魏 明，甘 露，鄧雅婷，李宇金，迪明博

(1西安醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,西安 710021;2陜西省人民醫(yī)院婦科;3西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系;*通訊作者,E-mail:weiming@xiyi.edu.cn)

白藜蘆醇對db/db糖尿病鼠視網(wǎng)膜病變的作用

魏 明1*，甘 露2，鄧雅婷1，李宇金3，迪明博3

(1西安醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,西安 710021;2陜西省人民醫(yī)院婦科;3西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系;*通訊作者,E-mail:weiming@xiyi.edu.cn)

目的 觀察白藜蘆醇對db/db糖尿病鼠視網(wǎng)膜病變的影響。 方法 選用18周齡db/db糖尿病鼠,db/m型同性同窩瘦型鼠為對照。將db/db鼠隨機分為:db/db組,白藜蘆醇高(50 mg/kg)、低劑量(10 mg/kg)治療組,每組6只,藥物連續(xù)灌胃2個月。觀察一般狀態(tài),測空腹血糖3次,視網(wǎng)膜電流圖(ERG)檢測,2個月末處死各組鼠。HE染色觀察視網(wǎng)膜病理改變,Western blot檢測VEGF蛋白表達。 結(jié)果 與db/db組比較,白藜蘆醇治療組血糖水平顯著降低(P<0.05),尤其以高劑量組為著,HE染色db/db組鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜粗糙,厚度變薄,白藜蘆醇治療后顯著改善。與db/db組比較,白藜蘆醇治療組主要表現(xiàn)為暗適應(yīng)3.0反應(yīng)中a波、b波的潛伏期縮短(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示db/db組VEGF蛋白表達顯著升高,但白藜蘆醇治療后表達顯著降低(P<0.05)。 結(jié)論 白藜蘆醇能降低db/db鼠血糖,改善db/db鼠視網(wǎng)膜功能,其機制可能通過下調(diào)血管生成因子VEGF蛋白表達來發(fā)揮作用。

白藜蘆醇; db/db鼠; 糖尿病視網(wǎng)膜病變; VEGF

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)并發(fā)癥中最嚴(yán)重的微血管病變之一,長期慢性高血糖損傷導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織形態(tài)和功能異常,促進新生血管生成。研究表明,影響血管功能的多種細(xì)胞因子,如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),以及低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)在DR時均有明顯提高,對DR眼底血管增生、細(xì)胞凋亡有重要作用,影響著DR的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后,抑制其表達,可以減少DR新生血管的形成,延緩DR的進程。文獻報道,白藜蘆醇(resveratrol,Res)通過抑制血小板聚集合組織因子的表達、促進血管舒張、抑制脂質(zhì)過氧化、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等保護心血管,但目前尚未見其對于治療DR方面的報道。本研究以db/db鼠為模型,觀察白藜蘆醇對DR的保護作用以及對VEGF蛋白表達的影響,為白藜蘆醇的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18周齡雄性db/db鼠,SPF級,體質(zhì)量(54±4)g。BKS-db+/+雄性db/m鼠同窩瘦型鼠為對照,SPF級,體質(zhì)量(24±1)g,購自南京模式動物中心,合格證號SCXK(蘇)2010-0001。鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室,恒溫(22 ℃±2 ℃)、恒濕(55%±5%),照明情況為12 h ∶12 h(光照 ∶黑暗)。每籠6只,實驗期間自由飲水?dāng)z食。

1.2 藥物及儀器

白藜蘆醇購自四川維克奇生物科技有限公司,純度≥98%,批號201004,加生理鹽水配置乳濁液后灌胃。BH-2型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司),Centrifuge 5810R型低溫高速離心機(德國Eppendorf公司),羅氏血糖儀(德國ACCUCHEK Performa公司),7100型全自動生化分析儀(日本日立公司)。

1.3 動物分組及給藥

以db/m鼠為對照,db/db鼠隨機分為db/db組、白藜蘆醇高(50 mg/kg)、低劑量(10 mg/kg)治療組,每組6只,灌胃給藥,每天1次,連續(xù)60 d。

1.4 一般狀態(tài)觀察

觀察鼠活動狀態(tài),記錄鼠平均進食量和飲水量,每2周稱體質(zhì)量1次。

1.5 視網(wǎng)膜組織切片HE染色

db/m鼠為對照,db/db鼠組、db/db鼠白藜蘆醇高、低劑量治療組,每組6只,摘取眼球,制作石蠟切片,觀察視網(wǎng)膜病理組織結(jié)構(gòu)及血管病變情況。具體步驟如下:①固定:0.5%戊巴比妥鈉過量麻醉處死,摘除完整眼球于全眼球固定液中室溫固定24-72 h;②梯度酒精中脫水;③二甲苯溶液透明;④浸蠟;⑤標(biāo)本矢狀位包埋于石蠟中;⑥修塊;⑦用石蠟切片機切5 μm石蠟切片;⑧HE染色。

1.6 空腹血糖(FBG)水平測定

動物分別在實驗的第4,6,8周上午8時開始,禁食6 h,剪尾取血于血糖試紙上,血糖儀檢測并記錄結(jié)果。

1.7 視覺電生理檢查

取db/m組、db/db組和db/db白藜蘆醇高劑量及低劑量治療組,每組各6只,按小動物視覺電生理標(biāo)準(zhǔn)化檢查方案,用RETI-SCAN視覺電生理檢查系統(tǒng)對各組鼠進行ERG檢測。具體步驟如下:將各組鼠置于暗箱中暗適應(yīng)12 h,戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,托吡卡胺散瞳,完全麻醉瞳孔散大后,電極置于視覺電生理檢查專用動物平臺上,安放3根電極,尾部皮下插入接地電極,左側(cè)頰部插入?yún)⒖茧姌O,左眼角膜上放置記錄電極,ERG標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)檢測,由1名視覺電生理檢測經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員統(tǒng)一讀取結(jié)果。

1.8 視網(wǎng)膜組織VEGF蛋白表達檢測

按照db/m鼠組,db/db鼠組、db/db鼠白藜蘆醇高、低劑量治療組,每組3只,摘取眼球,分離視網(wǎng)膜,提取視網(wǎng)膜組織總蛋白,采用Western blot測定各組鼠視網(wǎng)膜組織VEGF蛋白的表達量。具體步驟包括:取材;視網(wǎng)膜總蛋白提取;BCA法蛋白定量上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,孵一抗,孵二抗,化學(xué)發(fā)光,灰度分析。

1.9 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 一般體征的變化

db/m組精神狀態(tài)良好,動作自如。與db/m組比較,db/db組喜靜蜷臥,形體肥碩,行動遲緩,精神萎靡,飲水量、進食量增加,體質(zhì)量顯著增加(P<0.01)。與db/db組比較,白藜蘆醇高劑量組活動增加,進食、飲水量明顯減少,體質(zhì)量無顯著差異。

2.2 視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果

造模及白藜蘆醇治療2個月,麻醉后取各組鼠眼球及視網(wǎng)膜,石蠟切片,進行HE染色。db/m組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜光滑,未見明顯突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞。與db/m組比較,db/db組鼠視網(wǎng)膜組織厚度變薄,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少,內(nèi)界膜粗糙,血管內(nèi)皮細(xì)胞排列雜亂,呈簇狀分布,而白藜蘆醇治療后有顯著改善。

2.3 白藜蘆醇對FBG的影響

給藥2個月后,與db/db組比較,高、低劑量組FBG水平顯著降低(P<0.05),提示白藜蘆醇有一定的降血糖作用,且隨著給藥時間的延長,降血糖作用越顯著,尤以高劑量組為著,第8周與第4周血糖水平有明顯差異(P<0.05,見表1)。

圖1 各組視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)變化(HE,×400)Figure 1 Morphological changes of retinal tissues in each group by HE staining (×400)

組別給藥4周給藥6周給藥8周db/m組7．51±0．9126．31±1．206．85±1．58db/db組28．09±3．44?27．60±2．77?29．24±3．72?高劑量組19．55±3．52#17．72±3．56#14．20±3．26#△低劑量組20．81±4．35#19．20±3．78#18．03±3．60#

與db/m組比較,*P<0.05;與db/db組比較,#P<0.05;同組與第4周比較,△P<0.05

2.4 視覺電生理檢查結(jié)果

為檢測白藜蘆醇對db/db鼠視網(wǎng)膜功能的影響,在給藥50 d對各組鼠進行ERG檢測。暗適應(yīng)3.0反應(yīng)中,與db/m組相比,a波、b波的潛伏期在db/db組明顯延長(P<0.05),而白藜蘆醇治療組和db/m組間則無明顯差異(P>0.05,見表2);四組間的a波幅值沒有差異(P>0.05,見表3);db/db組和db/db治療組的b波幅值明顯大于db/m組(P<0.05),但db/db組與db/db治療組之間的差異無

組別暗適應(yīng)30反應(yīng)暗適應(yīng)30Ops反應(yīng)a波潛伏期b波潛伏期O2波潛伏期db/m組1600±126 8033±4273750±404db/db組2067±378? 10780±1831?4800±283?高劑量組1767±082# 8650±628#4788±427#低劑量組1871±082# 9150±691#4371±427#

與db/m組比較,*P<0.05;與db/db組比較,#P<0.05

統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表3)。暗適應(yīng)3.0 Ops反應(yīng)中,O2子波的潛伏期和幅值在db/db組和白藜蘆醇組之間有明顯差異,與db/m組相比,db/db和db/db治療組均表現(xiàn)為顯著的潛伏期延長、幅值升高。

組別暗適應(yīng)30反應(yīng)暗適應(yīng)30Ops反應(yīng)a波幅值 b波幅值O2波幅值db/m組20920±626040330±109204750±1404db/db組15070±6780?17780±7831? 850±583?高劑量組18067±4482#22650±4680#1988±427#低劑量組17067±3082#21650±3628#1518±427#

與db/m組比較,*P<0.05;與db/db組比較,#P<0.05

2.5 視網(wǎng)膜組織VEGF表達

為檢測db/db鼠及db/db鼠白藜蘆醇治療組視網(wǎng)膜中VEGF表達情況的影響,采用Western blot對各組鼠視網(wǎng)膜組織VEGF蛋白的表達量進行測定。結(jié)果顯示,VEGF蛋白在四組均有表達,其中以db/db鼠組VEGF相對表達最高,白藜蘆醇治療后VEGF表達相對表達量顯著降低,尤其以白藜蘆醇高劑量組為顯著(P<0.05,見圖2)。

與db/m組比較，*P<0.05;與db/db組比較，#P<0.05圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜組織VEGF蛋白表達Figure 2 The expression of VEGF protein in retinal tissues of mice in different groups

3 討論

糖尿病研究多采用人造動物模型,早在20世紀(jì)60年代美國Jackson實驗室在C57BL/Ks(db/db)品系小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了糖尿病突變基因(db),它是位于小鼠4號染色體的瘦素受體基因發(fā)生突變所致。從而確定了該糖尿病小鼠是目前人類2型糖尿病研究適用的動物模型之一。

長期慢性高血糖損傷導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織形態(tài)和功能異常,促進新生血管生成。同時,微循環(huán)障礙可對神經(jīng)視網(wǎng)膜功能產(chǎn)生影響。視覺電生理檢查中的ERG可以反映包括視網(wǎng)膜血管及神經(jīng)組織細(xì)胞在內(nèi)整個視網(wǎng)膜的功能狀態(tài),臨床診療過程中,應(yīng)用ERG檢查發(fā)現(xiàn)即使是輕度的ROP,光感受器細(xì)胞功能也會受到影響,同時視網(wǎng)膜血管及與之聯(lián)系緊密的光感受器后神經(jīng)元也會受累。

根據(jù)國際臨床視覺電生理標(biāo)準(zhǔn)方案,對各組鼠進行了ERG標(biāo)準(zhǔn)5項檢測。其中,暗適應(yīng)0.01反應(yīng)主要反映視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞中視桿細(xì)胞的功能,明適應(yīng)3.0反應(yīng)和明適應(yīng)3.0閃爍光反應(yīng)主要反映視錐系統(tǒng)的功能,暗適應(yīng)3.0反應(yīng)代表視桿和視錐系統(tǒng)的綜合電反應(yīng)。其中a波起源于光感受器細(xì)胞層,代表了外層視網(wǎng)膜的功能;b波主要起源于雙極細(xì)胞,反映了內(nèi)層視網(wǎng)膜的功能情況。暗適應(yīng)3.0 Ops反應(yīng)則與視網(wǎng)膜微循環(huán)的狀態(tài)相關(guān)。

ERG檢查表明,與db/m組相比,db/db組和白藜蘆醇治療組的波形均有明顯異常,波幅顯著下降,說明在視網(wǎng)膜血管病變的前提下,光感受器細(xì)胞、感受器后神經(jīng)元和視網(wǎng)膜微循環(huán)均受到不同程度的損害,整個視網(wǎng)膜功能較差。在血管病變條件下,主要表現(xiàn)為暗適應(yīng)3.0反應(yīng)中a波、b波潛伏期的延長,說明整個視網(wǎng)膜功能進一步下降。其可能的原因為:糖尿病視網(wǎng)膜血管病變,使神經(jīng)細(xì)胞的血供更差,再加上炎癥的作用,使得a波和b波潛伏期延長,而白藜蘆醇通過改善視網(wǎng)膜血管病變,從而改善視網(wǎng)膜功能[8]。

研究表明,VEGF是一種血管生成的刺激因子,刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,對眼部的血管生成起重要的調(diào)節(jié)作用,VEGF能夠特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞,刺激內(nèi)皮細(xì)胞膠原蛋白分泌及細(xì)胞增殖[9]。HIF-1α是在缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生的一種調(diào)節(jié)因子,對缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管的形成起著關(guān)鍵作用,是缺氧信號傳導(dǎo)通路的中的重要因子[10]。研究表明,DR患者在視網(wǎng)膜中VEGF與HIF-1α的表達均有顯著提高,在嚴(yán)重缺氧信號的刺激下,強烈激活HIF-1α信號通路,使促血管生成物質(zhì)釋放更多,血管內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖,形成更多的病理性新生血管[18]。VEGF是HIF-1α信號通路下游的重要分子,具有很強的促血管生成活性,在血管形成中起關(guān)鍵作用。用Western blot對各組視網(wǎng)膜VEGF蛋白表達,發(fā)現(xiàn)第60天時db/db組的VEGF表達高于db/m組,對于糖尿病視網(wǎng)膜病變的加重,可能是炎癥通過加劇第一階段血管閉塞,加重視網(wǎng)膜缺血缺氧,進而上調(diào)VEGF來實現(xiàn)的。而白藜蘆醇通過減弱VEGF的表達改善糖尿病視網(wǎng)膜病變。

本研究證明了白藜蘆醇能降低db/db鼠血糖,改善db/db鼠視網(wǎng)膜功能,其機制可能通過下調(diào)血管生成因子VEGF蛋白表達來發(fā)揮作用，具體的分子機制還有待進一步的研究。該研究結(jié)果將為臨床應(yīng)用白藜蘆醇治療糖尿病視網(wǎng)膜病變提供新的理論依據(jù)。

[1] Shen Z, Huang Y, Hsieh C. Early short-term intensive multidisciplinary diabetes care: a ten-year follow-up of outcomes[J].Diabetes Res Clin Pract,2017, 130 (2): 133-141.

[2] Goutham G, Manikandan R, Beulaja M,etal. A focus on resveratrol and ocular problems, especially cataract: From chemistry to medical uses and clinical relevance[J].Biomed Pharmacother,2017,86 (3): 232-241.

[3] Leon D, Uribe E, Zambrano A,etal.Implications of Resveratrol on Glucose Uptake and Metabolism[J].Molecules,2017,22 (3):45-54.

[4] Attie AD,Churchill GA,Nadeau JH. How mice are indispensable for understanding obesity and diabetes genetics[J].Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes,2017,24 (5) :83-91.

[5] CheungGC, Yoon YH, Chen LJ,etal.Diabetic macular oedema: evidence-based treatment recommendations for Asian countries[J].Clin Exp Ophthalmol, 2017,14 (3):56-65.

[6] Gibbons CH, Goebel-Fabbr A.Microvascular complications associated with rapid improvements in glycemic control in diabetes[J].Curr Diab Rep, 2017,17 (4) :48-54.

[7] Bernardin F, Schwan R, Lalanne L,etal.The role of the retina in visual hallucinations: A review of the literature and implications for psychosis[J]. Neuropsychologia, 2017,99 (6) :128-138.

[8] Abu-Amero KK, Kondkar AA, Chalam KV. Resveratrol and ophthalmic diseases[J].Nutrients,2016,13(8) :200.

[9] Pierce EA, Avery RL, Foley ED,etal. Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor expression in a mouse model of retinal neovascularization[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(3):905-909.

[10] Chen J,Connor KM, Aderman CM,etal. Suppression of retinal neovascularization by erythropoietin siRNA in a mouse model of proliferative retinopathy[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2009,50(3):1329-1335.

Effectsofresveratrolondiabeticretinopathyindb/dbtype2diabeticmice

WEI Ming1*,GAN Lu2,DENG Yating1,LI Yujin3,DI Mingbo3

(1DepartmentofPharmacology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China;2DepartmentofGynecology,ShaanxiProvincialPeople’sHospital;3DepartmentofPharmacy,Xi’anMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:weiming@xiyi.edu.cn)

ObjectiveTo observe the effect of resveratrol on retinopathy of db/db diabetic mice.MethodsThe 18-week-old db/db diabetic mice and db/m mice(control) were chosen. Db/db mice were randomly divided into three groups(n=6 in each group): db/db group, resveratrol high(50 mg/kg) and low dose(10 mg/kg) group. Resveratrol were given for 2 months. The states of mice were observed, the fasting blood glucose level was measured three times, and the retinal current(ERG) was detected. Mice were sacrificed at the end of 2 months. HE staining was used to observe the pathological changes of retina and the expression of VEGF protein was detected by Western blot.ResultsCompared with db/db group, the blood glucose levels were significantly decreased in resveratrol treatment groups(P<0.05), especially in high dose group. The results of HE staining showed that the inner retina was rough and thinning in db/db group, and it was improved significantly in resveratrol groups.Visual electrophysiological test results showed that compared with db/db group, the latency of a wave and b wave was shortened in dark adaptation 3.0 reaction in resveratrol groups(P<0.05). Western blot results showed that the expression of VEGF protein in db/db group was significantly increased compared with control group, but the expression of VEGF was significantly decreased in resveratrol groups.(P<0.05)ConclusionResveratrol can reduce the blood glucose and improve the retinal function in db/db mice, which may be related to the decrease of expression of VEGF protein.

resveratrol; db/db mice; diabetic retinopathy; VEGF

R587.2

A

1007-6611(2017)09-0922-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.012

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目(8140140387)；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項目(2016JM8046，2014JQ2-8055)；陜西省衛(wèi)計委重點項目(2014A)；西安醫(yī)學(xué)院校級重點建設(shè)學(xué)科資助項目(2015097)；西安醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金項目(2016DOC22)

魏明，男，1978-07，博士，講師，E-mail:weiming@xiyi.edu.cn

2017-06-05