì)胞的增殖。

與空載體對照比較，*P<0.01A.轉(zhuǎn)染miR-106a表達(dá)載體后miR-106a表達(dá) 與陰性對照比較，#P<0.05B.轉(zhuǎn)染miR-106a抑制劑后miR-106a表達(dá)圖2 在腎癌A498細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-106a過表達(dá)載體和抑制劑后miR-106a表達(dá)Figure 2 The miR-106a expression after transcription miR-106a overexpression vector and inhibitor in renal carcinomaA498 cells

同時點(diǎn)與空載體對照組相比,*P<0.01;同時點(diǎn)與陰性對照組相比,#P<0.01圖3 MTT比色法分析miR-106a對A498細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect of miR-106a on the A498 cell proliferation by MTT assay

2.3 miR-106a對腎癌A498細(xì)胞周期的影響

在分別轉(zhuǎn)染miR-106a過表達(dá)載體和抑制劑48 h時,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。miR-106a過表達(dá)載體組與空載體對照組相比,G0/G1期細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.01),S期細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01),G2/M期細(xì)胞數(shù)量也顯著增加(P<0.01);miR-106a抑制劑組與陰性對照組相比,G0/G1期細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01),S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.01),G2/M期細(xì)胞數(shù)量也顯著減少(見圖4)。結(jié)果表明,miR-106a可促進(jìn)腎癌A498細(xì)胞跨過在G0/G1-S期節(jié)點(diǎn),使腎癌A498細(xì)胞進(jìn)入S和G2/M期進(jìn)行分裂和增殖。

與空載體對照組相比,*P<0.01;與陰性對照組相比,#P<0.01圖4 miR-106a對A498細(xì)胞周期的影響Figure 4 Effect of miR-106a on the cell cycle of A498 cells

3 討論

MiRNAs是一類小片段非編碼的單鏈RNA分子。MiRNAs可通過與靶基因的非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶基因的表達(dá)。近年來研究表明,哺乳動物內(nèi)大多數(shù)基因表達(dá)受miRNAs的調(diào)節(jié),miRNAs廣泛參與細(xì)胞存活、生長、發(fā)育、分化、代謝、凋亡等多種生理活動[6]。MiRNAs的表達(dá)異常與胃癌、食管癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[7-9]。例如,miR-19b-1、miR-193b-3p、miR-21、miR-27a、miR-99b-5p等在腎癌中表達(dá)異常,并與腎癌的進(jìn)展相關(guān)[10,11]。近期的研究發(fā)現(xiàn),miR-106a在肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、卵巢癌等多種類型的腫瘤組織中表達(dá)上調(diào),并通過調(diào)控不同的信號通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程。然而,miR-106a在腎癌中的表達(dá)水平及其作用仍不清楚,對miR-106a的研究將加深對腎癌發(fā)病機(jī)制的理解,為腎癌的早期診斷和治療提供新的思路。

本研究發(fā)現(xiàn),與癌旁正常組織相比,miR-106a在腎癌組織中高表達(dá),并與腎癌的T分期相關(guān)。在腎癌細(xì)胞系A(chǔ)498細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中,通過轉(zhuǎn)染miR-106a過表達(dá)載體和抑制劑,進(jìn)一步觀察其對A498細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空載體組相比(排除空質(zhì)粒載體對細(xì)胞的影響),轉(zhuǎn)染miR-106a過表達(dá)載體可促使A498細(xì)胞進(jìn)入S和G2/M期進(jìn)行分裂和增殖;而與陰性對照組相比(由于采用無效的RNA序列,則可排除RNA本身對細(xì)胞的影響),轉(zhuǎn)染miR-106a抑制劑可使A498細(xì)胞阻滯在G0/G1期,抑制了細(xì)胞增殖。從而證明了miR-106a可影響腎癌A498細(xì)胞的生物學(xué)功能,可能與腎癌的發(fā)病機(jī)制及進(jìn)展密切相關(guān)。

腎癌大約占成年人惡性腫瘤3%,并且其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢[12]。腎癌的早期無特異性癥狀,僅有少部分患者會出現(xiàn)腎癌三聯(lián)征(疼痛、血尿、腫塊)。大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)為晚期,且預(yù)后極差。目前影響腎癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未闡明。miRNAs主要是通過作用于下游的靶基因發(fā)揮作用。在非小細(xì)胞肺癌中,miR-106a通過靶向調(diào)控PTEN表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[10]。在結(jié)直腸癌中,miR-106a通過靶向調(diào)控ATG7表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。在胃癌中,miR-106a通過靶向調(diào)控FAS表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞凋亡[13]。下一步將通過生物信息學(xué)工具(miRbase Target,PicTar和TargetScan)預(yù)測miR-106a可能的靶基因,進(jìn)一步研究miR-106a影響腎癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,揭示腎癌進(jìn)展的作用靶點(diǎn)。如能通過miR-106a尋找到腎癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,將可能為腎癌的早期診斷提供分子標(biāo)志物以及治療提供分子靶點(diǎn),從而提高腎癌的早期診斷率及提供更加有效的新治療方案。

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ExpressionofmiR-106ainrenalcancertissuesanditseffectontheproliferationofrenalcancercelllineA498

MA Yadong*,BAI Shian,SONG Hongxiong,QIANG Yayong,HU Haifeng

(DepartmentofUrology,AffiliatedHospitalofYan’anUniversity,Yan’an716000,China;*Correspondingauthor,E-mail:wangziming201415@126.com)

ObjectiveTo investigate the expression of miR-106a in human renal cancer tissues and its role in renal cancer cell line A498.MethodsThe miR-106a expression was detected in 33 cases of renal cancer by real-time PCR. The correlation of miR-106a expression with clinicopathological characteristics was analyzed. MiR-106a overexpression vector and miR-106a inhibitor were transfected into A498 cells. A498 cells were divided into four groups: empty vector control group, miR-106a overexpression vector group, negative control group and miR-106a inhibitor group. The proliferation of A498 cells was examined by MTT assay.The effect of miR-106a on the cell cycle of A498 cells was observed by flow cytometer.ResultsThe expression of miR-106a was significantly up-regulated in renal cancer tissues(P<0.01). High miR-106a expression was associated with T stage(P<0.05). Compared with empty vector control group, A498 cell proliferation was promoted in miR-106a overexpression vector group, the proportion of G1/G0phase cells was decreased(P<0.01), and the proportion of S and G2/M phase cells was increased(P<0.01). Compared with negative control, miR-106a inhibitor suppressed A498 cell proliferation, increased the proportion of G1/G0phase cells(P<0.01), and decreased the propor-tion of S and G2/M phase cells(P<0.01).ConclusionThe expression of miR-106a may increase in renal cancer tissues, and promote the division and proliferation of renal cancer A498 cells through driving cells into S and G2/M phases.

miR-106a; cell proliferation; cell cycle; renal cancer

R737.11

A

1007-6611(2017)09-0935-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.015

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81660492);陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014JM4122)

馬亞東,男,1975-04生,博士,副主任醫(yī)師,講師,E-mail:wangziming201415@126.com.

2017-06-14