李 昀， 郭小峰， 周曉海， 王 紅

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點實驗室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

蛋白質(zhì)是氨基酸經(jīng)脫水縮合形成酰胺鍵連接而成的生物大分子，是生命體的重要組成部分和生命活動的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的分離分析在食品安全、臨床醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)藥、遺傳免疫和生物化學(xué)等領(lǐng)域有著重要意義。毛細管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)具有高效、快速、樣品和溶劑用量少、靈敏度高等特點，是分離分析蛋白質(zhì)等生物大分子的強有力工具[1 - 4]。然而，石英毛細管內(nèi)壁存在大量硅羥基。在pH大于3.0的溶液中硅羥基解離，使毛細管內(nèi)壁帶負電，在毛細管內(nèi)壁形成帶負電荷(Si-O)的吸附點。當(dāng)背景電解質(zhì)pH小于蛋白質(zhì)等電點時，這些負電荷會對帶正電荷的蛋白質(zhì)產(chǎn)生靜電吸附[5]。此外，毛細管內(nèi)壁與蛋白質(zhì)分子中的疏水區(qū)域存在疏水作用[5]。這些相互作用將導(dǎo)致CE分離蛋白質(zhì)時出現(xiàn)峰形展寬乃至拖尾，導(dǎo)致分離效率降低、遷移時間重現(xiàn)性下降等問題，在相當(dāng)程度上限制了CE在生物醫(yī)學(xué)分析方面的應(yīng)用。為解決這一問題，對毛細管內(nèi)壁進行修飾是一個有效途徑，可以屏蔽毛細管內(nèi)壁的硅羥基，并使石英表面的性質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化(通常轉(zhuǎn)化為親水性表面)[1]。目前，通常采用的修飾方法主要有動態(tài)涂敷、物理吸附或化學(xué)鍵合[2]。動態(tài)涂敷通過在緩沖溶液中加入與毛細管壁具有強烈相互作用的涂層物質(zhì)，從而形成動態(tài)涂層，具有制備簡單快速、涂層可再生等優(yōu)勢，是CE分離蛋白質(zhì)的一個理想方案[2]，目前常采用的動態(tài)涂敷試劑主要是中性高分子聚合物和陽離子表面活性劑[6]。

離子液體(Ionic Liquids,ILs)蒸氣壓小，不揮發(fā)，電導(dǎo)率強，粘度低，性質(zhì)穩(wěn)定，對無機物和有機物有良好的溶解性，在電化學(xué)[7 - 8]、有機合成[9 - 10]、萃取分離[11 - 12]等化學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在CE中，ILs常作為動態(tài)涂敷試劑、電泳緩沖液添加劑或者共價鍵合涂層試劑，通過物理吸附、共價鍵合等作用力把ILs的陽離子吸附或者鍵合到在毛細管壁上，在毛細管內(nèi)表面形成一均勻的涂層，對毛細管內(nèi)壁進行改性修飾，既可以用于水相，也可以用于非水相分離不同的物質(zhì)，如氨基化合物[13]、抗生素[14]等物質(zhì)。

然而，目前將ILs用于CE分離蛋白質(zhì)的相關(guān)研究和報道很少。Jiang等采用1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(1E-3MI-TFB)離子液體作為毛細管動態(tài)涂敷試劑和緩沖溶液添加劑，對4種堿性蛋白進行了分離，理論塔板數(shù)為104N/m左右[15]。Wu等用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸離子液體(1B-3MI-TFB)用作毛細管電泳的動態(tài)涂敷試劑和唯一運行電解質(zhì)，對3種堿性蛋白和2種酸性蛋白質(zhì)進行了分離，得到了較高的分離效率和重現(xiàn)性[16]。Li等首次將聚合物離子液體用于毛細管電泳，對溶菌酶、細胞色素c、α-胰蛋白酶原A和核糖核酸酶A四種堿性蛋白質(zhì)進行了分離[17]。我們課題組將N-甲基吡咯烷酮磺酸鹽離子液體作為動態(tài)涂敷試劑用于CE分離堿性蛋白，四種堿性蛋白質(zhì)15 min內(nèi)實現(xiàn)基線分離，理論塔板數(shù)在2.0～4.5×105N/m[18]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AgilentG1600A3D毛細管電泳儀(USA,Aglent Technology);Delta-320酸度計(梅特勒-托利多中國(上海)有限公司)；AL 104分析天平(梅特樂-托利多中國(蘇州)有限公司)；熔融石英毛細管：50 cm×75 μm，有效長度為41.5 cm(河北永年銳灃色譜器件有限責(zé)任公司)。

圖離子液體的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure ionic liquid

1.2 毛細管電泳動態(tài)涂敷及蛋白質(zhì)分離條件

2 結(jié)果討論

2.1 離子液體動態(tài)涂敷的機理

使用離子液體作背景電解質(zhì)時或者作為背景電解質(zhì)添加劑時，離子液體的有機陽離子會通過靜電引力動態(tài)吸附到毛細管內(nèi)壁,從而改變毛細管內(nèi)表面的電荷。具有長烷基鏈的N-辛基-2-吡咯烷酮靜電吸附于毛細管內(nèi)壁后，由于其表面活性作用，可使毛細管內(nèi)壁覆蓋更為完全。在分離時，帶正電的堿性蛋白質(zhì)與涂敷在毛細管內(nèi)壁的吡咯烷酮陽離子產(chǎn)生靜電排斥，同時毛細管內(nèi)壁被N-辛基-2-吡咯烷酮覆蓋，避免了由蛋白質(zhì)與毛細管內(nèi)壁的直接接觸引起的其它相互作用，從而改善蛋白質(zhì)的CE分離效果。

2.2 離子液體動態(tài)涂敷分離堿性蛋白質(zhì)的研究

圖2 NaAc-HAc緩沖體系中離子液體濃度對溶菌酶分離效果的影響Fig.2 Effect of ionic liquid concentration in NaAc-HAc buffer on separation of lysozyme(1 mg/mL)Buffer:10 mmol/L NaAc-HAc(pH=4.5);voltage:25 kV;injection:hydrodynamic,50 mbar,4 s;detection:214 nm;temperature:25 ℃. concentration:(a) 0 mmol/L;(b) 1 mmol/L;(c) 2.5 mmol/L;(d) 5 mmol/L;(e) 7.5 mmol/L.

圖3 Tris-HCl緩沖體系中離子液體濃度對溶菌酶分離效果的影響Fig.3 Effect of ionic liquid concentration in Tris-HCl buffer on separation of lysozyme(1 mg/mL)Buffer:10 mmol/L Tris-HCl(pH=4.5);voltage:20 kV;injection:hydrodynamic,50 mbar,4 s;detection:214 nm;temperature:25 ℃. concentration:(a) 1 mmol/L;(b) 2.5 mmol/L;(c) 5 mmol/L;(d) 7.5 mmol/L.

圖4 優(yōu)化分離條件下三種堿性蛋白質(zhì)分離的電泳圖Fig.4 Electropherogram of three basic proteins under optimized separation conditionsBuffer:10 mmol/L Tris-HCl(pH=4.5) containing kV;injection:hydrodynamic,50mbar,4 s;detection:214 nm;temperature:25℃.Peaks:(1) lysozyme(0.33 mg/mL);(2) cytochrome c(0.33 mg/mL);(3) α -chymotrypsinogen A(0.33 mg/mL).

2.2.3分析性能在優(yōu)化條件下得到了三種堿性蛋白質(zhì)的最佳電泳譜圖，如圖4所示。溶菌酶、細胞色素c、α-胰凝乳蛋白酶原遷移時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為4.75%、3.43%和3.61%，說明所建立的方法具有良好重現(xiàn)性。對三種堿性蛋白質(zhì)的分離效率按照公式：N=5.54 ×(tR/W1/2)2進行了計算，其中N為理論塔板數(shù)，tR為相應(yīng)蛋白質(zhì)的遷移時間，W1/2為相應(yīng)蛋白質(zhì)信號峰的半峰寬，結(jié)果見表1。

表1 優(yōu)化分離條件下三種堿性蛋白質(zhì)的理論塔板數(shù)

3 結(jié)論

將同時具有陽離子表面活性劑和離子液體結(jié)構(gòu)特點的N-辛基-2-吡咯烷酮磺酸鹽離子液體作為毛細管電泳動態(tài)涂敷試劑，建立了簡單快速分離堿性蛋白質(zhì)的新方法。離子液體形成的動態(tài)涂層有效抑制了堿性蛋白質(zhì)在毛細管內(nèi)壁上的吸附，分離效率較高，可在8 min內(nèi)實現(xiàn)堿性蛋白質(zhì)溶菌酶、細胞色素c、α-胰凝乳蛋白酶的基線分離，表明此類結(jié)構(gòu)的離子液體作為涂敷試劑在毛細管電泳分離蛋白質(zhì)中具有較好的應(yīng)用潛力。