胡盼盼，劉新民，喻智強(qiáng)，白 建，陳歷水*

（1.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院食品研發(fā)中心，北京 102209；3.老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京 102209）

副干酪乳桿菌誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞凋亡及其發(fā)酵乳貯藏品質(zhì)的研究

胡盼盼1，劉新民1，喻智強(qiáng)1，白 建1，陳歷水2，3*

（1.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院食品研發(fā)中心，北京 102209；3.老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京 102209）

以新疆馬奶酒中自行分離得到的副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）M5L為對(duì)象，研究該菌株對(duì)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞的抑制作用并分析發(fā)酵乳貯藏品質(zhì)變化。結(jié)果表明，副干酪乳桿菌M5L可以在一定的鹽濃度、膽鹽濃度及酸性環(huán)境中較好的生長(zhǎng)。當(dāng)菌體以100∶1的感染系數(shù)作用于Caco-2細(xì)胞72 h后抑制率最佳；顯微鏡下觀察活菌處理后的細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象；流式細(xì)胞儀檢測(cè)到副干酪乳桿菌M5L可以誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞內(nèi)活性氧顯著增加，并將細(xì)胞周期阻滯在合成期，且通過增大Caspase-3和Bax基因表達(dá)量，降低Bcl-2基因表達(dá)量來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。其發(fā)酵酸乳貯藏5 d時(shí)品質(zhì)較佳，長(zhǎng)時(shí)間的貯存會(huì)導(dǎo)致酸乳品質(zhì)的劣變。

副干酪乳桿菌；發(fā)酵乳；抗腫瘤

結(jié)腸癌（colorectal cancer）在近20年來的發(fā)病率和死亡率逐漸上升[1]，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的高發(fā)性惡性腫瘤之一。結(jié)腸癌發(fā)病原因很多，但重要的誘發(fā)因素多與飲食有關(guān)，目前對(duì)于結(jié)腸癌的治療以手術(shù)方法為主，輔以中醫(yī)治療或化療、放療等治療方法，雖有一定的效果，但同時(shí)也給患者帶來了嚴(yán)重的損害，且治療后復(fù)發(fā)率較高，存活率較低，從而限制了其廣泛的應(yīng)用。大量實(shí)驗(yàn)研究以及臨床結(jié)果表明，天然活性物質(zhì)能夠清除自由基，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抑制體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，可以有效地干預(yù)許多惡性腫瘤的誘發(fā)[2]。

乳酸菌是目前最受關(guān)注的益生菌之一[3]，常常被用于酸乳和干酪等乳制品的發(fā)酵劑及輔助發(fā)酵劑，它不僅在一定程度上可以起到延緩衰老和延長(zhǎng)壽命[4]、預(yù)防某些疾病、增強(qiáng)體質(zhì)的保健型作用，還能促進(jìn)機(jī)體微生物菌群和酶的平衡[5]，刺激機(jī)體發(fā)生特異性和非特異性的免疫機(jī)制。用其發(fā)酵所得的乳制品也具有很好的保健功能，可改善人體胃腸道功能[6]，使腸道菌群的構(gòu)成發(fā)生有益變化，平衡人體腸道內(nèi)的菌群比例，形成一道生物屏障，維護(hù)人體的健康，除此之外還具有免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)人體免疫力和抵抗力[7]，從而起到抗腫瘤、預(yù)防癌癥作用。本實(shí)驗(yàn)室前期從新疆馬奶酒中篩選得到一株副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）M5L，該菌株產(chǎn)生的肽聚糖具有良好的生物活性[8-9]，但未對(duì)菌體本身的生理特性進(jìn)行研究。因此，本研究以副干酪乳桿菌M5L為研究對(duì)象，測(cè)定其對(duì)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞的抑制活性以及其發(fā)酵所得的酸乳在貯藏過程中品質(zhì)變化，以期為其在乳制品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

副干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei）M5L：從新疆馬奶酒中篩選，現(xiàn)由哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程系保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏8 g，酵母膏4 g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，C6H14N2O72g，吐溫-801mL，K2HPO42 g，MnSO4·4H2O 0.04 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，水1 000 mL，pH值自然，121℃滅菌15 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株：中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；細(xì)胞培養(yǎng)液（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）：北京清大天一生物技術(shù)有限公司；胎牛血清：青旗（上海）生物技術(shù)發(fā)展有限公司；青鏈霉素混合液100X、胰酶-乙二胺四乙酸消化液、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液：北京索萊寶科技有限公司；噻唑藍(lán)（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）（分析純）：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo371型細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國BD公司；ECLIPSETs2倒置相差顯微鏡：日本尼康株式會(huì)社PrimeQ熒光定量基因擴(kuò)增儀：TaKaRa公司；680iMark酶標(biāo)儀：美國Bio-Rad公司；TA-XT2質(zhì)構(gòu)測(cè)試儀：西安博宇電氣有限公司；KV-T1分光光度計(jì)：南京肯凡電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 耐鹽性的測(cè)定

預(yù)先將含量為0、2%、4%、6%、8%、10%的NaCl加入MRS培養(yǎng)基內(nèi)，每管10 mL，滅菌待用。無菌條件下，將活化后的L.paracaseiM5L以3%的接種量分別接種到試管內(nèi)，然后放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2 h取出，在波長(zhǎng)600 nm處進(jìn)行吸光度值測(cè)定[10]。

1.3.2 耐酸性的測(cè)定

預(yù)先將MRS培養(yǎng)基的pH分別調(diào)整至2、4、6、8、10，然后每管10 mL加入試管，滅菌待用。無菌條件下，將活化后的L.paracaseiM5L以3%的接種量分別接種到試管內(nèi)，然后放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2 h取出，在波長(zhǎng)600 nm處進(jìn)行吸光度值測(cè)定[10]。

1.3.3 耐膽鹽的測(cè)定

預(yù)先將含量為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的膽酸鈉加入MRS培養(yǎng)基內(nèi)，每管10 mL，滅菌待用。無菌條件下，將活化后的L.paracaseiM5L以3%的接種量分別接種到試管內(nèi)，然后放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2 h取出，在波長(zhǎng)600 nm處進(jìn)行吸光度值測(cè)定。

1.3.4 L.paracaseiM5L抗腫瘤活性的測(cè)定

（1）MTT法：調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL，加入96孔板，每孔100 μL。將活菌體在DMEM完全培養(yǎng)液（不含雙抗）中稀釋，加入96孔板中。菌體與癌細(xì)胞的最終比例分別為1∶1、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1，檢測(cè)活菌對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖的抑制作用，每個(gè)濃度5個(gè)平行。5%CO2、37℃條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗兩次，然后培養(yǎng)板每孔中加入0.5 mg/mL的MTT 100 μL，繼續(xù)37℃培養(yǎng)4 h，然后將MTT小心吸出，向每孔中加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置于搖床振蕩10 min，以溶解沉淀。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率。

（2）倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整Caco-2細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，每孔2 mL加入6孔板，培養(yǎng)一天待細(xì)胞貼壁后，吸走培養(yǎng)液，分別加入2 mL新鮮的培養(yǎng)基，將100∶1感染系數(shù)的L.paracaseiM5L加入6孔板中，對(duì)照組中不加，5%CO2、37℃培養(yǎng)72 h，倒置顯微鏡（×400）下觀察細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)變化。

（3）細(xì)胞周期的測(cè)定：將細(xì)胞以1×106接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔2 mL。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，換含有乳酸菌的不含雙抗的培養(yǎng)液加入菌體使感染系數(shù)為100∶1，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)72 h時(shí)棄去培養(yǎng)液，用不含EDTA的胰酶加入消化，待細(xì)胞脫落后，加培養(yǎng)液終止消化，加入1.5 mL離心管中離心（1 000 r/min、5 min）；同時(shí)將廢棄液離心，然后將剩余細(xì)胞與貼壁細(xì)胞混合；用4℃預(yù)冷PBS離心沖洗兩次（1000r/min、5 min）；加入事先-20℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇1 mL，放于4℃過夜固定；1 000 r/min離心5 min去除固定液，加入PBS洗兩次（1 000 r/min、5 min）；加入0.5 mL的PI染液（含100 μg/mL RnaseA，100 μg/mL 0.2%Triton X-100），避光30 min上樣到流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

（4）活性氧（reactive oxygen species，ROS）測(cè)定：按照1∶1000比例用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA染液，使其終濃度為5mmol/L。將對(duì)照組和100∶1感染系數(shù)的乳酸菌處理72h后的細(xì)胞培養(yǎng)液移棄，分別加入1mL稀釋好的DCFH-DA染液充分遮蓋住所有細(xì)胞。放置到37℃細(xì)胞孵箱內(nèi)，黑暗環(huán)境孵育30min后，PBS洗滌2次，以除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA探針。胰酶消化并收集各組的Caco-2細(xì)胞，PBS清洗2次，迅速放置到流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm），最終DCF熒光的值大小來反映細(xì)胞內(nèi)ROS量的多少。

（5）RT-PCR：用L.paracaseiM5L孵育Caco-2細(xì)胞72 h后，采用Trizol法提取Caco-2細(xì)胞的總RNA，之后參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以cDNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：50 ℃、2 min，95 ℃、10 min，95 ℃、16 s，60℃、55 s，共進(jìn)行40循環(huán)，同時(shí)采用Real-time PCR檢測(cè)bcl-2、bax、Caspase-3mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果以β-actin為內(nèi)參，bax/β-actin、bcl-2/β-actin、Caspase-3/β-actin密度比值顯示，并將反應(yīng)后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，最后拍照并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.5 L.paracaseiM5L發(fā)酵乳貯藏品質(zhì)的測(cè)定

（1）酸度和pH變化：全脂復(fù)原乳（蔗糖6.5%、全脂粉11.5%）預(yù)熱至60℃，均質(zhì)后在95℃條件下殺菌5 min，冷卻至42℃?zhèn)溆?。將活化好的副干酪乳桿菌M5L發(fā)酵液（109CFU/mL）按5%接種量接種于已經(jīng)滅菌好的全脂復(fù)原乳中，于42℃培養(yǎng)至pH值為4.5時(shí)結(jié)束，便制備好發(fā)酵乳，最后迅速置于冰水中冷卻至4℃，放置于4℃冰箱，每隔一段時(shí)間取出測(cè)試pH和酸度。

（2）發(fā)酵乳貯藏條件下持水力的變化：發(fā)酵乳樣品的持水力采用離心法進(jìn)行測(cè)定。定期稱取發(fā)酵乳凝膠樣品約10 g，4 000×g離心30 min，傾去上清物吸干水分后立即稱質(zhì)量，每個(gè)樣品做3個(gè)平行試樣，結(jié)果取算術(shù)平均值。

（3）發(fā)酵乳貯藏條件下活菌數(shù)變化：將發(fā)酵乳放入4℃冰箱冷藏，分別在0 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d后取出，采用MRS固體培養(yǎng)基測(cè)定4℃貯藏過程中乳酸菌數(shù)量的變化。將樣品以10倍系列稀釋，取1 mL為10-8稀釋液于培養(yǎng)基中，涂板后置于37℃培養(yǎng)一段時(shí)間后計(jì)數(shù)。

（4）發(fā)酵乳表觀硬度的測(cè)定：定期稱取15.0 g發(fā)酵乳樣品，將發(fā)酵乳調(diào)溫至20～22℃，采用TA-XT2質(zhì)構(gòu)測(cè)試儀SMS P/25平底柱形探頭（直徑2.5 cm、高4 cm）進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件為：測(cè)前速率5.0 mm/s、測(cè)試速率2.0 mm/s、測(cè)后速率2.0mm/s，探頭進(jìn)入距離20mm，兩次壓縮之間停留時(shí)間5 s。利用質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)分析軟件由全質(zhì)構(gòu)曲線計(jì)算得到硬度值。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

本論文的所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 8.0，SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和分析，“*”代表差異顯著（P＜0.05），“**”代表差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.paracaseiM5L的生長(zhǎng)特性

副干酪乳桿菌在不同鹽含量、pH條件、膽鹽含量條件下的生長(zhǎng)情況見圖1。

由圖1可知，鹽濃度能夠影響菌體的生長(zhǎng)，添加2%的NaCl溶液時(shí)，和原液生長(zhǎng)狀況相差不大，隨著NaCl含量的增大，菌體的生長(zhǎng)受到抑制，達(dá)到穩(wěn)定期所用時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)NaCl含量達(dá)到10%時(shí)，菌株幾乎不生長(zhǎng)。乳酸菌發(fā)揮其生理作用很大程度上取決于菌株是否能順利通過胃的酸性環(huán)境以及耐受十二指腸的高膽鹽環(huán)境，并以活菌的狀態(tài)到達(dá)小腸，從而發(fā)揮微生態(tài)的調(diào)整功能[11]。由圖2可知，pH=6的時(shí)候，和原液中菌體生長(zhǎng)狀況相似。酸性或堿性過強(qiáng)均可一定程度影響到菌體的生長(zhǎng)情況，pH=2時(shí)菌體生長(zhǎng)完全受到抑制。但pH=4時(shí)，菌體生長(zhǎng)狀況良好，說明具有一定的耐酸性。由圖1可知，添加0.2%的膽酸鈉與在原液中生長(zhǎng)狀況相似，隨著膽酸鈉含量的增加，菌體的生長(zhǎng)狀況受到一定程度的抑制。

圖1 L.paracaseiM5L在不同鹽濃度（A）、pH（B）膽鹽濃度（C）條件下的生長(zhǎng)狀況Fig.1 Growth condition ofL.paracaseiM5L in different NaCl concentration(A),pH(B)and bile salt concentration(C)

2.2 L.paracaseiM5L抗腫瘤活性的測(cè)定

2.2.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將副干酪乳桿菌活菌體按照1∶1、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1的感染系數(shù)作用于結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞，分別作用24 h、48 h、72h，然后MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，抑制率呈現(xiàn)出時(shí)間和感染系數(shù)依賴性，時(shí)間越長(zhǎng)，感染系數(shù)越大，對(duì)Caco-2細(xì)胞的抑制效果越好?；罹w作用于癌細(xì)胞24 h后，癌細(xì)胞抑制率較低，各感染系數(shù)組間抑制率沒有明顯差異，作用48 h后抑制率有一定的增大，但總體來說作用于癌細(xì)胞24 h和48 h后，其增殖抑制作用不顯著。當(dāng)活菌體作用于癌細(xì)胞72h后，抑制率隨感染系數(shù)增大而呈上升趨勢(shì)，且抑制率效果最佳，與對(duì)照細(xì)胞相比，低感染系數(shù)的菌體對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制作用不明顯，當(dāng)感染系數(shù)達(dá)到100∶1時(shí)，菌體對(duì)癌細(xì)胞的抑制率最大，因此選為感染系數(shù)100∶1作用72 h用于后續(xù)的研究。

圖2 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of MTT experiments

2.2.2 倒置顯微鏡結(jié)果

凋亡是指細(xì)胞在遵循自身程序，在一定生理和病理?xiàng)l件下由基因調(diào)控的主動(dòng)性死亡過程，在此過程中，一般都會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)的變化[12]。由圖3可知，未經(jīng)乳酸菌處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞形態(tài)正常，生長(zhǎng)速度極快，細(xì)胞數(shù)量呈倍數(shù)增長(zhǎng)，而經(jīng)過100∶1感染系數(shù)副干酪乳桿菌處理72 h后細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)破碎，細(xì)胞皺縮變圓，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞脫落甚至出現(xiàn)凋亡小體，這說明L.paracasei M5L能夠明顯抑制Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖3 L.paracaseiM5L對(duì)Caco-2細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.3 Effect ofL.paracaseiM5L on morphology of Caco-2 cell

2.2.3 細(xì)胞周期

細(xì)胞周期指連續(xù)分裂的細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個(gè)過程，包含G1期、S期、G2期、M期四個(gè)階段[13]。本試驗(yàn)將副干酪乳桿菌L.paracasei M5L活菌體按照100∶1的感染系數(shù)作用于結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞72 h，由圖4可知，活菌處理72 h后，G1期細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），G2期細(xì)胞數(shù)量無顯著變化，而S期細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.05），說明L.paracaseiM5L導(dǎo)致Caco-2細(xì)胞發(fā)生了周期阻滯，主要阻滯在S期，即合成期。同時(shí)，由流式細(xì)胞儀結(jié)果表示乳桿菌處理72 h后，Caco-2細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01），達(dá)到（27.73±0.15）%。由此可知，L.paracaseiM5L可通過阻滯合成期來誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞凋亡。

圖4 L.paracaseiM5L對(duì)Caco-2細(xì)胞比例的影響Fig.4 Effect ofL.paracaseiM5L on Caco-2 cell proportion

2.2.4 ROS的測(cè)定

活性氧（ROS）主要產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi)線粒體，是生物體內(nèi)正常細(xì)胞代謝過程中的衍生物，但過量的ROS可通過氧化與過氧化作用達(dá)到破壞細(xì)胞內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)以及脂類的效果[14]，從而使線粒體膜受到損傷，引起線粒體功能的障礙，從而導(dǎo)致Caspase激活和凋亡，因此ROS的增加能從一定程度反映細(xì)胞凋亡的情況。如圖5所示，經(jīng)過100∶1感染系數(shù)的L.paracaseiM5L活菌處理72 h后，Caco-2細(xì)胞內(nèi)的ROS熒光量顯著增加（P＜0.01），由此表明活菌處理可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化系統(tǒng)的失衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

圖5 L.paracaseiM5L對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig.5 Effect ofL.paracaseiM5L on intracellular ROS of Caco-2 cell

2.2.5 RT-PCR結(jié)果

Caspase家族和Bcl-2家族蛋白是衡量細(xì)胞凋亡的重要家族蛋白[15]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)Caspase-3、Bax和Bcl-2基因表達(dá)量變化進(jìn)行分析，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，與未經(jīng)M5L活菌處理的對(duì)照組相比，處理組可以顯著的提高Caco-2細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)量（P＜0.05），同樣，Caco-2細(xì)胞中促凋亡基因Bax表達(dá)量也顯著增長(zhǎng)（P＜0.05），而抑凋亡基因Bcl-2表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01），因此Bax/Bcl-2比值變小，腫瘤細(xì)胞朝著凋亡的方向進(jìn)行，由此闡明副干酪乳桿菌M5L可通過影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來促進(jìn)Caco-2細(xì)胞凋亡的。

2.3 L.paracaseiM5L發(fā)酵乳貯藏品質(zhì)的變化

酸乳是活菌制品，產(chǎn)品貯藏過程中，菌體依然進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，由結(jié)果所知，貯藏0～5 d，菌體數(shù)量呈現(xiàn)顯著的增長(zhǎng)趨勢(shì)，第5天后菌落數(shù)逐漸減少，這可能是因?yàn)橘A藏后期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及外界環(huán)境的影響導(dǎo)致菌體數(shù)量下降。酸度和pH是影響發(fā)酵奶最終口感的重要因素，良好風(fēng)味的發(fā)酵乳pH一般為4.5左右，酸度在80～120°T[16]。由表1可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，pH顯著下降，pH由4.54±0.01降低至4.03±0.01，同時(shí)酸度逐漸增強(qiáng)，酸度在前5天增長(zhǎng)幅度不大，由原來的（75.13±1.33）°T增長(zhǎng)至（97.41±2.77）°T，之后緩慢增大。持水力是衡量發(fā)酵奶品質(zhì)的重要指標(biāo)，發(fā)酵乳貯藏前5天內(nèi)持水力顯著增大，在第5天時(shí)由原來的（19.3±0.24）%增大至（22.3±0.22）%，之后逐漸下降，這說明貯藏時(shí)間過長(zhǎng)，能夠明顯的影響到發(fā)酵乳的品質(zhì)。硬度和黏度也是衡量發(fā)酵奶的重要指標(biāo)[17]。由結(jié)果可知，發(fā)酵乳在貯藏1d后，硬度和黏度顯著增大，第5天達(dá)到最高，之后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，硬度在第13天的時(shí)候變?yōu)椋?0.513±2.84）g，這說明短時(shí)間的貯藏后熟過程，有利于酸奶品質(zhì)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，硬度值和黏度逐漸下降，這可能是由于發(fā)酵后期，菌體生長(zhǎng)受到影響，營(yíng)養(yǎng)消耗，乳清析出，品質(zhì)也逐漸降低。

圖6 L.paracaseiM5L對(duì)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)的影響Fig.6 Effect ofL.paracaseiM5L on apoptosis gene express of Caco-2 cell

表1 發(fā)酵乳貯藏過程中品質(zhì)變化Table 1 Quality changes of fermented milk during storage

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選擇從新疆馬奶酒中自行分離得到的副干酪乳桿菌M5L，初步分析它的生長(zhǎng)特性，并對(duì)副干酪乳桿菌M5L誘導(dǎo)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞凋亡進(jìn)行研究，最后探討其發(fā)酵乳在貯藏過程中持水力、菌落數(shù)、pH、酸度、硬度等各個(gè)指標(biāo)的變化。副干酪乳桿菌M5L可以在一定的鹽濃度、膽鹽濃度以及酸性環(huán)境下較好的生長(zhǎng)，這將有利于其在發(fā)酵工業(yè)中更好的利用。根據(jù)MTT結(jié)果可知，當(dāng)活菌體以感染系數(shù)100∶1作用于Caco-2細(xì)胞72 h后，抑制作用最大，由此用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。根據(jù)倒置顯微鏡結(jié)果可知，活菌處理后的癌細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。通過流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果表明活菌處理極其顯著的增加細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，并對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行測(cè)定，處理72 h后，可有效的通過阻滯細(xì)胞合成期來抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，凋亡率可達(dá)到（27.73±0.15）%。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR）結(jié)果顯示，基因Caspase-3和Bax相對(duì)表達(dá)值高于對(duì)照組，基因Bcl-2表達(dá)量低于對(duì)照組，由此進(jìn)一步闡明了副干酪乳桿菌M5L誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞凋亡的機(jī)制。由副干酪乳桿菌M5L發(fā)酵所得發(fā)酵乳貯藏過程中持水力、菌落數(shù)、硬度和黏度等指標(biāo)都呈現(xiàn)出先增加后逐漸減小的趨勢(shì)，第5天時(shí)數(shù)值最大，pH和酸度也在貯藏前5 d變化不大，由此可知酸乳貯藏5天時(shí)品質(zhì)最佳。由此設(shè)想將副干酪乳桿菌M5L作為乳制品的發(fā)酵劑及輔助或酵劑應(yīng)用于發(fā)酵行業(yè)，可以有效的增強(qiáng)酸乳的營(yíng)養(yǎng)功能，同時(shí)擴(kuò)大乳酸菌在抗腫瘤領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

[1]SUNKARA V,HEBERT J R.The Colorectal cancer mortality-to-incidence ratio as an indicator of global cancer screening and care[J].Cancer,2015,121(10):1563-1569.

[2]BOSETTI C,LEVI F,ROSTAO V,et al.Recent trends in colorectal cancer mortality in Europe[J].Int J Cancer,2011,129(1):180-191.

[3]胡盼盼，宋 微，單毓娟，等.影響乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的因素[J].食品科技，2014，39（9）：31-37.

[4]KUDA T,KAWAHARA M,NEMOTO M,et al.In vitroantioxidant and anti-inflammation properties of lactic acid bacteria isolated from fish intestines and fermented fish from the Sanriku Satoumi region in Japan[J].Food Res Int,2014,64:248-255.

[5]WANG A N,YI X W,YU H F,et al.Free radical scavenging activity of Lactobacillus fermentum in vitroand its antioxidative effect on growingfinishing pigs[J].J Appl Microbiol,2009,107(4):1140-1148.

[6]DAS D,GOYAL A.Antioxidant activity and γ-aminobutyric acid(GABA)producing ability of probioticLactobacillus plantarumDM5 isolated from Marcha of Sikkim[J].LWT-Food Sci Technol,2015,61(1):263-271.

[7]尹勝利，杜 鑒，徐 晨.乳酸菌的研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用[J].食品科技，2012，37（9）：25-29.

[8]WANG S M,ZHANG L W,FAN R B,et al.Induction of HT-29 cells apoptosis by lactobacilli isolated from fermented products[J].Res Microbiol,2014,165(3):202-214.

[9]TUO Y F,ZHANG L W,YI H X,et al.Antiproliferative effect of wild Lactobacillusstrains isolated from fermented foods on HT-29 cells[J].J Dairy Sci,2010,93(6):505-511.

[10]ZHAI Q,YIN R,YU L,et al.Screening of lactic acid bacteria with potentialprotectiveeffectsagainstcadmiumtoxicity[J].Food Control,2015,54:23-30.

[11]趙 鑫，趙洪雙，姜國龍.不同比例的嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌對(duì)酸奶品質(zhì)的影響[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2009（3）：177-180.

[12]SUN J,LIU R H.Apple phytochemical extracts inhibit proliferation of estrogen-dependent and estrogen-independent human breast cancer cells through cell cycle modulation[J].J Agr Food Chem,2008,56(24):11661-11667.

[13]OUYA F J,WANG G B,GUO W,et al.AKT signalling and mitochondrial pathways are involved in mushroom polysaccharide-induced apoptosis and G1 or S phase arrest in human hepatoma cells[J].Food Chem,2013,138(4):2130-2139.

[14]ISHII Y,SUGIMOTO S,IZAWA N,et al.Oral administration ofBifidobacterium breveattenuates UV-induced barrier perturbation and oxidativestressinhairlessmiceskin[J].Arch Dermatol Res,2014,306(5):467-473.

[15]SHEN Q,SHANG N,LI P.In vitroandin vivoantioxidant activity of Bifidobacterium animalis01 isolated from centenarians[J].Current Microbiol,2011,62(4):1097-1103.

[16]李向東，喬成亞，呂加平，等.弱后酸化發(fā)酵劑對(duì)長(zhǎng)保質(zhì)期酸奶品質(zhì)特性影響的研究[J].食品科技，2008，33（12）：99-102.

[17]HASSAN A N,FRANK J F,SCHMIDT K A,et al.Rheological propertiesofyogurt made with encapsulated nonropylactic cultures[J].J Dairy Sci,1996,79:2091-2097.

Caco-2 cell apoptosis induced byLactobacillus paracaseiand its fermented milk storage quality

HU Panpan1,LIU Xinmin1,YU Zhiqiang1,BAI Jian1,CHEN Lishui2,3*
(1.Department of Life Science,Lvliang University,Lvliang 033000,China;2.Food R&D Center,COFCO Nutrition and Health Research Institute,Beijing 102209,China;3.Beijing Engineering Laboratory for Geriatric Nutrition Food Research,Beijing 102209,China)

Lactobacillus paracaseiM5L was isolated from Xinjiang Kumiss,its inhibition effect on colorectal cancer Caco-2 cell was studied and the qualitychangeoffermentedmilk wasanalyzed.Resultsshowed thatL.paracaseigrewwellatcertain saltcontent,bile saltcontentand acid environment.The inhibition rate on Caco-2 cells was the optimal byL.paracaseitreatment with infection factor 100∶1 for 72 h,the cells treated withL.paracasei showed obvious apoptosis phenomenon.Flow cytometry detection results showed thatL.paracaseiM5L could induce Caco-2 cells active oxygen content,arrest cell cycle in Synthesis phase,and the cancer cell apoptosis could be accelerated by increasingCaspase-3andBaxgene express or decreasing Bcl-2gene express.The quality of fermented milk was the optimal with storage time 5 d,and longtime storage can lead to yogurt deterioration.

Lactobacillus paracasei;fermented milk;antitumor

TS201.3

0254-5071（2017）09-0142-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.031

2017-06-20

北京市科技計(jì)劃（Z161100000616010）；呂梁學(xué)院校內(nèi)基金項(xiàng)目（ZRXN201509）

胡盼盼（1989-），男，助教，碩士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。

*通訊作者：陳歷水（1974-），男，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称贰?/p>