李凱月，鄭長(zhǎng)英，燕霞飛，王俊平

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院/山東省植物病蟲(chóng)害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

球孢白僵菌甘露醇1-磷酸脫氫酶cDNA克隆及生物信息學(xué)分析

李凱月，鄭長(zhǎng)英，燕霞飛，王俊平

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院/山東省植物病蟲(chóng)害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得了球孢白僵菌(Beauveriabassiana)甘露醇1-磷酸脫氫酶(BbMPD)基因的cDNA序列，并對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，明確其蛋白典型特征。結(jié)果顯示，BbMPD基因cDNA序列長(zhǎng)1 176 bp，編碼391個(gè)氨基酸，分子量約為42.9 kD，理論等電點(diǎn)為5.09；不具有信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白；無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，是親水性蛋白；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示BbMPD蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)；具有典型的甘露醇1-磷酸脫氫酶保守結(jié)構(gòu)域；α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是BbMPD蛋白主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)。該結(jié)果為進(jìn)一步研究BbMPD基因及其功能奠定了基礎(chǔ)。

球孢白僵菌；甘露醇1-磷酸脫氫酶；基因克??；生物信息學(xué)分析

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一種昆蟲(chóng)病原真菌，在侵染過(guò)程中能夠分泌白僵菌交酯、白僵菌素、毒蛋白酶等物質(zhì)[1]，加速害蟲(chóng)的死亡過(guò)程，除此之外，避免了化學(xué)防治過(guò)程中帶來(lái)的藥物殘留、危害生態(tài)環(huán)境、污染環(huán)境等問(wèn)題，因此在農(nóng)林害蟲(chóng)的微生物防治中發(fā)揮著重要作用[2]。分生孢子是昆蟲(chóng)病原真菌最重要的侵染單位，分生孢子的數(shù)量和質(zhì)量是成功侵染的關(guān)鍵因素。田間的分生孢子只有不受高溫、干旱以及紫外線(xiàn)等逆境環(huán)境的影響，才能夠侵染寄主并萌發(fā)。侵入昆蟲(chóng)體內(nèi)的病原真菌不僅要抵抗寄主的免疫反應(yīng)，還需克服寄主體內(nèi)的高滲環(huán)境，才能成功定殖[3]。

多元糖醇在調(diào)節(jié)微生物抗逆性中發(fā)揮著重要作用，其合成途徑受阻會(huì)導(dǎo)致真菌對(duì)多種逆境環(huán)境的適應(yīng)力下降[4]。甘露醇是真菌中的一種多元醇，其主要有調(diào)節(jié)滲透壓[5]、清除自由基以及逆境環(huán)境保護(hù)等作用[6]。在絲狀真菌中，以磷酸果糖為底物，在磷酸甘露醇脫氫酶的催化下形成磷酸甘露醇，然后去磷酸化形成甘露醇[7]。整個(gè)合成過(guò)程受甘露醇1-磷酸脫氫酶(MPD)基因的調(diào)控與催化，并且需要NADH輔酶協(xié)助。大部分真菌MPD屬于多元醇特異性的長(zhǎng)鏈脫氫還原酶家族(long-chain dehydrogenases and reductases，LDRs)，在蛋白的N端存在一個(gè)保守的輔酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)與底物識(shí)別和催化相關(guān)的結(jié)構(gòu)域[8，9]。

在單胞銹菌(Uromycesfabae)侵染寄主的過(guò)程中會(huì)分泌大量的甘露醇，可能與抵制寄主的ROS反應(yīng)有關(guān)[10]。在黑曲霉(Aspergillusniger)中，MPD基因調(diào)控甘露醇的生物合成，使分生孢子具有抵抗高溫、冰凍等不良環(huán)境的能力[11]。在新型隱球菌(Cryptococcuneoformans)中，甘露醇與病原菌的致病力有關(guān)，甘露醇減少后導(dǎo)致病原菌對(duì)氧脅迫較為敏感[12]。在球孢白僵菌的分生孢子中，甘露醇是含量較高的一種多元醇，在一些逆境條件下孢子通過(guò)此類(lèi)物質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞膜的完整性以及酶的生物活性。本研究擬通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆球孢白僵菌BbMPD基因的cDNA序列，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行一系列的理化性質(zhì)及功能預(yù)測(cè)，包括蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位以及保守功能域等，以期為進(jìn)一步研究球孢白僵菌BbMPD基因功能奠定基礎(chǔ)，以及為明確該基因在真菌抗逆機(jī)制中起到的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

球孢白僵菌Bb33A由本實(shí)驗(yàn)室保存；Trizol、DEPC購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；RT-PCR試劑盒、pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；大腸桿菌DH5α購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增 收集球孢白僵菌孢子粉，置于液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末，將粉末移至DEPC處理的EP管中并加入1 mL Trizol。提取步驟按照相關(guān)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，瓊脂糖電泳檢測(cè)提取的RNA并用分光光度計(jì)定量。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。

根據(jù)球孢白僵菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.jgi.doe.gov/Beaba1/Beaba1.home.html)中BbMPD基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物F：5′-ATGGCTCCCAAGGCTGTTCATTT-3′和R：5′-TCACTCGCTGTCGGCCTGAA-3′，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增BbMPD基因片段。50 μL PCR反應(yīng)體系：10×LA PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL (2.5 mmol/L each)，上、下引物各1.5 μL (10 μmol/L)，LATaq酶0.5 μL (5 U/μL)，cDNA模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。瓊脂糖電泳，回收目標(biāo)片段，連接pMD18-T，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并測(cè)序。

1.2.2 BbMPD蛋白的生物信息學(xué)分析 利用在線(xiàn)工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)BbMPD蛋白進(jìn)行氨基酸序列組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析[13]；利用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；利用TMHMM Server v. 2.0工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用PSORT Ⅱ(https://psort.hgc.jp/form2.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用在線(xiàn)工具Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域[14]；利用ProtScale工具(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)分析蛋白質(zhì)氨基酸序列的親/疏水性；利用在線(xiàn)工具PSIpred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1BbMPD基因的克隆

以球孢白僵菌cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，在1 100 bp處有一條亮帶，與預(yù)測(cè)基因片段大小相符，產(chǎn)物回收純化后連接pMD18-T載體，對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序得知其片段大小為1 176 bp，與已測(cè)序菌株BbMPD基因的cDNA序列大小一致，但存在部分堿基的差異。

M：DL2000 DNA Marker；1：BbMPDPCR產(chǎn)物

圖1BbMPD基因PCR擴(kuò)增

2.2 BbMPD蛋白理化性質(zhì)分析

BbMPD基因cDNA序列編碼391個(gè)氨基酸，其蛋白質(zhì)的分子式為C1896H3022N524O593S8，分子量約為42.9 kD，總計(jì)由6 043個(gè)原子組成；等電點(diǎn)為5.09；不穩(wěn)定系數(shù)為39.79，未超過(guò)理論閥值40，故推斷該蛋白質(zhì)穩(wěn)定。其中丙氨酸、谷氨酸、纈氨酸和異亮氨酸含量較多，而甲硫氨酸與色氨酸含量相對(duì)較少。

2.3 BbMPD蛋白的信號(hào)肽及跨膜區(qū)域分析

利用SignalP 4.1 Server對(duì)BbMPD蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，由圖2可知，C值最大切割點(diǎn)在第33個(gè)氨基酸，分值為0.261；綜合剪切點(diǎn)Y值最高也在第33個(gè)氨基酸，分值為0.211；信號(hào)肽最大值(S值)在第2個(gè)氨基酸位置，分值為0.345，因此推斷BbMPD蛋白無(wú)信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。利用TMHMM Server v. 2.0工具對(duì)BbMPD蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，由圖3可知，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，為非膜蛋白。

圖2 BbMPD蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖3 BbMPD蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 BbMPD蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用PSORT Ⅱ在線(xiàn)軟件對(duì)BbMPD蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，可以為進(jìn)一步預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能提供基礎(chǔ)。結(jié)果表明，BbMPD蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)中的概率為73.9%，線(xiàn)粒體中的概率為13%，細(xì)胞核中的概率為4.3%，囊泡分泌系統(tǒng)中的概率為4.3%，液泡中的概率為4.3%。

2.5 BbMPD蛋白保守功能域分析

利用NCBI中的Conserved Domains程序?qū)bMPD蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析，由圖4可知，BbMPD蛋白第4～387位氨基酸組成了典型的甘露醇1-磷酸脫氫酶保守結(jié)構(gòu)域，屬于多元醇特異性的長(zhǎng)鏈脫氫還原酶(LDRs)家族[15]。

圖4 BbMPD蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

2.6 BbMPD蛋白氨基酸序列親水性/疏水性分析

用ProtScale工具預(yù)測(cè)了球孢白僵菌BbMPD蛋白氨基酸序列親水性/疏水性，結(jié)果(圖5)表明，蛋白第233位的天冬氨酸(N)具有最低的分值-3.011，第100位氨基酸異亮氨酸(I)具有最高的分值2.256。根據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)和分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律可知，233位的天冬氨酸親水性最強(qiáng)，第100位異亮氨酸疏水性最強(qiáng)。由圖5可知，親水性氨基酸均勻分布于整個(gè)蛋白，且多于疏水性氨基酸，因此推測(cè)BbMPD蛋白為親水蛋白。

2.7 BbMPD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)BbMPD蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，由圖6可知，BbMPD蛋白含有α螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，其中α螺旋結(jié)構(gòu)含量較多，其次是無(wú)規(guī)則卷曲?？梢?jiàn)，α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是BbMPD蛋白主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分布于整個(gè)肽鏈。

圖5 BbMPD蛋白氨基酸序列親水性/疏水性預(yù)測(cè)

圖6 BbMPD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論與結(jié)論

球孢白僵菌作為一種廣譜性殺蟲(chóng)真菌，能夠有效控制害蟲(chóng)數(shù)量，同時(shí)不傷害天敵昆蟲(chóng)與有益生物，因而得到廣泛應(yīng)用[16]。分生孢子是昆蟲(chóng)病原真菌最重要的侵染單位，甘露醇可以作為一種儲(chǔ)能碳源或保護(hù)劑降低孢子活性以延長(zhǎng)其存活壽命[17]，此外，甘露醇可以提高分生孢子對(duì)熱激、氧化等不良環(huán)境的適應(yīng)能力[18]。甘露醇在真菌中的代謝途徑是一個(gè)生物學(xué)循環(huán)過(guò)程，在輔因子的作用下，經(jīng)過(guò)一系列催化作用形成。球孢白僵菌中BbMPD基因的表達(dá)受高滲環(huán)境的誘導(dǎo)，并對(duì)其具有一定的適應(yīng)性，該適應(yīng)性受到Hog1信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)，在高滲環(huán)境下會(huì)積累較高的多元醇來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)的膨壓[19]。

本研究克隆了球孢白僵菌BbMPD基因的cDNA序列并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示本研究克隆的BbMPD基因的cDNA序列與已經(jīng)完成測(cè)序的球孢白僵菌ARSEF 2860菌株的基因組序列存在著部分堿基的差異[20]，這主要是由于菌株的差異造成的。另外，進(jìn)一步對(duì)BbMPD蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白；不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于親水性蛋白；具有典型的甘露醇1-磷酸脫氫酶保守結(jié)構(gòu)域；BbMPD蛋白主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)是α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，預(yù)測(cè)其與蛋白質(zhì)活性有關(guān)。本研究可為下一步BbMPD蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化，以及試圖通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法來(lái)探究BbMPD蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

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CloningandBioinformaticsAnalysisofMannitol1-PhosphateDehydrogenasecDNAinBeauveriabassiana

Li Kaiyue, Zheng Changying, Yan Xiafei, Wang Junping

(CollegeofAgronomyandPlantProtection,QingdaoAgriculturalUniversity/KeyLabofIntegratedCropDiseaseandPestManagementofShandongProvince,Qingdao266109,China)

The cDNA sequence of mannitol 1-phosphate dehydrogenase (MPD) fromBeauveriabassianawas cloned using RT-PCR. The bioinformatics analysis of amino sequences was performed, and the protein typical characteristics were identified. The results showed that the cDNA sequence ofBbMPDgene was 1 176 bp, which encoded 391 amino acids；its molecular weight was 42.9 kD and the theoretical isoelectric point was 5.09. It was a non-secretory protein without a signal peptide and a hydrophilicity protein without transmembrane domain. The subcellular location results indicated that the BbMPD protein was mainly located in cytoplasm. It possessed the conserved domains of mannitol 1-phosphate dehydrogenase superfamily. The α-helix and random coil were the major secondary structure of BbMPD protein. This method laid the foundation for further studying theBbMPDgene and its function.

Beauveriabassiana; Mannitol 1-phosphate dehydrogenase; Gene cloning; Bioinformatics analysis

S182

A

1001-4942(2017)10-0010-05

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.002

2017-06-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201577)；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金項(xiàng)目(630609)；山東省蔬菜創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)——病蟲(chóng)害防治崗位科學(xué)家(6682216020)；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用型人才培養(yǎng)特色名校建設(shè)工程大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目

李凱月 (1991—)，女，山東東營(yíng)人，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治。E-mail: 1491730863@qq.com

王俊平(1976—)，女，河北南皮人，博士，副教授，研究方向：害蟲(chóng)生物防治。E-mail: junpingwang@qau.edu.cn