秦汪艷，李永成*

（海南大學(xué) 食品學(xué)院，海南 ?？?570228）

一株產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶誘變菌株的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件優(yōu)化

秦汪艷，李永成*

（海南大學(xué) 食品學(xué)院，海南 ?？?570228）

以一株海洋來源產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶（CDA）的絲狀真菌（Penicilium janthinellum）1-5-2為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線誘變后獲得一高產(chǎn)CDA菌株UV-210S。通過單因素試驗(yàn)得出該誘變菌株的最佳培養(yǎng)基配方為麥芽糖1.3%，牛肉浸膏2.6%，NaH2PO40.3%，CaCl20.1%，膠體幾丁質(zhì)0.5%；最佳發(fā)酵工藝條件為NaCl 1.5%，初始pH值為9.0，發(fā)酵溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，CDA最佳收集時(shí)間為72 h。經(jīng)培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件優(yōu)化后該誘變菌株的最高CDA酶活為16.76 U/mL，相比優(yōu)化前的酶活提高了52%。

幾丁質(zhì)脫乙酰酶；發(fā)酵；培養(yǎng)基；條件優(yōu)化；酶活

幾丁質(zhì)（chitin）是由N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖胺通過β-1,4糖苷鍵連接聚合而成的高聚物，是地球上含量豐富的可再生多糖[1-2]。主要存在于動(dòng)物的甲殼和骨組織以及真菌和植物的細(xì)胞壁中，也存在于一些綠藻中；主要有支撐骨架，保護(hù)細(xì)胞的作用[3]。殼聚糖（chitosan）是幾丁質(zhì)脫去乙?；笏纬傻漠a(chǎn)物，殼聚糖分子因其大量游離的氨基和堿性陽離子而比幾丁質(zhì)具有更好的溶解性[4]和生物可降解性[5]。此外，殼聚糖還具有其他優(yōu)良的性能，如抑菌性[6]、保濕性、吸附性、降低膽固醇等，在食品、醫(yī)藥、輕工、印染、環(huán)保和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，具有很大的開發(fā)和推廣潛力[7-9]。

目前，工業(yè)上制備殼聚糖的方法主要是濃堿熱解幾丁質(zhì)脫除乙?；?，該法存在嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，且獲得的殼聚糖產(chǎn)品中乙酰基的脫除程度不一致，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)均一性差。酶法生產(chǎn)殼聚糖作為一種新型綠色環(huán)保的脫乙酰方法，反應(yīng)條件溫和，能耗值相對(duì)較低[10-11]，可獲得脫乙酰程度均一穩(wěn)定的產(chǎn)品，因此，運(yùn)用幾丁質(zhì)脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）生產(chǎn)殼聚糖將是行業(yè)未來的發(fā)展方向。

目前，以海洋真菌為來源的CDA文獻(xiàn)并不多，高產(chǎn)CDA的菌株報(bào)道也很少見，且海洋來源的微生物具有耐高滲透壓和耐鹽等優(yōu)良的性能[12-13]，為發(fā)酵生產(chǎn)CDA提供很大的便利。因此本試驗(yàn)以一株海洋絲狀真菌為出發(fā)菌株，對(duì)紫外線誘變后獲得的CDA高產(chǎn)菌株UV-210S進(jìn)行單因素試驗(yàn)以獲得其最佳培養(yǎng)基配方和最佳的產(chǎn)酶條件，為今后的工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵CDA奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：誘變菌株UV-210S，其出發(fā)菌株為從?？跂|寨港紅樹林土壤中篩選獲得的海洋絲狀真菌（Penicilium janthinellum）1-5-2，4℃于冰箱中保存。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸膏0.5%，葡萄糖0.4%，磷酸二氫鉀0.15%，膠體幾丁質(zhì)0.1%，NaCl 1.4%，初始pH 6.0。121℃高壓蒸汽滅菌16 min。

種子培養(yǎng)基：酵母浸膏0.5%，葡萄糖0.25%，硫酸銨0.4%，磷酸二氫鉀0.15%，NaCl 1.0%，初始pH 6.0。121℃高壓蒸汽滅菌16 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；HZQ-X300C搖床：上海一恒科學(xué)儀器公司；TGL-16M離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；GM-1.0A隔膜真空泵：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

斜面菌種在恒溫培養(yǎng)箱中于30℃培養(yǎng)5～6 d，待產(chǎn)孢后，用5 mL 0.85%生理鹽水刮下孢子，將孢子液倒入裝液量為50mL/250mL的種子瓶中，180r/min搖床振蕩培養(yǎng)36h用于發(fā)酵[14]。

1.3.2 CDA粗酶液的提取

將發(fā)酵液在低溫條件下進(jìn)行抽濾，濾液即為胞外酶提取液。在抽濾所得的菌絲體中加入15mL預(yù)冷的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）和少量石英砂，在低溫環(huán)境中快速碾磨，漿液立即在4℃、6 000 r/min條件下離心20 min，所得上清液即為胞內(nèi)酶提取液[15]。

1.3.3 幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活的測定

在具塞試管中加入1 mL 200 mg/L的對(duì)硝基乙酰苯胺溶液，3mL0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0），50℃水浴處理10 min后加入1 mL酶液，搖勻后于50℃酶促反應(yīng)15 min，最后沸水浴10 min滅酶活終止反應(yīng)，若出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，在6 000r/min條件下離心10min，于波長400nm處測定吸光度值。空白對(duì)照組添加1 mL滅活酶液，其余同上。幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活定義：在該反應(yīng)條件下每小時(shí)產(chǎn)生1 μg對(duì)硝基苯胺所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U/mL）[16]。

1.3.4 培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)方法：種子液按2%的接種量接種于裝液量為50 mL/250 mL發(fā)酵瓶中，30℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h，測定其CDA酶活及菌絲體干質(zhì)量。

碳源的確定：將碳源的種類設(shè)定為葡萄糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、蔗糖。選取最佳碳源，將其添加量設(shè)定為0.1%、0.5%、0.9%、1.3%、1.7%、2.1%，考察碳源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)CDA的影響。

氮源的確定：氮源的種類設(shè)定為酵母浸膏、牛肉浸膏、蛋白胨、草酸銨、硫酸銨。選取最佳氮源，將其添加量設(shè)定為0.2%、0.8%、1.4%、2.0%、2.6%、3.2%，考察氮源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)CDA的影響。

無機(jī)鹽的確定：將發(fā)酵液中的無機(jī)鹽調(diào)整為MgSO4、CuSO4、CaCl2、NaH2PO4、KH2PO4、MnSO4、ZnSO4、BaCl2、FeCl3，考察無機(jī)鹽對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)CDA的影響。

膠體幾丁質(zhì)的確定：發(fā)酵液中膠體幾丁質(zhì)的添加量為0、0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%，考察膠體幾丁質(zhì)添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)CDA的影響。

滲透壓的確定：根據(jù)NaCl的加入量來調(diào)節(jié)滲透壓的大小，NaCl的加入量設(shè)定為0.1%、0.8%、1.5%、2.2%、2.9%、3.6%，考察滲透壓對(duì)發(fā)酵產(chǎn)CDA的影響。

1.3.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

pH的確定：滅菌前將發(fā)酵液中的pH調(diào)整為5、6、7、8、9，考察pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)CDA的影響。

發(fā)酵溫度的確定：振蕩培養(yǎng)溫度設(shè)定為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，考察發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)CDA的影響。

搖床轉(zhuǎn)速的確定：搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min，考察搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵產(chǎn)CDA的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外CDA與胞內(nèi)CDA的對(duì)比

分別測定胞外及胞內(nèi)CDA酶活，結(jié)果見表1。由表1可以看出，胞外CDA酶活在發(fā)酵過程中始終高于胞內(nèi)CDA酶活。胞內(nèi)和胞外CDA酶活均在72 h時(shí)達(dá)到最高，分別為2.5 U/mL和11.05 U/mL，故酶的最佳收集時(shí)間為72 h。胞外CDA酶活顯著高于胞內(nèi)CDA酶活，故以下試驗(yàn)酶的研究以胞外CDA酶活計(jì)。

表1 誘變菌株胞外CDA與胞內(nèi)CDA酶活比較Table 1 Comparison of activity of extracellular CDA and intracellular CDA from the mutant strains

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)菌生長與CDA合成的影響

2.2.1 碳源的影響

微生物對(duì)碳源的利用具有選擇性[17]，試驗(yàn)采用5種碳源，探討其對(duì)CDA酶活的影響，結(jié)果見圖1（a）。由圖1（a）可知，以麥芽糖為碳源時(shí)，胞外CDA酶活最高，為7.41 U/mL，淀粉次之，為6.5 U/mL，葡萄糖作為碳源時(shí)酶活最低。因此，以麥芽糖為碳源，進(jìn)行麥芽糖添加量對(duì)該誘變菌株產(chǎn)CDA酶影響的考察。

麥芽糖的添加量對(duì)CDA酶活的影響如圖1（b）所示。由圖1（b）可知，麥芽糖添加量在0.1%～1.3%范圍內(nèi)，CDA酶活隨麥芽糖濃度的增加而穩(wěn)步上升，在麥芽糖添加量為1.3%時(shí)，CDA酶活達(dá)到最高，為7.41 U/mL，麥芽糖添加量＞1.3%后，CDA酶活呈逐漸下降趨勢。分析其原因主要是當(dāng)麥芽糖濃度較低時(shí)導(dǎo)致碳源匱乏，生物量處在較低的水平，對(duì)CDA的合成造成一定的影響；過高的麥芽糖濃度對(duì)CDA的合成造成一定的碳源阻遏作用，使酶活下降[18]。因此，最適麥芽糖添加量為1.3%。

圖1 碳源種類(a)與麥芽糖添加量(b)對(duì)誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.1 Effects of kinds of carbon source(a)and maltose addition(b)on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

2.2.2 氮源的影響

圖2 氮源種類(a)與牛肉浸膏添加量(b)對(duì)誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.2 Effects of kinds of nitrogen source(a)and beef extract addition(b)on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

不同氮源種類對(duì)CDA酶活的影響，結(jié)果見圖2（a）。由圖2（a）可知，有機(jī)氮作為氮源時(shí)CDA酶活以及生物量明顯高于無機(jī)氮源，可能是有機(jī)氮源中富含微生物生命活動(dòng)所需的生長因子和微量元素，在生長過程中更易被微生物吸收利用或?qū)DA酶本身具有激活作用[19]。對(duì)比牛肉浸膏與酵母浸膏的CDA酶活和生物量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)生物量并不是影響酶活大小的唯一因素[20]。以牛肉浸膏作為氮源時(shí)，CDA酶活顯著高于其他氮源，為7.15 U/mL，因此以牛肉浸膏為氮源，對(duì)牛肉浸膏最佳的添加量進(jìn)行探討。

氮源的添加量對(duì)CDA酶活的影響如圖2（b）所示。由圖2（b）可知，以牛肉浸膏為氮源時(shí)，在添加量0.1%～2.6%范圍內(nèi)，菌體對(duì)氮源的需求較大，隨著牛肉浸膏添加量在0.2%～2.6%范圍內(nèi)的上升，CDA酶活以及微生物的生物量也隨之上升，并在牛肉浸膏添加量為2.6%時(shí)CDA酶活達(dá)到最高，為15.85U/mL，牛肉浸膏添加量＞2.6%后，高濃度的氮源不利于菌體的生長和代謝產(chǎn)物的積累，對(duì)產(chǎn)CDA酶水平有一定抑制作用，酶活降低。因此，最適牛肉浸膏添加量為2.6%。

2.2.3 無機(jī)鹽的影響

圖3 金屬離子種類(a)、NaH2PO4(b)和CaCl2(c)添加量對(duì)誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.3 Effects of kinds of metal ions(a),NaH2PO4addition(b)and CaCl2 addition(c)on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

不同種類的金屬離子對(duì)CDA酶活的影響，結(jié)果見圖3（a）。由圖3（a）可知，不同種類的金屬離子對(duì)CDA酶的產(chǎn)生有不同的影響；Ca2+、Ba2+、Zn2+、Na+對(duì)產(chǎn)CDA均有促進(jìn)作用，可能是這些金屬離子對(duì)CDA酶的產(chǎn)生具有一定的激活作用或作為酶的組成部分對(duì)維持CDA酶的活性結(jié)構(gòu)具有重要意義。Mg2+對(duì)CDA酶的促進(jìn)作用不明顯。Fe3+、Cu2+、Mn2+對(duì)產(chǎn)CDA酶有明顯的抑制作用，具體的抑制機(jī)理善不明確。有報(bào)道稱可能是CDA酶與某些金屬離子螯合形成的底物對(duì)CDA酶活會(huì)造成較大的影響，使酶活降低[21]。當(dāng)金屬鹽的加入量為11mmol/L時(shí)，NaH2PO4對(duì)菌株產(chǎn)CDA酶的影響最大，為10.53 U/mL，CaCl2次之，為8.84 U/mL。因此以NaH2PO4、CaCl2為無機(jī)鹽，分別探討其最佳的添加量。

NaH2PO4的添加量對(duì)CDA酶活的影響，結(jié)果見圖3（b）。由圖3（b）可知，當(dāng)發(fā)酵液中NaH2PO4的加入量為0.3%，CDA酶活最高，為10.27 U/mL。分析其原因主要是NaH2PO4提供微生物生長所必需的Na+和磷元素外，還能調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH，使之穩(wěn)定在一定的范圍內(nèi)。因此，選擇NaH2PO4的最適添加量為0.3%。

CaCl2的添加量對(duì)CDA酶活的影響，結(jié)果見圖3（c）。由圖3（c）可知，添加量為0～0.1%時(shí)，CDA酶活隨CaCl2添加量升高而穩(wěn)步上升，并在CaCl2添加量為0.1%時(shí)CDA酶活達(dá)到最高，為8.84U/mL。CaCl2的添加量＞0.1%后，CDA酶活開始下降，說明Ca2+對(duì)CDA酶的產(chǎn)生具有雙重調(diào)節(jié)作用。因此選擇CaCl2的最適添加量為0.1%。

2.2.4 膠體幾丁質(zhì)添加量的影響

膠體幾丁質(zhì)的添加量對(duì)CDA酶活的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，未添加膠體幾丁質(zhì)時(shí)，CDA酶活處于較低水平，添加膠體幾丁質(zhì)后酶活驟然上升，說明幾丁質(zhì)作為CDA酶的作用底物對(duì)CDA的合成具有誘導(dǎo)作用；當(dāng)發(fā)酵液中膠體幾丁質(zhì)的添加量為0.5%時(shí)，CDA酶活達(dá)到最高，為6.89U/mL，膠體幾丁質(zhì)的添加量＞0.5%后，CDA酶活呈下降趨勢。因此膠體幾丁質(zhì)的最適添加量為0.5%。

圖4 膠體幾丁質(zhì)的添加量對(duì)誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.4 Effect of colloidal chitin addition on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

2.3 培養(yǎng)條件對(duì)菌生長與CDA合成的影響

2.3.1 滲透壓的影響

根據(jù)NaCl的添加量來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓。不同NaCl的添加量對(duì)CDA酶活的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，NaCl添加量為1.5%時(shí)，CDA酶活最高，為5.46 U/mL。當(dāng)NaCl添加量＞1.5%后，生物量的變化趨勢不顯著，而CDA酶活呈現(xiàn)微弱的下降趨勢。分析其原因可能是誘變體菌株的原始出發(fā)菌株是從海邊紅樹林篩選獲得，有較好的耐鹽性，滲透壓調(diào)節(jié)能力較強(qiáng)。因此NaCl最適添加量為1.5%。

圖5 NaCl添加量對(duì)誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.5 Effect of NaCl addition on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

2.3.2 發(fā)酵液初始pH的影響

不同的發(fā)酵液初始pH對(duì)CDA酶活的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，發(fā)酵液初始pH對(duì)CDA酶活及生物量均有較大影響。pH為9時(shí)，CDA酶活最高，為14.55 U/mL。pH在5～6時(shí)，酶活與生物量呈上升趨勢，pH在7～9內(nèi)，生物量隨pH上升而下降，而CDA酶活呈上升趨勢。分析其原因主要是該誘變菌株屬于真菌類，偏酸性的環(huán)境促進(jìn)其生長，而在發(fā)酵過程中，該誘變真菌產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)，被堿性發(fā)酵液中和后，更適于CDA的產(chǎn)生。

圖6 初始pH對(duì)誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.6 Effect of initial pH on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

2.3.3 發(fā)酵溫度的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)CDA酶活的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，誘變菌株的最佳產(chǎn)酶溫度為30℃，此時(shí)胞外CDA酶活為7.02 U/mL，因此可將后續(xù)的發(fā)酵溫度設(shè)定在30℃。

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

2.3.4 搖床轉(zhuǎn)速的影響

不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)CDA酶活的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)，菌體的生長以及CDA酶活均處于較低的水平。該絲狀真菌為好氧性真菌，轉(zhuǎn)速過低，發(fā)酵瓶內(nèi)的溶氧量不足導(dǎo)致菌絲體代謝異常而影響酶的產(chǎn)量。隨著搖床轉(zhuǎn)速上升至180r/min，酶活及生物量有所增長，搖床轉(zhuǎn)速＞180r/min之后，CDA酶活以及生物量有所下降。因此，將后續(xù)的發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為180 r/min。

圖8 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.8 Effect of shaker rotate speed on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過單因素法對(duì)誘變菌株UV-210S產(chǎn)CDA的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出產(chǎn)CDA最佳培養(yǎng)基配方為麥芽糖1.3%，牛肉浸膏2.6%，NaH2PO40.3%，CaCl20.1%，膠體幾丁質(zhì)0.5%；最佳的發(fā)酵培養(yǎng)條件為NaCl 1.5%，初始pH 9，發(fā)酵溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，CDA收集時(shí)間72 h。經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后該誘變菌株的最高CDA酶活為16.76 U/mL，相比優(yōu)化前的酶活提高了52%。

目前，生物法降解幾丁質(zhì)制備殼聚糖的方法仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，還無法大批量的投入工業(yè)化生產(chǎn)。就本試驗(yàn)優(yōu)化后的結(jié)果來看，CDA的產(chǎn)率遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的水平，仍需要進(jìn)行深入的探討來改善其產(chǎn)酶特性，提高CDA的產(chǎn)率和增強(qiáng)CDA的穩(wěn)定性。

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Optimization of medium formulas and fermentation conditions of a chitin deacetylase-producing mutant strain

QIN Wangyan,LI Yongcheng*
(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

Using a chitin deacetylase(CDA)-producingPenicilium janthinellum1-5-2 from ocean as original strain,strain UV-210S with high CDA-producing was obtained after ultraviolet mutation.By single factor experiments,the optimum medium formulas of strain UV-210S was maltose 1.3%,beef extract 2.6%,NaH2PO40.3%,CaCl20.1%and colloidal chitin 0.5%.The optimum fermentation conditions were NaCl 1.5%,initial pH 9.0,fermentation temperature 30℃,shaker oscillation rate 180 r/min,CDA optimum collection time 72 h.Under the optimum medium formulas and fermentation conditions,the highest CDA activity produced by the mutant strain was 16.76 U/ml,which was 52%higher than that of before optimization.

chitin deacetylase;fermentation;medium;conditions optimization;enzyme activity

TS201.3

0254-5071（2017）09-0050-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.011

2017-07-06

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20163065）

秦汪艷（1991-）女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：李永成（1964-）男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。