陳峰，徐建第*，姜明松，張全芳，朱文銀，李廣賢，周學(xué)標(biāo)，楊連群，

(1.山東省水稻研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100)

利用ARMS-Tm-shift-qPCR技術(shù)檢測(cè)水稻低直鏈淀粉含量基因Wx-mq

陳峰1，徐建第1*，姜明松1，張全芳2，朱文銀1，李廣賢1，周學(xué)標(biāo)1，楊連群1，2

(1.山東省水稻研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100)

Wx-mq基因是水稻低直鏈淀粉性狀控制基因，與米飯食味品質(zhì)密切相關(guān)。本研究根據(jù)水稻控制低直鏈淀粉含量Wx-mq基因第497位存在的G>A單核苷酸變異，將基于SYBR GreenⅠ的ARMS和Tm-shift的兩種實(shí)時(shí)PCR基因分型方法相結(jié)合，建立了可準(zhǔn)確區(qū)分Wx-mq基因第497位的GG純合、AA純合及GA雜合三種類(lèi)型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系。試驗(yàn)表明這種基于SYBR GreenⅠ的ARMS-Tm-shift實(shí)時(shí)PCR基因分型方法無(wú)需合成探針，試驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，是一種快速、簡(jiǎn)便、特異性好的基因分型方法，可用于Wx-mq基因分子標(biāo)記輔助育種中基因的高通量分型。

水稻；Wx-mq基因；低直鏈淀粉含量；ARMS-Tm-shift-qPCR

近年來(lái), 隨著人民生活水平的提高, 消費(fèi)者對(duì)稻米食味品質(zhì)的要求越來(lái)越高。研究表明，直鏈淀粉含量是決定米飯質(zhì)地和食味品質(zhì)的重要因素[1,2]。低直鏈淀粉含量的水稻其米飯表面光澤透亮，綜合了糯米的柔軟性和粳米的彈性, 適口性好，食味品質(zhì)佳，具有較高的商品性。

水稻低直鏈淀粉基因Wx-mq是通過(guò)化學(xué)誘變劑N-甲基-N-亞硝基脲處理日本水稻品種越光而獲得的低直鏈淀粉含量變異基因，序列分析表明，與來(lái)自野生型親本越光中的Wx基因相比，Wx-mq在編碼區(qū)發(fā)生了2個(gè)堿基的替換，其中497位的G突變?yōu)锳，595位的T突變?yōu)镃，從而使相應(yīng)的氨基酸序列產(chǎn)生了2個(gè)錯(cuò)義突變，即位于第4外顯子的精氨酸和第5外顯子的色氨酸均突變?yōu)榻M氨酸，推測(cè)這2個(gè)錯(cuò)義突變是造成直鏈淀粉含量下降的原因。低直鏈淀粉含量基因Wx-mq在稻米食味品質(zhì)改良中的作用尤為重要，如何在育種中快捷、準(zhǔn)確地對(duì)其基因型進(jìn)行鑒定、選擇已成為亟待解決的技術(shù)難題。Sato等[2]針對(duì)Wx-mq基因第497位單核苷酸變異設(shè)計(jì)了能區(qū)分Wx-mq基因型的顯性PCR標(biāo)記；Chen等[3]根據(jù)該突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了能準(zhǔn)確區(qū)分三種基因型的CAPS標(biāo)記；陳濤等[4]利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系(Amplification Refractory Mutation System, ARMS)進(jìn)行等位基因特異擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)水稻低直鏈淀粉含量基因。由于Wx-mq基因僅存在單堿基的變異，采用普通的分子生物學(xué)技術(shù)(如DNA測(cè)序、PCR酶切法)對(duì)其基因型(特別是雜合基因型)進(jìn)行區(qū)分，試驗(yàn)過(guò)程往往比較煩瑣，且存在PCR產(chǎn)物污染等問(wèn)題。因此，有必要嘗試采用新的方法對(duì)水稻W(wǎng)x-mq基因型進(jìn)行快速鑒定。

鄭薇薇等[5]采用序列特異的ARMS引物對(duì)原癌基因K-ras進(jìn)行擴(kuò)增, 建立了以SYBR GreenⅠ熒光染料為實(shí)時(shí)PCR指示劑的ARMS實(shí)時(shí)PCR基因分型體系，無(wú)需合成探針、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，是一種快速、 簡(jiǎn)便、 經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的基因分型方法。本研究則將ARMS法與Tm-shift法結(jié)合，建立基于SYBR GreenⅠ能同時(shí)區(qū)分Wx-mq基因第497位的GG純合、AA純合及GA雜合三種基因型的實(shí)時(shí)熒光PCR基因分型體系，旨在實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻低直鏈淀粉基因Wx-mq第497位單核苷酸多態(tài)性快速、高效、精確的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1供試材料

供試水稻材料包括5個(gè)含低直鏈淀粉含量基因Wx-mq的水稻品種關(guān)東194、南粳46、南粳9108、JS06、JS10(均引自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所)，4個(gè)直鏈淀粉含量正常的水稻品種日本晴、圣稻18、徐稻3號(hào)、圣稻15，以及關(guān)東194/圣稻15、南粳46/圣稻18雜種F1代，JS06/圣稻18的F3代群體，南粳9108/津稻263的F2代群體。

1.2引物設(shè)計(jì)

用于Wx-mq基因497位G>A位點(diǎn)檢測(cè)的Tm-shift和ARMS方法結(jié)合引物設(shè)計(jì)為: 野生型GG上游引物(Wx-mqW): 5′-CGCCCGTCCCGCCGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3′，突變型AA上游引物(Wx-mqM)：5′-GATTACCGGTTTTTCCATTGCTACAAACA-3′，下游引物(Wx-mqR)：5′-GCGAAAGGTAAACTAATGATGACTCCAC-3′，其中野生型GG上游引物的5′端添加14 bp的序列5′-CGCCCGTCCCGCCG-3′；突變型AA上游引物的5′端添加8 bp的短序列5′-GATTACCG-3′；2條ARMS引物分別在3′末端堿基與待檢測(cè)突變型的突變堿基匹配，同時(shí)在其3′末端倒數(shù)第3位增加一個(gè)堿基錯(cuò)配，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本的突變檢測(cè)分單管進(jìn)行。

1.3基因組DNA的準(zhǔn)備及反應(yīng)體系

采用CTAB法提取葉片DNA，將純化后的DNA用Nanodrop分光光度計(jì)定量，分取一部分定量到100 ng/μL水平，備用；引物溶解，稀釋至100 μmol/L原始濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR反應(yīng)體系(20.0 μL)：SYBR PremixExTaqMix(2×)10.0 μL，Primer mix(100 μmol/L)1.0 μL，DNA Template(10 ng/μL)2.0 μL，ROX ref(50×)2.0 μL，雙蒸水補(bǔ)齊至20.0 μL。反應(yīng)程序：①預(yù)變性：95℃預(yù)變性2 min；②PCR反應(yīng)：95℃下變性5 s，60℃下復(fù)性35 s，40個(gè)循環(huán)；③熔解曲線分析：95℃ 0 s 20℃/s，65℃ 15 s 20℃/s，95℃ 0 s 0.1℃/s。

2 結(jié)果與分析

2.1不同水稻品種及F1代Wx-mq基因型的檢測(cè)

對(duì)9個(gè)水稻品種(系)及雜種F1的DNA 進(jìn)行ARMS-Tm-shift-qPCR檢測(cè)。常規(guī)粳稻品種(野生型)日本晴、圣稻18、徐稻3號(hào)、圣稻15均出現(xiàn)單峰且Tm值為(83.09±0.50)℃的熔解曲線(圖1)，且有Ct<35的單一擴(kuò)增曲線(圖2)。5個(gè)含有低直鏈淀粉含量基因Wx-mq的水稻材料關(guān)東194、南粳46、南粳9108、JS06、JS10均出現(xiàn)單峰且Tm值為(81.01±0.50)℃的熔解曲線(圖3)，且有Ct<35的單一擴(kuò)增曲線(圖4)。當(dāng)樣本為雜合型(關(guān)東194/圣稻15、南粳46/圣稻18雜種F1代)，熔解曲線有雙峰，Tm值分別為(83.09±0.50)℃和(81.01±0.50)℃(圖5)，雙條擴(kuò)增曲線的Ct<35(圖6)。

結(jié)果顯示，ARMS-Tm-shift-qPCR檢測(cè)結(jié)果與表型完全一致。因此，利用該方法可以快速、準(zhǔn)確地鑒定和區(qū)分含Wx-mq純合基因型的低直鏈淀粉水稻材料、常規(guī)粳型材料及雜合體材料。

圖1野生型(GG)定量PCR熔解曲線

圖2 野生型(GG)定量PCR擴(kuò)增曲線

圖3 突變型(AA)定量PCR熔解曲線

圖4 突變型(AA)定量PCR擴(kuò)增曲線

圖5 雜合型(GA)定量PCR熔解曲線

圖6 雜合型(GA)定量PCR擴(kuò)增曲線

2.2分離群體Wx-mq基因檢測(cè)

對(duì)2個(gè)分離群體(JS06/圣稻18的F3代群體和南粳9108/津稻263的F2代群體)于分蘗盛期，掛牌選取120個(gè)單株葉片，進(jìn)行Wx-mq基因檢測(cè)，共檢測(cè)到突變型(AA)單株57株、野生型(GG)單株33株、雜合型(GA)單株40株。成熟后對(duì)掛牌單株收獲，進(jìn)行胚乳外觀考查，結(jié)果表明，分子標(biāo)記檢測(cè)為突變型和野生型的單株與表型鑒定完全一致。因直鏈淀粉含量的性狀表達(dá)屬于胚乳性狀，胚乳是三倍體組織，胚乳性狀是母株的子代性狀，因此對(duì)于雜合型單株，其外觀呈現(xiàn)分離表型[6]。

3 討論與結(jié)論

目前，水稻優(yōu)質(zhì)食味米品種選育越來(lái)越受到育種家的重視，并育成了一批優(yōu)質(zhì)米品種。例如，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所以高產(chǎn)粳稻品種武香粳14作母本、以具有暗胚乳突變基因的優(yōu)質(zhì)粳稻品種關(guān)東194作父本配制雜交組合，利用與暗胚乳突變基因Wx-mq直接相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，育成含有暗胚乳突變基因Wx-mq的優(yōu)良食味粳稻新品種南粳46、南粳5055、南粳9108[7-9]。山東省水稻研究所與江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所合作，選育出優(yōu)質(zhì)食味半糯品種南粳505，2017年通過(guò)山東省審定。北方稻作科技協(xié)會(huì)從2007年開(kāi)始組織了全國(guó)優(yōu)良食味粳稻品評(píng)活動(dòng)，評(píng)選出寧粳43、龍稻7號(hào)、吉粳509、寧9108等優(yōu)質(zhì)食味粳稻品種，推動(dòng)了優(yōu)質(zhì)米育種及食味粳米開(kāi)發(fā)[10]。

本研究采用ARMS-Tm-shift-qPCR技術(shù)對(duì)水稻低直鏈淀粉基因Wx-mq進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)表明這種基于SYBR GreenⅠ的ARMS-Tm-shift實(shí)時(shí)PCR基因分型方法，無(wú)需合成探針，試驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，在苗期即可完成對(duì)Wx-mq不同基因型的鑒定，是一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、特異性好的基因分型方法，可以提高育種工作的預(yù)見(jiàn)性和選擇效率，可用于Wx-mq基因分子標(biāo)記輔助育種中基因的高通量分型。

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[4] 陳濤，駱名瑞，張亞?wèn)|，等. 利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR 技術(shù)檢測(cè)水稻低直鏈淀粉含量基因Wx-mq[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2013，27(5)：529-534.

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DetectionofWx-mqGeneforLow-AmyloseContentbyARMS-Tm-shift-qPCRTechnology

Chen Feng1，Xu Jiandi1*，Jiang Mingsong1，Zhang Quanfang2，Zhu Wenyin1，Li Guangxian1，Zhou Xuebiao1，Yang Lianqun1，2

(1.ShandongRiceResearchInstitute，Jinan250100，China; 2.BiotechnologyInstitute，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Jinan250100，China)

Wx-mqgene is a low amylose trait controlled gene and closely relates with the eating quality of rice. According to the rice low amylose starch content control geneWx-mqNo. 497 position existing G>A single nucleotide variants, two real-time PCR genotyping methods, ARMS and Tm-shift based on SYBR Green I, was combined to establish the fluorescence real-time quantitative PCR system, which could accurately distinguish the GG homozygote, AA homozygote and GA heterozygosis ofWx-mqgene No. 497 position. The experiment results showed that the ARMS-Tm-shift real-time PCR genotyping method based on SYBR Green I did not need probe synthesis with simple designs. It was a rapid, simple and specific genotyping method. It could be used in high-throughput genotyping ofWx-mqgene in molecular marker assisted breeding.

Rice;Wx-mqgene; Low-amylose content; ARMS-Tm-shift-qPCR

S511.01

A

1001-4942(2017)10-0015-05

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.003

2017-06-13

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0100505)；國(guó)家水稻產(chǎn)業(yè)體系濟(jì)寧綜合試驗(yàn)站(CARS-01-60)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃子課題(2015BAD01B02-1-3)；山東省水稻產(chǎn)業(yè)體系項(xiàng)目(SDAIT-17-01)；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017GNC11111)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(2014CXZ10-5)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CXGC2016A11)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大成果培育項(xiàng)目(2016CGPY09)

陳峰(1979—)，男，助理研究員,山東曲阜人，主要從事水稻育種。E-mail：Chenfeng7902@163.com 徐建第(1979—)，男，副研究員，山東昌邑人，主要從事水稻分子育種。E-mail:Xjiandi79@163.com

*同為第一作者。

楊連群(1961—)，男，研究員，山東汶上人，從事水稻遺傳育種研究。 周學(xué)標(biāo)(1967—)，男，研究員，山東金鄉(xiāng)人，從事水稻遺傳育種研究。