陸蔚天,孫善全,許士葉,黃 娟*
(1重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心,重慶 400016;2重慶醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:huangjuan@cqmu.edu.cn)
IGF-1對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細胞凋亡的保護作用及其機制
陸蔚天1,2,孫善全1,2,許士葉1,2,黃 娟1,2*
(1重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心,重慶 400016;2重慶醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:huangjuan@cqmu.edu.cn)
目的 探討胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)對β-淀粉樣蛋白25-35(amyloid-beta protein,Aβ25-35)誘導(dǎo)PC12細胞凋亡的保護作用及可能的信號機制。 方法 以10 μmol/L Aβ25-35處理PC12細胞作為阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)細胞模型。實驗分為對照組、Aβ25-35處理組、IGF-1+Aβ25-35處理組。條件孵育24 h,采用噻唑藍比色法(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)檢測細胞存活率,Western blot檢測各組細胞磷酸化-Akt(phospho-Akt,p-Akt)蛋白表達水平。 結(jié)果 MTT法檢測顯示,10 μmol/L Aβ25-35孵育24 h,PC12細胞存活率為(39.8±3.7)%,與對照組[(100.0±2.3)%]相比顯著下降(P<0.05)。IGF-1+Aβ25-35處理組,PC12細胞存活率為(56.4±4.2)%,與Aβ25-35處理組[(39.8±3.7)%]相比顯著增高(P<0.05)。Western blot顯示,IGF-1+Aβ25-35處理組p-Akt蛋白表達水平(0.794±0.037)高于Aβ25-35處理組(0.493±0.050),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 IGF-1能抑制Aβ25-35所導(dǎo)致的PC12細胞凋亡,其保護作用可能與上調(diào)Akt磷酸化的表達有關(guān)。
胰島素樣生長因子1; 淀粉樣蛋白; 細胞凋亡; PI3K-Akt信號通路
阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種常見的漸進性、不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。由淀粉樣蛋白(amyloid-beta protein,Aβ)聚集在神經(jīng)元外形成的老年斑是AD最明顯的病理特征之一。已有的大量研究表明,Aβ可導(dǎo)致AD患者腦內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、神經(jīng)元凋亡等諸多不良后果[1,2]。淀粉樣蛋白25-35位的氨基酸序列(Aβ25-35)是Aβ產(chǎn)生神經(jīng)毒性的必要結(jié)構(gòu)[3]。用Aβ25-35處理細胞或者動物,可誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細胞凋亡,并引起動物出現(xiàn)認知功能障礙等AD特征性表現(xiàn)[4,5]。因此,闡明Aβ對AD神經(jīng)毒性的發(fā)生機制,并探尋有效應(yīng)對Aβ毒性作用的可靠對策,成為預(yù)防和治療AD的關(guān)鍵所在。胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor 1,IGF-1)是胰島素家族的成員之一,與胰島素在分子結(jié)構(gòu)和功能上具有高度同源性。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),IGF-1作為重要的神經(jīng)調(diào)節(jié)因子,參與調(diào)節(jié)細胞發(fā)育存活、能量代謝和學(xué)習(xí)記憶等重要生理過程[6]。已有研究表明,IGF-1可以通過加快清除腦內(nèi)Aβ,緩解記憶障礙等,從而對AD發(fā)揮保護作用[7-9]。但是,目前對于IGF-1通過哪些信號通路發(fā)揮AD細胞保護作用仍在研究之中。因此,本實驗以Aβ25-35處理PC12細胞制作AD細胞模型,并探討IGF-1對Aβ25-35所致PC12細胞凋亡的保護作用及潛在作用機制。
1.1 細胞株及主要試劑
1.2 細胞培養(yǎng)
細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2-3 d傳代1次。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。實驗分為3組:對照組、Aβ25-35組(加入終濃度為10 μmol/L的Aβ25-35處理)、IGF-1+Aβ25-35組(加入終濃度為100 ng/ml的IGF-1和10 μmol/L的Aβ25-35共同處理)。條件培養(yǎng)24 h,進行后續(xù)檢測。
1.3 MTT法檢測細胞存活率
將細胞按1×105個/ml濃度接種于96孔板,每孔100 μl,對照組加入等量培養(yǎng)液,每組設(shè)5個復(fù)孔。終止培養(yǎng)前4 h每孔加入5 mg/ml的MTT10 μl,置于培養(yǎng)箱37 ℃孵育4 h。去除上清,每孔加入150 μl DMSO,充分吹打甲臜結(jié)晶后置于搖床混勻10 min,用酶標(biāo)儀檢(BIO-RAD Model)檢測每孔細胞A450 nm處吸光度值。以對照組吸光度為100%,其余實驗組細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。
1.4 Western blot檢測蛋白表達
棄去培養(yǎng)液,用4 ℃的PBS洗滌細胞2次。加入Western細胞裂解液吹打細胞。收集細胞,10 000×g離心5 min。采用BCA法進行蛋白定量。取等量蛋白(20 μg)進行10%的聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE),100 V恒壓電泳1 h,350 mA轉(zhuǎn)膜56 min,5%脫脂奶粉封閉30 min,加入小鼠抗大鼠一抗(1 ∶1 000)4 ℃過夜,PBST洗3次,每次10 min;加入羊抗小鼠二抗(1 ∶1 000)37 ℃孵育60 min,PBST洗3次,每次10 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的DAB顯色。用Quantity one軟件測定各組目的蛋白條帶的灰度值,用p-Akt/Akt條帶比值作為蛋白相對值。
1.5 統(tǒng)計學(xué)分析
2.1 IGF-1抑制Aβ25-35對PC12細胞誘導(dǎo)的細胞凋亡
用10 μmol/L的Aβ25-35孵育24 h,PC12細胞存活率為(39.8±3.7)%,與對照組[(100.0±2.3)%]相比顯著下降(P<0.05)。同時給予100 ng/ml IGF-1和10 μmol/L Aβ25-35處理后,細胞存活率為(56.4±4.2)%,與單獨Aβ25-35處理組[(39.8±3.7)%]相比,細胞存活率升高(P<0.05,見圖1)。
與對照組相比,*P<0.05;與Aβ25-35組相比,#P<0.05圖1 IGF-1抑制Aβ25-35對PC12細胞誘導(dǎo)的細胞凋亡Figure 1 IGF-1 inhibited the Aβ25-35-induced apoptosis of PC12 cells
2.2 IGF-1促進Aβ25-35所致PC12細胞損傷模型中Akt的磷酸化
對照組PC12細胞p-Akt表達水平較低(0.307±0.037),Aβ25-35處理后,PC12細胞p-Akt相對表達量升高(0.493±0.050),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。IGF-1+Aβ25-35組PC12細胞p-Akt表達水平最高(0.794±0.037),與Aβ25-35組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。
與對照組相比,*P<0.05;與Aβ25-35組相比,#P<0.05圖2 免疫印跡檢測p-Akt蛋白在各組中的表達Figure 2 Expression of p-Akt protein in PC12 cells by Western blot
在眾多導(dǎo)致AD的因素中,Aβ聚集形成淀粉樣變性(amyloidosis)是目前公認的最為關(guān)鍵的一個致病因素。Aβ可以引起AD患者腦內(nèi)突觸功能障礙、神經(jīng)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元丟失和認知障礙等后果。AD患者腦內(nèi)Aβ過度聚集并且在神經(jīng)元外沉積形成老年斑,是AD特征性標(biāo)志之一[10]。本研究采用淀粉樣蛋白神經(jīng)毒性片段Aβ25-35處理PC12細胞建立AD細胞模型,并用IGF-1干預(yù),以探討IGF-1對AD的保護作用及可能機制。本實驗中,加入10 μmol/L的Aβ25-35處理后,與對照組相比,PC12細胞存活率顯著下降,結(jié)果證實Aβ25-35對PC12細胞生長具有抑制作用,采用Aβ25-35處理可作為AD的細胞模型。
在腦內(nèi),IGF-1通過廣泛表達于大、小鼠皮質(zhì)、海馬、間腦和嗅球等部位的IGF-1受體發(fā)揮作用[8]。研究顯示,IGF-1能夠促進神經(jīng)細胞的增殖及存活,對細胞具有保護作用[11,12]。本研究中,加入IGF-1處理可以顯著減少Aβ25-35對PC12細胞造成的細胞凋亡,結(jié)果提示IGF-1對PC12細胞發(fā)揮保護作用。研究顯示IGF-1通過與IGF-1受體結(jié)合后可激活磷脂酰肌醇3-羥基激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt等下游信號通路以發(fā)揮神經(jīng)保護作用。PI3K-Akt組成的信號通路是細胞內(nèi)的一條重要信號通路,可以調(diào)節(jié)與細胞生長、分化與遷移及凋亡等重要過程中基因的表達,并啟動下游級聯(lián)系統(tǒng)[12]。研究顯示,IGF-1可以激活PI3K信號通路,從而磷酸化目的分子Akt,磷酸化的Akt激活或抑制下游靶蛋白,如葡萄糖合成激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3β)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、Bad、caspase-9等,參與介導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運、脂肪和蛋白合成,進而調(diào)控細胞存活與分化、血管生成和能量代謝等重要過程[13-15]。
已有研究提示,PI3K-Akt信號通路可能通過以下多種機制參與調(diào)控細胞凋亡:①抑制Forkhead box O磷酸化及向細胞核的轉(zhuǎn)移,從而阻止FOXO調(diào)控促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄[15]。②Akt磷酸化后抑制促凋亡蛋白家族成員Bad的活性[16]。③可通過阻止Bax轉(zhuǎn)移至線粒體,以減少細胞色素C的釋放,從而達到細胞保護的作用[17]。④該通路可抑制GSK-3β活性,抑制糖原合成,減少具有神經(jīng)毒性tau的磷酸化,從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[18]?,F(xiàn)有研究表明,體內(nèi)多種分子如表皮生長因子、IGF-1R等可通過刺激PI3K-Akt信號通路來調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活及死亡。研究顯示,若細胞內(nèi)、外因素刺激干擾IGF-1信號,可引起PI3K通路轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂,導(dǎo)致出現(xiàn)Aβ沉積、tau過度磷酸化、氧化應(yīng)激,甚至神經(jīng)元凋亡等不良后果[18]。本研究結(jié)果顯示IGF-1處理可增加PC12細胞p-Akt的表達,同時顯著抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。據(jù)此推測,IGF-1通過激活PI3K-Akt信號通路,從而發(fā)揮對PC12細胞的保護作用。
綜上所述,本研究結(jié)果顯示IGF-1可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細胞發(fā)生凋亡,其保護作用可能與激活PI3K-Akt信號通路有關(guān)。AD發(fā)生發(fā)展過程中,患者腦內(nèi)IGF-1水平及PI3K-Akt信號通路異常與神經(jīng)元的變性丟失緊密相關(guān)。本研究結(jié)果為進一步開展AD的藥物研發(fā)提供了實驗數(shù)據(jù)。
[1] Minter MR, Taylor JM, Crack PJ. The contribution of neuroinflammation to amyloid toxicity in Alzheimer's disease[J]. J Neurochem,2016,136(3):457-474.
[2] Selkoe DJ, Hardy J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years[J]. EMBO Mol Med,2016,8(6):595-608.
[3] Kowall NW, McKee AC, Yankner BA,etal. In vivo neurotoxicity of beta-amyloid [beta(1-40)] and the beta(25-35) fragment[J]. Neurobiol Aging,1992,13(5):537-542.
[4] Tsai YC, Lee YM, Lam KK,etal. The role of heat shock protein 70 in the protective effect of YC-1 on beta-amyloid-induced toxicity in differentiated PC12 cells[J]. PLoS One,2013,8(7):e69320.
[5] Kim DH, Park SJ, Kim JM,etal. Cognitive dysfunctions induced by a cholinergic blockade and Aβ 25-35 peptide are attenuated by salvianolic acid B[J]. Neuropharmacology, 2011, 61(8): 1432-1440.
[6] Frysak Z, Schovanek J, Iacobone M,etal. Insulin-like growth factors in a clinical setting: review of IGF-I[J]. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub,2015,159(3):347-351.
[7] Pascual-Lucas M, Viana da Silva S, Di Scala M,etal. Insulin-like growth factor 2 reverses memory and synaptic deficits in APP transgenic mice[J]. EMBO Mol Med,2014,6(10):1246-1262.
[8] Kleinridders A, Ferris HA, Cai W,etal. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function[J]. Diabetes,2014,63(7):2232-2243.
[9] Westwood AJ, Beiser A, Decarli C,etal. Insulin-like growth factor-1 and risk of Alzheimer dementia and brain atrophy[J]. Neurology,2014,82(18):1613-1619.
[10] Ganguly G, Chakrabarti S, Chatterjee U,etal. Proteinopathy, oxidative stress and mitochondrial dysfunction: cross talk in Alzheimer's disease and Parkinson's disease[J]. Drug Des Devel Ther,2017,11:797-810.
[11] O'Kusky J, Ye P. Neurodevelopmental effects of insulin-like growth factor signaling[J]. Front Neuroendocrinol, 2012,33(3):230-251.
[12] Nieto-Estevez V, Defterali C, Vicario-Abejon C. IGF-I: a key growth factor that regulates neurogenesis and synaptogenesis from embryonic to adult stages of the brain[J]. Front Neurosci,2016,10: 52.
[13] Vazquez de la Torre A, Junyent F, Folch J,etal. PI3 k/akt inhibition induces apoptosis through p38 activation in neurons[J]. Pharmacol Res,2013,70(1): 116-125.
[14] Cheng Z, Tseng Y, White MF. Insulin signaling meets mitochondria in metabolism[J]. Trends Endocrinol Metab,2010,21(10):589-598.
[15] Yin F, Jiang T, Cadenas E. Metabolic triad in brain aging: mitochondria, insulin/IGF-1 signalling and JNK signaling[J]. Biochem Soc Trans, 2013, 41(1):101-105.
[16] Song G, Ouyang G, Bao S. The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival[J]. J Cell Mol Med,2005,9(1):59-71.
[17] Sanderson TH, Kumar R, Sullivan JM,etal. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding[J]. J Neurochem,2008,106(3): 1248-1258.
[18] Zemva J, Schubert M. The role of neuronal insulin/insulin-like growth factor-1 signaling for the pathogenesis of Alzheimer's disease: possible therapeutic implications[J]. CNS Neurol Disord Drug Targets,2014,13(2):322-337.
ProtectiveeffectofIGF-1onAβ25-35-inducedapoptosisofPC12cellsanditsmechanism
LU Weitian1,2,SUN Shanquan1,2,XU Shiye1,2,HUANG Juan1,2*
(1InstituteofNeuroscience,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2DepartmentofHumanAnatomy,ChongqingMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:huangjuan@cqmu.edu.cn)
ObjectiveTo investigate the protective effect of insulin-like growth factor 1(IGF-1) on amyloid-beta protein 25-35 (Aβ25-35)-induced neurotoxicity in PC12 cells and its possible mechanisms.MethodsPC12 cells were treated with 10 μmol/L Aβ25-35to establish the cell model of Alzheimer’s disease (AD). PC12 cells were divided into three groups: control group, Aβ25-35group and IGF-1+Aβ25-35group. After 24 h treatment, the cell viability was detected by MTT assay. The expression of phospho-Akt protein was detected by Western blot.ResultsCompared with control group, the viability in Aβ25-35group was significantly decreased[(100.0±2.3)%vs(39.8±3.7) %,P<0.05]. Meanwhile, the cell viability in IGF-1+Aβ25-35group was significantly higher than that in Aβ25-35group [(56.4±4.2)%vs(39.8±3.7)%,P<0.05]. Western blot results showed that the expression of phospho-Akt in IGF-1+Aβ25-35group(0.794±0.037)was higher than that in Aβ25-35group(0.493±0.050,P<0.05).ConclusionIGF-1 may protect PC12 cells against Aβ25-35-induced apoptosis by up-regulating the expression of phospho-Akt.
insulin-like growth factor 1; amyloid-β protein; apoptosis; PI3K-Akt signaling pathway
R363
A
1007-6611(2017)09-0900-04
10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.007
國家自然科學(xué)基金資助項目(81601051);重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃項目(cstc2016jcyjA0172);重慶市渝中區(qū)科技計劃項目(20140115);重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目(KJ1600222);重慶醫(yī)科大學(xué)國家自然科學(xué)基金預(yù)研資助項目(NSFYY201525)
陸蔚天,男,1979-05生,博士,副教授,E-mail:weitianlu@cqmu.edu.cn
2017-06-08