劉文龍，王興吉，盛花開，曹世源

（山東隆科特酶制劑有限公司，山東 臨沂 276400）

β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)菌篩選及酶學(xué)特性

劉文龍，王興吉，盛花開，曹世源

（山東隆科特酶制劑有限公司，山東 臨沂 276400）

以黑曲霉（Aspergillus niger）AN為出發(fā)菌株，通過亞硝基胍（NTG）誘變方法獲得了一株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的突變株AN-17。該黑曲霉突變株AN-17在搖瓶中的β-葡萄糖苷酶酶活＞291 U/mL，且傳代發(fā)酵穩(wěn)定性良好。所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶對葡萄糖有良好的耐受性，在葡萄糖含量18%條件下相對酶活為95%；且該酶耐酸耐熱性良好，在pH3.0～6.5條件下處理1 h或75℃保溫處理40 min后，相對酶活＞70%。

黑曲霉；β-葡萄糖苷酶；亞硝基胍誘變；耐糖；耐酸

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。其屬于纖維素酶類，能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基[1]。β-葡萄糖苷酶存在于自然界許多植物、昆蟲、真菌及細(xì)菌體內(nèi)，在纖維素降解[2]、食品去苦增香[3]、果酒增香[4]、醫(yī)藥[5]、病蟲害防治[6]等方面有廣泛應(yīng)用，另外在生產(chǎn)大豆異黃酮活性苷元[7]、天然梔子藍(lán)[8]、表面活性劑[9]等方面也有應(yīng)用。

黑曲霉（Aspergillusniger）是常見的食品安全菌種，所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域中有很好的發(fā)展前景。以黑曲霉AN為出發(fā)菌株，通過亞硝基胍（nitroso-guanidin，NTG）誘變獲得黑曲霉β-葡萄糖苷酶突變株，以期能夠篩選得到高產(chǎn)菌株，并且獲得性能良好的β-葡萄糖苷酶，以提高其應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）AN：本公司研發(fā)中心實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：葡萄糖0.3%，纖維糖粉0.5%，蛋白胨0.08%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.02%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，脫氧膽酸鈉0.1%，瓊脂0.15%，冷卻后加入0.1%對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，p-NPG），pH自然。

復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，纖維糖粉1%，玉米漿1%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.02%，F(xiàn)eSO4·7H2O0.001%，pH自然。

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑及原料

蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；亞硝基胍、對硝基苯葡萄糖苷（分析純）：美國Sigma公司。其他均為國藥集團分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-211C恒溫?fù)u床、ZXSD-AI270恒溫培養(yǎng)箱、ZHJHCI214B超凈工作臺：智城分析儀器有限公司；GI80TW高壓蒸汽滅菌鍋：致微儀器有限公司；HH-2恒溫水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；FA2004B電子天平：上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；5810R型離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 誘變篩選方法

（1）孢子懸液的制備

取無菌生理鹽水洗下黑曲霉AN新鮮斜面上的孢子，將其轉(zhuǎn)移入盛有玻璃珠的三角瓶，在搖床上振蕩打散40min，制成菌懸液，四層擦鏡紙過濾，并進行梯度稀釋，于血球計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整孢子濃度為106個/mL左右[10]。

（2）亞硝基胍誘變[11]

誘變劑量選擇[12]：用處理好的孢子懸浮液，分別以亞硝基胍溶液終質(zhì)量濃度為0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的體系對孢子菌懸液誘變處理60min，吸取處理后的孢子懸浮液涂布于PDA培養(yǎng)平板上，30℃培養(yǎng)2～3 d，計算致死率，以選擇合適的亞硝基胍處理液質(zhì)量濃度。

誘變處理：根據(jù)上述方法選擇出的誘變劑量對黑曲霉孢子懸浮液進行亞硝基胍誘變處理，處理后的孢子懸液涂初篩平板。

（3）初篩

初篩培養(yǎng)基冷卻至60℃后，加入0.1%p-NPG，將誘變處理的孢子懸液涂布在初篩培養(yǎng)平板上，30℃培養(yǎng)2～4 d，p-NPG被酶解后會產(chǎn)生對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP），噴灑1 mol/L的Na2CO3后顯淡黃色，挑選其中黃色較深圈較大的菌落進一步篩選[13]。

（4）復(fù)篩

初篩挑選的菌落接種于裝有30 mL復(fù)篩液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中。30℃、200 r/min培養(yǎng)2～4 d，測β-葡萄糖苷酶酶活。

1.3.2 遺傳穩(wěn)定性[14]

對突變株進行連續(xù)傳代發(fā)酵，30℃、200 r/min培養(yǎng)傳代8次，測定每一代的β-葡萄糖苷酶酶活，每代設(shè)置至少三個平行樣，判斷其遺傳穩(wěn)定性。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性

以發(fā)酵液上清液為樣品，分別在反應(yīng)體系中添加含量0～20%的葡萄糖，測定β-葡萄糖苷酶活力。

以發(fā)酵液上清液為樣品，在pH4.8緩沖液條件下，樣品分別在60～85℃條件下（梯度為5℃）保溫處理70 min，每10min取樣測定剩余β-葡萄糖苷酶酶活，以不作處理的β-葡萄糖苷酶酶活為100%。

以發(fā)酵液上清液為樣品，在50℃條件下，分別在pH 2.0～9.0的緩沖液中處理1 h，然后測定β-葡萄糖苷酶活力，以不作處理的樣品酶活為100%。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶酶活測定[15]

酶活定義：每分鐘釋放出1 μmol p-NP所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

測定方法：發(fā)酵液3 000 r/min離心10 min，得上清液為粗酶液，準(zhǔn)確吸取0.1 mL粗酶液，加入0.9 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH4.8），50℃恒溫水浴鍋預(yù)熱5 min，加入1 mL預(yù)熱的5 mmol/L的p-NPG，秒表計時50℃反應(yīng)10 min，立即加入1 mL 1 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)。在波長420 nm處測定吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變方法的確定

表1 不同NTG誘變劑量對菌株的致死率Table 1 Lethality rate of strains induced by different NTG doses

從表1可看出，隨著亞硝基胍誘變劑量的增加，黑曲霉存活率下降，誘變劑量0.8 mg/mL時，致死率達(dá)到97.8%，劑量達(dá)到1.0 mg/mL時，致死率達(dá)到100%。通常致死率為90%～99%時，正向突變的突變株較多。因此選擇0.8mg/mL亞硝基胍誘變劑量。

2.2 菌株篩選

根據(jù)初篩結(jié)果，選取14株黃色較深圈較大的菌落，進行發(fā)酵搖瓶復(fù)篩，經(jīng)過3批搖瓶發(fā)酵試驗，篩選產(chǎn)酶較高的菌株，結(jié)果見表2。

表2 NTG誘變復(fù)篩的結(jié)果Table 2 Secondary screening results of NTG mutagenesis

由表2可知，突變株AN-17的β-葡萄糖苷酶酶活最高，在復(fù)篩培養(yǎng)基中可達(dá)到291.2 U/mL。

2.3 遺傳穩(wěn)定性

選取產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活最高的菌株AN-17，傳代8次，進行穩(wěn)定性研究，結(jié)果見表3。

表3 突變株AN-17發(fā)酵穩(wěn)定性Table 3 Fermentation stability of mutant strain AN-17

由表3可知，連續(xù)傳8代，酶活并沒有降低，因此確定突變株AN-17具有良好的遺傳穩(wěn)定性，可以用于進一步優(yōu)化中。

2.4 β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性

2.4.1 β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性

由圖1可知，在葡萄糖含量＜16%時對酶活有增強作用，可能是葡萄糖使β-葡萄糖苷酶作用位點發(fā)生改變[16]，使酶活增強，在葡萄糖含量為18%時，相對酶活為95%，說明突變株AN-17所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶具有較高的葡萄糖耐受性。

圖1 β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性曲線Fig.1 Glucose tolerance curve of β-glucosidase

2.4.2 β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性

圖2 β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性曲線Fig.2 Thermal stability curves of β-glucosidase

由圖2可知，60℃條件下其酶活基本沒有降低，65℃稍有下降，75℃處理40min時，該酶相對酶活仍為70%以上，85℃處理20 min相對酶活仍有53%左右，說明該β-葡萄糖苷酶具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.4.3 β-葡萄糖苷酶的pH穩(wěn)定性

圖3 β-葡萄糖苷酶的pH穩(wěn)定性Fig.3 pH stability of β-glucosidase

由圖3可知，在pH 3.0～6.5條件下處理1 h相對酶活仍保留70%以上，具有較好的耐酸性，但是在pH＜3.0或pH＞7.0的條件下，相對酶活較低。

3 結(jié)論

本研究通過NTG誘變方法獲得了一株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的黑曲霉突變株AN-17，并對所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)進行了研究。結(jié)果表明，該黑曲霉突變株AN-17在搖瓶發(fā)酵中的β-葡萄糖苷酶酶活在291 U/mL以上，且連續(xù)傳8代，酶活并沒有降低，遺傳穩(wěn)定性良好。該突變株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶對葡萄糖有良好的耐受性，在葡萄糖含量18%條件下，相對酶活為95%；該酶耐酸耐熱性良好，在pH3.0～6.5條件下處理1h或75℃保溫處理40min后，相對酶活＞70%。鑒于該黑曲霉突變株AN-17及所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的良好特性，可進一步進行優(yōu)化，并用于生產(chǎn)放大。

[1]潘利華，羅建平.β-葡萄糖苷酶的研究及應(yīng)用進展[J].食品科學(xué)，2006，27（12）：803-807.

[2]SALOHEIMO M,PANULA J K,YLOSMAKI E,et al.Enzymatic properties and intracellular localization of the novelTrichoderma reesei β-glucosidase BGLII(Cel1A)[J].Appl Environ Microbiol,2002,68(9):4546-4553.

[3]李 平，宛曉春，陶文沂，等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的食品增香應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2000，26（2）：5-6.

[4]桑 葦.黑曲霉β-葡萄糖苷酶對葡萄酒酶解增香調(diào)控及風(fēng)味物質(zhì)影響的研究[D].無錫：江南大學(xué)，2015.

[5]魯 瑋，岳冬冬，劉新育，等.黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的純化及對中藥糖苷類成分的轉(zhuǎn)化[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2014，45（3）：220-223.

[6]王 曉，沈程文，周躍斌.β-葡萄糖苷酶與茶增香及抗病蟲害的研究進展[J].茶葉通訊，2014，41（4）：8-12.

[7]Y H PYO,T C LEE,Y C LEE.Enrichment of bioactive isoflavones in soymilk fermented with β-glucosidase-producing lactic acid bacteria[J].Food Res Int,2005,38:551-559.

[8]FUJIKKAWA.Skyblue pigment formation from gardenia fruits[J].J Ferment Technol,1987,65(4):419-424.

[9]T R YAN,J C LIAU.Synthesis of alkyl β-glucosides from cellobiose withAspergillus nigerβ-glucosidaseⅡ[J].Biotechnol Lett,1998,20(7):653-657.

[10]佘秋生，楊海波，楊冠軍，等.紫外誘變黑曲霉篩選高產(chǎn)果膠酶菌種[J].中國釀造，2012，31（6）：134-137.

[11]趙 鑫，肖玉平，廖延智，等.L-精氨酸高產(chǎn)菌株的亞硝基胍誘變選育和種子培養(yǎng)基的優(yōu)化研究[J].中國釀造，2014，33（9）：81-85.

[12]李 寧，馬莉岷，戰(zhàn)偉超，等.富產(chǎn)琥珀酸米曲霉菌株的誘變選育[J].中國釀造，2015，34（1）：72-75.

[13]侯曉瑞，王 婧，楊學(xué)山，等.甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株篩選[J].食品科學(xué)，2014，35（23）：139-143.

[14]辛國芹，董佩佩，汪祥燕，等.產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的誘變篩選及遺傳穩(wěn)定性研究[J].中國釀造，2016，35（11）：69-72.

[15]李 華，高 麗.β-葡萄糖苷酶活性測定方法的研究進展[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2007，26（2）：107-114.

[16]張 敏，李佳益，倪永清，等.產(chǎn)β-葡萄糖苷酶非釀酒酵母的篩選及酶學(xué)特性研究[J].中國釀造，2016，35（5）：97-101.

Screening of β-glucosidase-producing strain and the enzymatic characteristic

LIU Wenlong,WANG Xingji,SHENG Huakai,CAO Shiyuan
(Shandong Long Kete Enzyme Co.,Ltd.,Linyi 276400,China)

UsingAspergillus nigerAN as original strain,mutant strain AN-17 with high yield β-glucosidase was obtained by nitrosoguanidine(NTG)mutagenesis.The β-glucosidase activity ofA.nigerAN-17 in shake flask was above 291 U/ml,and its generation fermentation stability was good.The β-glucosidase had good tolerance to glucose,the relative activity retained 95%in 18%glucose concentration.The β-glucosidase had good acid and heat resistance;the relative activity remained above 70%under the treatment condition of pH 3.0-6.5 for 1 h or 75℃for 40 min.

Aspergillus niger;β-glucosidase;nitroso-guanidine mutagenesis;glucose tolerance;acid tolerance

TQ925

0254-5071（2017）09-0120-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.026

2017-07-06

山東省技術(shù)創(chuàng)新項目（201520515022）

劉文龍（1982-），男，工程師，碩士，研究方向為酶制劑生產(chǎn)與開發(fā)。