辛 娜,李敬梅,王永鋒,王 瑤,陳 婕,楊 超,吳躍剛

(1西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科,西安 710077;2西安市華山中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:3150167845@qq.com)

γ-分泌酶抑制劑在哮喘小鼠模型Th17/Treg平衡失調(diào)中的作用

辛 娜1,李敬梅1,王永鋒1,王 瑤1,陳 婕1,楊 超1,吳躍剛2*

(1西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科,西安 710077;2西安市華山中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:3150167845@qq.com)

目的 研究γ-分泌酶抑制劑DAPT對哮喘氣道炎癥、氣道高反應和Th17/Treg失衡的干預作用,為其抗哮喘活性制劑的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。 方法 6-8周雌性C57BL/6小鼠45只被隨機分為對照組,哮喘組和DAPT組,每組15只蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察氣道病理改變,酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞因子和炎性介質(zhì)的水平,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應法(RT-PCR)分析脾臟Foxp3 mRNA的表達。 結(jié)果 DAPT組較哮喘組氣道炎癥明顯減輕,氣道內(nèi)黏液分泌顯著減少。哮喘組IgE、IL-17、IL-10和TGF-β1的含量分別為(695±148)ng/ml,(58±6)pg/ml, (148±12)pg/ml,(18±3)pg/ml; DAPT組IgE、IL-17、IL-10和TGF-β1的含量分別為(486±152)ng/ml,(27±6)pg/ml,(193±17)pg/ml,(33±5)pg/ml。與哮喘組比較,DAPT組氣道灌洗液中IL-17、IgE水平顯著降低(P<0.01),IL-10、TGF-β1水平顯著增加(P<0.01),Foxp3 mRNA的表達也顯著增加(P<0.01)。 結(jié)論 γ-分泌酶抑制劑DAPT具有抗哮喘小鼠Th17/Treg失衡的作用。

支氣管哮喘; Notch信號; γ-分泌酶抑制劑; Th17/Treg失衡; 小鼠

過去幾年,對哮喘患者體內(nèi)Th亞群的研究主要集中在Th1和Th2細胞,普遍認為在哮喘患者中存在Th1/Th2平衡失調(diào)。Th17/Treg細胞平衡是新近發(fā)現(xiàn)的一個重要免疫平衡,該比例失衡在哮喘的發(fā)病機制中起到關(guān)鍵作用。近幾年的研究表明,哮喘患者體內(nèi)存在Th17/Treg功能的失衡,Th17細胞免疫優(yōu)勢反應在哮喘的發(fā)病機制中起到關(guān)鍵作用[1]。對于Th17/Treg免疫失衡的調(diào)節(jié)成為當前治療支氣管哮喘的新策略。Notch信號通路在中樞和外周免疫系統(tǒng)中各種細胞發(fā)展成熟的不同階段,尤其是外周T細胞的分化過程中均發(fā)揮了重要作用[2]。然而,Notch信號通路在哮喘患者Th17/Treg失衡中的確切機制還有待進一步研究。γ-分泌酶是Notch信號通路激活過程中的一個關(guān)鍵因素,γ-分泌酶抑制劑DAPT是Notch信號通路有效的阻斷劑。本研究以BALB/c小鼠哮喘模型,研究DAPT對哮喘氣道炎癥、氣道高反應和Th17/Treg失衡的干預作用。

1 材料和方法

1.1 實驗小鼠

6-8周齡SPF級C57BL/6雌性小鼠,體質(zhì)量為22-25 g,購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心[動物合格證號:SCXK(京)20100008]。

1.2 主要試劑

卵清蛋白OVA(批號:1000739125),氫氧化鋁佐劑(批號:MKBC0615)購自美國Sigma公司。小鼠IL-17、IL-10、TGF-β1、IgE ELISA檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。γ-分泌酶抑制劑DAPT購自上海高創(chuàng)化學科技有限公司。RT-PCR反應引物由廣州行知生物科技有限公司合成。

1.3 哮喘模型建立

雌性C57BL/6小鼠45只被隨機分為正常對照組、哮喘模型組和DAPT組,每組15只。哮喘組、DAPT組小鼠經(jīng)腹腔注射OVA+Al(OH)3混懸液致敏(致敏液為每0.2 ml內(nèi)含100 μg OVA的Al(OH)3PBS溶液)建立哮喘小鼠模型,DAPT組于激發(fā)前30 min經(jīng)氣道給予DAPT(0.3 mg/kg)。正常對照組以生理鹽水代替OVA進行腹腔注射及霧化吸入。

1.4 小鼠肺泡灌洗液采集

各組小鼠末次激發(fā)后24 h脫頸處死小鼠,固定后打開胸腔,分離肺組織,經(jīng)氣管緩慢注射PBS 0.3 ml,回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalverolar lavage fluid,BALF),共3次,回收率超過80%。

1.5 BALF中細胞計數(shù)

將收集到的小鼠BALF 1 200 r/min離心5 min,收集底部細胞沉淀,用0.8 ml D-Hanks液重懸,取0.1 ml采用血細胞計數(shù)儀測定細胞總數(shù),取0.2 ml涂片,瑞氏染色,至少計數(shù)200個細胞作細胞分類計數(shù)。

1.6 ELISA檢測BALF中IgE、IL-17、IL-10和TGF-β1表達水平

實驗參照試劑盒內(nèi)說明書進行,經(jīng)酶標儀檢測OD450值,帶入標準曲線計算實際濃度。

1.7 肺組織病理分析

取小鼠左下葉肺組織制病理切片,HE染色,光學顯微鏡下觀察炎癥及嗜酸性粒細胞浸潤情況。

1.8 Foxp3 mRNA的RT-PCR反應

取小鼠脾臟組織,利用Trizol法提取細胞內(nèi)總RNA,建立RT-PCR反應體系。Foxp3引物序列上游5′-GTG GCC CGG ATG TGT GAA G-3′,下游5′-GGA GCC CTT GTC GGATGA TG-3′;β-actin 上游5′-CCT TCC TGG GCATGG AGT CCT G-3′,下游5′-GGA GCAATG ATC TTG ATC TTC-3′。循環(huán)條件:預變性,95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s,65 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,共40次循環(huán)。將PCR擴增產(chǎn)物10 μl與2 μl上樣緩沖液混合后點樣于2%瓊脂糖凝膠上,在100 V/cm電壓下電泳30 min,立即置于紫外線透射檢測儀下觀察,掃描輸入計算機,然后使用Gel-pro analyzer 軟件進行光密度測量,Foxp3 mRNA條帶的光密度值分別與β-actin條帶的光密度值進行比較,以其比值表示Foxp3 mRNA表達的相對強度。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 DAPT對BALF中白細胞計數(shù)的影響

哮喘模型組小鼠BALF中性粒細胞和嗜酸性粒細胞數(shù)量較正常對照組增加(P<0.01),DAPT組比哮喘模型組明顯減少(P<0.01,見表1),結(jié)果表明DAPT可以明顯減少哮喘小鼠BALF中各類細胞數(shù)。

表1DAPT對哮喘小鼠BALF白細胞的抑制作用

Table1InhibitionofDAPTonnumbersoftotalWBCandleukocytesinBALFinamousemodelofallergicasthma

組別白細胞總數(shù)(×104/ml)嗜酸性粒細胞(×104/ml)淋巴細胞(×104/ml)中性粒細胞(×104/ml)正常對照組 78±15 01±00 28±15 00±00哮喘模型組721±138?428±72?105±27?101±16?DAPT組470±89#291±83# 52±23# 43±18#

與正常對照組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.01

2.2 DAPT對肺組織病理變化的影響

正常對照組氣道周圍組織未見炎細胞浸潤,小鼠氣道上皮光滑平整。哮喘模型組小鼠氣道組織可見大量的中性粒細胞、嗜酸性粒細胞浸潤,DAPT組小鼠肺組織較哮喘組氣道炎癥明顯減弱(見圖1)。結(jié)果表明,DAPT具有抑制過敏原引發(fā)的氣道炎癥和黏液分泌的作用。

A.正常對照組(×400) B.哮喘模型組(×200) C.DAPT組(×400)圖1 HE染色觀察DAPT對小鼠氣道炎癥的抑制作用Figure 1 Inhibition of DAPT on allergic airway inflammation of model mouse by HE

2.3 DAPT對BALF中細胞因子及炎性介質(zhì)的影響

與正常對照組比較,哮喘模型組IL-17、IgE顯著增加(P<0.01),IL-10、TGF-β1水平顯著降低(P<0.01);與哮喘模型組比較,DAPT組IgE水平、IL-17顯著降低(P<0.01),IL-10、TGF-β1水平顯著增加(P<0.01,見表2),結(jié)果表明DAPT可以顯著下調(diào)Th17型細胞因子IL-17及上調(diào)Treg型細胞因子IL-10和TGF-β1。

表2DAPT對哮喘小鼠BALF中細胞因子及炎性介質(zhì)的作用

Table2EffectsofDAPToncytokineandinflammatorymediatorlevelsinBALFinamousemodelofallergicasthma

組別IgE(ng/ml)IL?10(pg/ml)IL?17(pg/ml)TGF?β1(pg/ml)正常對照組135±21198±521±248±5哮喘模型組695±148?148±12?58±6?18±3?DAPT組486±152#193±17#27±6#33±5#

與正常對照組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.01

2.4 DAPT對脾臟Foxp3 mRNA表達的影響

與正常對照組相比,哮喘模型組小鼠脾臟Foxp3 mRNA表達顯著下降(P<0.01)。與模型組比較,DAPT組Foxp3 mRNA表達顯著增加(P<0.01,見表3,圖2)。

表3不同組別小鼠脾臟Foxp3mRNA的相對表達量

Table3TherelativeexpressionofspleenFoxp3mRNAinamousemodelindifferentgroups

組別Foxp3mRNA相對表達量(光密度比) 正常對照組235±043 哮喘模型組038±016? DAPT組183±032#

與正常對照組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.01

圖2 DAPT對哮喘小鼠脾臟Foxp3 mRNA表達的作用Figure 2 Effects of DAPT on the spleen Foxp3 mRNA expression in a mouse model of asthma

3 討論

Th17/Treg細胞平衡是新近發(fā)現(xiàn)的一個重要免疫平衡,Th17細胞是一種輔助性T細胞,其通過產(chǎn)生一種前炎性細胞因子IL-17參與調(diào)控哮喘炎性細胞的浸潤和氣道重塑過程。Treg細胞是一群具有調(diào)節(jié)功能的T細胞,與Th17細胞在功能上存在平衡關(guān)系,該細胞以分泌IL-10及TGF-β1為主要特征,Foxp3蛋白是其主要的轉(zhuǎn)錄因子,功能以調(diào)節(jié)尤其是抑制免疫反應為主。近年來,Th17/Treg比例失衡在哮喘的發(fā)病機制中作用的研究越來越多[3,4]。研究表明哮喘患者體內(nèi)存在Th17/Treg功能的失衡,Th17細胞免疫優(yōu)勢反應在哮喘的發(fā)病機制中起到關(guān)鍵作用,而增強Treg細胞功能則能夠有效抑制Th17細胞的優(yōu)勢反應[5]。

Notch信號通路是目前公認的調(diào)控細胞分化極為重要的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng),是包括細胞增殖、分化和凋亡在內(nèi)的各種細胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者[6]。γ-分泌酶是Notch信號途徑調(diào)節(jié)的核心環(huán)節(jié),γ-分泌酶復合物主要由早老蛋白、Nicastrin蛋白、Pen-2和Aph-1等4種蛋白組成。γ-分泌酶參與了Notch信號途徑的酶解過程,阻斷γ-分泌酶的作用會減少具有活性的Notch胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain,NICD)的產(chǎn)生;由于缺乏NICD,下游信號分子處于靜止狀態(tài),從而使干細胞進入分化程序。DAPT是Notch信號有效的阻斷劑,DAPT通過作用于早老素而抑制γ-分泌酶的作用,從而減少產(chǎn)生NICD。許多研究表明,Notch信號通過調(diào)節(jié)Th1/Th2參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展[7,8]。賈建厚等[9]的研究發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶抑制劑DAPT可有效降低哮喘小鼠肺泡灌洗液中IL-4水平,提升IFN-γ水平,糾正Th1/Th2失衡。然而,Notch信號在哮喘患者Th17/Treg失衡中的作用及機制研究較少。

為了研究Notch信號在哮喘患者Th17/Treg失衡中的作用及機制,筆者以BALB/c小鼠哮喘模型,通過氣道內(nèi)給予Notch信號阻斷劑DAPT阻斷Notch信號通路,收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺組織,計數(shù)支氣管肺泡灌洗液中白細胞總數(shù)及分類;酶聯(lián)免疫吸附法檢測BALF中細胞因子和炎性介質(zhì)的水平;蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察氣道病理改變,RT-PCR方法檢測Treg細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的mRNA表達情況,研究γ-分泌酶抑制劑對哮喘氣道炎癥、氣道高反應和Th17/Treg失衡的干預作用。研究結(jié)果顯示,哮喘模型組IL-17較正常對照組顯著升高,IL-10和TGF-β1較正常對照組顯著減少,提示IL-17促進了中性粒細胞及嗜酸性粒細胞在氣道聚集,從而參與哮喘氣道炎癥的發(fā)生。IL-10和TGF-β1作為Treg型細胞因子,具有抗炎、免疫抑制等作用,其減少表明在哮喘的發(fā)生過程中Treg細胞的免疫抑制作用減弱,Treg不能有效抑制Th17過亢引起的氣道反應性增加,最終加重哮喘,這與目前的研究結(jié)果一致[10]。采用DAPT阻斷Notch信號能明顯抑制IL-17,故推斷DAPT抑制Notch信號能夠干擾IL-17的分泌,IL-17的分泌可能依賴于Notch信號。另外,其他研究通過采用siRNA干擾Notchl基因,發(fā)現(xiàn)特異性抑制Notchl的表達能夠降低極化的人類Thl7細胞中IL-17A和IL-17F的產(chǎn)生[11],這與本研究結(jié)果一致。采用DAPT阻斷Notch信號后,IL-10和TGF-β1水平顯著增加,Foxp3 mRNA的表達也顯著增加。Foxp3是調(diào)節(jié)Treg細胞分泌相關(guān)細胞因子如IL-10和TGF-β1的重要轉(zhuǎn)錄因子,因此DAPT抑制Notch信號可能通過上調(diào)Foxp3的表達逆轉(zhuǎn)Thl7/Treg失衡,由于Treg細胞的調(diào)節(jié)是一個復雜的問題,是通過Notch和TGF-β等多種信號轉(zhuǎn)導通路彼此相互作用完成的[12],具體的分子機制還需要進一步研究。

本研究表明,DAPT能夠顯著地抑制小鼠過敏性氣道炎癥及氣道高反應,說明其具有一定的抗哮喘作用。另外,DAPT顯著地下調(diào)Th17型細胞因子IL-17及上調(diào)Treg型細胞因子IL-10和TGF-β1,同時增加Foxp3 mRNA表達的作用,提示糾正Th17/Treg功能的失衡可能為其抗哮喘的主要機制。但γ-促分泌酶抑制劑還多用于體外試驗及動物實驗階段,篩選出有作用選擇性地能適用于臨床的γ-促分泌酶抑制劑將對哮喘有潛在的治療價值。

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Roleofγ-secretaseinhibitorintheimbalanceofTh17/Treginamouseasthmaticmodel

XIN Na1,LI Jingmei1,WANG Yongfeng1,WANG Yao1,CHEN Jie1,YANG Chao1,WU Yuegang2*

(1DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity,Xi’an710077,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,HuashanCenterHospitalofXi’an;*Correspondingauthor,E-mail:3150167845@qq.com)

ObjectiveTo explore the effects of γ-secretase inhibitor(DAPT) on the airway inflammation, the airway hyperactivity and the imbalance of Th17/Treg in a mouse model of allergic asthma for providing a theoretical basis for the research and development of anti-asthma activity preparations.MethodsForty-five female C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups: control group, asthma group and DAPT group. The pathological changes of lung tissue were analyzed by hematoxylin-eosin staining. Levels of cytokine and inflammatory mediators in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The expression of Foxp3 mRNA in spleen was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsThe airway inflammation and mucus secretion were alleviated in DAPT group compared with asthma group. The contents of IgE, IL-17, IL-10 and TGF-β1in asthma group were (695±148)ng/ml,(58±6)pg/ml,(148±12)pg/ml,(18±3)pg/ml, respectively. The contents of IgE,IL-17,IL-10 and TGF-β1in DAPT group were (486±152)ng/ml,(27±6)pg/ml,(193±17)pg/ml,(33±5)pg/ml, respectively. Compared with asthma group, the levels of IgE and IL-17 were significantly decreased in DAPT group(P<0.01), the levels of IL-10, TGF-β1and the expression of Foxp3 mRNA were significantly increased in DAPT group(P<0.01).ConclusionThe γ-secretase inhibitor DAPT may efficiently regulate the imbalance of Th17/Treg to balance a mouse asthmatic model.

asthma; Notch signal; γ-secretase inhibitor; imbalance of Th17/Treg; mice

R

A

1007-6611(2017)09-0918-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.011

陜西省教育廳專項科研計劃項目(16JK1647)

辛娜,女,1981-09生,碩士,主治醫(yī)師,講師,E-mail:xnr0919@163.com

2017-05-13