權(quán)寧海， 康英錦， 李東浩， 商海波

(長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(延邊大學(xué)),延邊大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，吉林延吉 133002)

1 引言

高通量篩選技術(shù)是以含有分子(如酶、受體)和細(xì)胞的微孔板為載體，從大量藥物樣品中篩選出與靶點(diǎn)有相互作用的候選藥物的一種方法，即通過觀察藥物樣品對(duì)靶點(diǎn)的生物活性或整體細(xì)胞的影響，篩選候選藥物[1]。隨著高通量篩選技術(shù)的不斷發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新藥物的重要途徑[2]。中國傳統(tǒng)的中草藥是探索和發(fā)展新藥物的豐富來源[3]。據(jù)記載，直到2010年為止，中國已經(jīng)記錄了大約有12 807種天然來源的藥材，其中11 146種是植物來源，1 581種是從動(dòng)物中提取的，還有80種來自礦物[4]。因此，具有微量、高效、大批量篩選等優(yōu)點(diǎn)的高通量篩選技術(shù)，已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于中草藥中活性成分的篩選領(lǐng)域[5 - 6]。具體篩選通常使用標(biāo)準(zhǔn)的96孔、384孔、1 536孔等微量滴定板，在短時(shí)間內(nèi)篩選大批量樣品。盡管高通量篩選技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于中草藥活性成分的篩選，但是由于中草藥基質(zhì)的復(fù)雜性、活性成分的分離、凈化等繁瑣的樣品前處理過程，篩選中草藥中的活性成分仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)性工作[7]。

2 高通量篩選技術(shù)

目前，高通量篩選技術(shù)分為分子水平和細(xì)胞水平的篩選。它們都是以靶點(diǎn)與活性成分相互作用的原理為基礎(chǔ)而建立的微型體外高通量篩選模型。分子水平主要包括基于酶、受體、離子通道等的高通量篩選模型，它是通過檢測(cè)經(jīng)藥物樣品處理后靶點(diǎn)的活性而篩選靶點(diǎn)抑制劑的一種方法。細(xì)胞水平則是基于整體細(xì)胞的高通量篩選模型，是根據(jù)藥物樣品對(duì)整體細(xì)胞的影響篩選候選藥物的一種方法。近年來，以上微型體外高通量篩選模型逐漸應(yīng)用于中草藥中活性成分的篩選領(lǐng)域。本文匯總了分子水平和細(xì)胞水平高通量篩選技術(shù)在中草藥的應(yīng)用實(shí)例(表1)。

2.1 分子水平模型

2.1.1基于酶的高通量篩選技術(shù)對(duì)于目前的多種疾病，通過中斷細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)綜復(fù)雜的酶途徑，可能會(huì)實(shí)現(xiàn)有效的疾病治療。據(jù)報(bào)道，大部分藥物的作用靶點(diǎn)中，酶占20%以上，例如重組人Rho激酶、脂肪酶、α-葡萄糖苷酶、糜酶2、乙酰膽堿酯酶等。因此，有效發(fā)現(xiàn)酶抑制劑是新藥研發(fā)的主要來源[7]?；诿傅母咄亢Y選模型是通過檢測(cè)酶的反應(yīng)底物或酶反應(yīng)后產(chǎn)物的含量來篩選出酶抑制劑的方法。當(dāng)活性成分與酶作用時(shí)，活性成分將激活或抑制酶的活性，從而影響酶水解產(chǎn)物的含量。宮麗麗等[8]建立了基于熒光素酶發(fā)光法的重組人Rho激酶高通量篩選模型。將重組人Rho激酶、待測(cè)樣品、底物、ATP加入到384孔板中孵育，之后加入Kinase-Glo試劑，用熒光素酶發(fā)光法測(cè)定經(jīng)過化合物或中藥提取物處理后的酶活性。從3萬個(gè)化合物和中藥提取物中篩選出對(duì)重組人Rho激酶有作用的4個(gè)化合物和5個(gè)中藥提取物。孫曉麗等[9]選用脂肪酶或α-葡萄糖苷酶為靶點(diǎn)，建立了基于脂肪酶、α-葡萄糖苷酶的高通量篩選模型。將中藥提取物、脂肪酶、4-甲基傘形酮酯(4-Methylumbelliferyl oleate)加入96孔板中進(jìn)行反應(yīng)，通過測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物4-甲基傘形酮的熒光吸收值，判斷中草藥提取物對(duì)脂肪酶活性的影響。而α-葡萄糖苷酶通過與底物對(duì)-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)反應(yīng)所生成水解產(chǎn)物的紫外吸收情況，計(jì)算水解產(chǎn)物的含量，最終判斷中草藥提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響。從63種中藥提取物中篩選出同時(shí)對(duì)脂肪酶和α-葡萄糖苷酶有抑制作用的5種中藥提取物，分別為荷葉、姜黃、蓽茇、桑枝、桑白皮。上述中藥提取物對(duì)脂肪酶的Ic50值分別為28.00±5.51 mg·L-1、5.24 ±0.51 mg·L-1、14.76±2.58 mg·L-1、4.78±0.58 mg·L-1、3.41±0.67mg·L-1。而對(duì)α-葡萄糖苷酶的Ic50值分別為1.98±0.13 g·L-1、0.18±0.007 g·L-1、0.71±0.08 g·L-1、0.077±0.005 g·L-1、0.089±0.006 g·L-1。

表1 各靶點(diǎn)與中草藥潛在抑制劑匯總表

許芹永等[10]從72種藥食兩用的中藥中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)大部分中藥提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用。在中藥提取物反應(yīng)濃度為0.625 mg·mL-1時(shí)，16種中藥提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果達(dá)到100%。Luo等[11]建立了基于高效液相色譜的α-葡萄糖苷酶抑制劑高通量篩選模型。以α-葡萄糖苷酶為靶點(diǎn)，通過檢測(cè)酶的反應(yīng)產(chǎn)物4-硝基酚的含量，從中草藥川西獐牙菜萃取液中篩選出了對(duì)α-葡萄糖苷酶具有最佳抑制作用的山酮素。王守寶等[12]基于重組倉鼠糜酶2建立了熒光方法測(cè)定酶活性的體外高通量篩選模型。由于底物(N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-7-amido-4-methylcoumarin)在糜酶2 作用下水解生成具有熒光的水解產(chǎn)物(7-amido-4-methylcoumarin)，因此通過該方法測(cè)定經(jīng)中藥作用后糜酶2的活性，從28 060種化合物和12 020種天然物萃取液中篩選倉鼠糜酶2的抑制劑。經(jīng)過初篩，篩選出抑制率大于90%的樣品，最終篩選出Ic50值分別為0.823 μmol·L-1和0.690 μmol·L-1的2種具有較強(qiáng)抑制活性的化合物。周思多等[13]建立了基于乙酰膽堿酯酶的高通量篩選模型。乙酰膽堿酯酶能夠分解碘化硫代乙酰膽堿生成硫代膽堿，再將硫代膽堿與顯色劑DTNB作用，檢測(cè)生成物在405 nm處的光吸收情況，發(fā)現(xiàn)48種不同溶劑中藥提取物中黃柏的乙醇提取物，元胡的乙醇提取物和丹參的乙酸乙酯提取物濃度在76.92 mg·L-1時(shí)，上述3種提取物的Ic50值分別達(dá)到259.12 mg·L-1、229.09 mg·L-1、1 202.26 mg·L-1。

2.1.2基于受體的高通量篩選技術(shù)受體是細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)，它通過細(xì)胞外配基的結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生信號(hào)并引起細(xì)胞內(nèi)不同的生理效應(yīng)。受體的過表達(dá)或突變導(dǎo)致的信號(hào)傳遞紊亂與多種癌癥發(fā)生息息相關(guān)。因此，有效篩選受體抑制劑或激動(dòng)劑至關(guān)重要?；谑荏w的高通量篩選技術(shù)是根據(jù)配體直接作用于受體后檢測(cè)對(duì)受體的影響而進(jìn)行的篩選?；谑荏w的高通量篩選技術(shù)分為直接篩選和間接篩選。直接篩選方法是通過檢測(cè)配基與受體的相互作用而篩選的方法，但是此方法不能確定配基為激動(dòng)劑還是拮抗劑。間接篩選方法則是通過檢測(cè)配基與受體結(jié)合后細(xì)胞生物效應(yīng)的變化而篩選的方法，此方法能夠明確確定配基為激動(dòng)劑還是拮抗劑。

鄧小紅等[14]開發(fā)了以多巴胺D5受體為靶點(diǎn)的細(xì)胞模型高通量篩選，從天然產(chǎn)物中篩選該受體的潛在激動(dòng)劑。首先將多巴胺D5受體和報(bào)告基因同時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，G418篩選后，最終的單克隆細(xì)胞系用于多巴胺D5受體的激動(dòng)劑高通量篩選，成功地從200多種天然產(chǎn)物中篩選出3種潛在的激動(dòng)劑。胡毅翔等[15]以TAS2R14受體為靶點(diǎn)，構(gòu)建了細(xì)胞模型高通量篩選。首先將攜帶綠色熒光蛋白GFP的慢病毒載體-TAS2R14基因轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，收集高滴度的慢病毒濃縮液和感染的HEK293T細(xì)胞，建立高度表達(dá)特異性TAS2R14受體的細(xì)胞模型，篩選120種中草藥提取物和化學(xué)單體，并成功地篩選出了具有激動(dòng)作用的天然抗哮喘中藥單體。張慶等[16]以G蛋白偶聯(lián)受體84(GPR84)即中鏈脂肪酸敏感受體為靶點(diǎn)，構(gòu)建了細(xì)胞模型高通量篩選。首先將質(zhì)?；騁PR84和Gα1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，用抗生素進(jìn)行篩選后，通過RT-PCR、免疫熒光染色和cAMP分析等方法得到穩(wěn)定表達(dá)GPR84的細(xì)胞株，用于高通量篩選GPR84拮抗劑中。曹婧等[17]以組胺H3受體(H3R)為靶點(diǎn)，構(gòu)建了激活劑的細(xì)胞模型高通量篩選。首先將H3R和報(bào)告基因的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)H3R的細(xì)胞株，激活劑結(jié)合于H3R，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)報(bào)告基因的表達(dá)，通過測(cè)定報(bào)告基因的表達(dá)水平，測(cè)定激活劑對(duì)H3R的影響。利用此細(xì)胞模型成功地篩選出與H3R結(jié)合的中藥組分。

2.1.3基于離子通道的高通量篩選技術(shù)離子通道是一類可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子水平的大分子膜蛋白。離子通道參與各種基本的生理過程，其故障導(dǎo)致很多人類疾病。因此，離子通道是一種重要的藥理分析靶點(diǎn)。離子通道的高通量篩選方法包括配體結(jié)合分析、通量基礎(chǔ)檢測(cè)、熒光基礎(chǔ)檢測(cè)、自動(dòng)電生理分析等[18](圖1)。不同離子通道的高通量篩選方法都不同。囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)是上皮氯通道，Luan等[19]將CFTR和鹵素傳感綠色熒光蛋白YFP-H148Q共同表達(dá)在甲狀腺上皮細(xì)胞上，通過通量基礎(chǔ)檢測(cè)，對(duì)34 000種TCM萃取液進(jìn)行了篩選，并通過生物活性分析和核磁共振實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冬凌草中的貝殼杉烷型二萜-冬凌草甲素Oridonin對(duì)CFTR具有潛在抑制作用。Zhang等[20]基于CFTR介導(dǎo)的碘離子流入分析，建立了CFTR離子通道的高通量篩選模型。首先將CFTR和鹵素傳感綠色熒光蛋白EYFP-H148Q基因轉(zhuǎn)染到FRT細(xì)胞上，將轉(zhuǎn)然后的FRT細(xì)胞與中藥提取物進(jìn)行孵化，最終進(jìn)行熒光檢測(cè)。對(duì)500種中草藥進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)中國野生葡萄藤中的白藜蘆醇二聚體和白藜蘆醇四聚體對(duì)CFTR氯離子通道具有抑制作用。Ic50值均達(dá)到0.02 mmol·L-1。同上原理， Chen等[21]建立了CFTR離子通道的高通量篩選模型，從傳統(tǒng)中藥中篩選出對(duì)CFTR氯離子通道具有抑制作用的表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯。

圖1 KCNQ2通道的激活劑的高通量篩選流程圖。利用熒光鉈通量測(cè)定法初篩，其次用384孔IonWorks Barracuda法確認(rèn)先導(dǎo)化合物，驗(yàn)證后用傳統(tǒng)的膜片鉗實(shí)驗(yàn)來表征探針[32]。Fig.1 Flow-chart of the high-throughput screening route for identifying KCNQ2 activators.The fluorescence-based thallium flux assay was used for the primary screen,followed by the confirmatory 384-well IonWorks Barracuda for hit validation.After the hit validation,a conventional patch-clamp experiment was used for probe characterization[32].

2.2 細(xì)胞水平模型

細(xì)胞水平高通量篩選模型是通過觀察整體細(xì)胞活性的變化，篩選影響細(xì)胞活性的藥物(圖2)。不同于分子水平模型，細(xì)胞水平高通量篩選模型可以用于難以分離的蛋白質(zhì)和研究不夠充分的靶點(diǎn)。Zhou等[22]以H9c2心肌細(xì)胞為靶點(diǎn)，建立了一種適用于篩選心肌細(xì)胞保護(hù)劑的高通量篩選模型，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒法，初步篩選出了可以提高受損心肌細(xì)胞活性的17種中草藥。經(jīng)過進(jìn)一步驗(yàn)證，從中篩選出了2種心肌細(xì)胞保護(hù)劑。Gong等[23]建立了一種自然殺傷細(xì)胞與肺癌細(xì)胞和天然產(chǎn)物共培養(yǎng)的高通量篩選模型。根據(jù)分析不同天然產(chǎn)物對(duì)IFN-γ分泌程度的影響和肺癌細(xì)胞的存活率，從502個(gè)天然產(chǎn)物進(jìn)行篩選，鑒定出28個(gè)候選天然產(chǎn)物，通過進(jìn)一步證實(shí)，分析出具有潛在活性的一種化合物，穿心蓮內(nèi)酯。楊秀穎等[24]以肝癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為模板分子建立了MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性的高通量篩選模型。通過利用224種不同溶劑提取出554個(gè)中草藥提取物，從中篩選出了具有特異性抗腫瘤作用的中草藥提取物，最終確定防己乙醇提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞Ic50值分別為8.27 mg·L-1和19.48 mg·L-1。

圖2 基于靶細(xì)胞生物活性的篩選過程示意圖[33]Fig.2.Schematic drawing of target cell-based bioactivity screening process.[33]

2.3 其他篩選模型

埃博拉病毒(EBOV)、拉沙病毒(LASV)、禽流感病毒(AIV)等的感染危害全球人類的健康，因此篩選有效的病毒抑制劑至關(guān)重要。Yang等[25]利用人免疫缺陷病毒的篩選手段，基于細(xì)胞模型高通量篩選，從不同中草藥中篩選了對(duì)埃博拉病毒的天然抑制劑，其中草藥包括梔子、酸橙、紫花地丁、夏枯草、薏苡mayuen變種羅馬草、桑等，并提出它們具有潛在的抗埃博拉病毒活性。Garcia等[26]基于細(xì)胞水平高通量篩選模型，采用天然化合物和中藥分子，利用慢病毒顆粒對(duì)HIV-1抑制劑進(jìn)行了篩選，結(jié)果所篩選出的抑制劑屬于非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。Dai等[27]以A型流感病毒為靶點(diǎn)，利用高通量篩選平臺(tái)從83種中藥中篩選出35種藥用植物，并根據(jù)已有的相關(guān)報(bào)告，發(fā)現(xiàn)矮叢越橘、歐洲葡萄、肉桂有一個(gè)共同活性化合物，原花青素，并發(fā)現(xiàn)原花青素能夠通過生命周期的幾個(gè)階段抑制流感病毒的復(fù)制。

3 問題與展望

經(jīng)數(shù)千年的歷史記載，中草藥作為一種寶貴且天然的資源，已被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療并得到認(rèn)可。許多治療經(jīng)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表明，通過中草藥之間的配伍，可以得到更好的療效，且毒副作用較少[28]。在許多中草藥活性成分的篩選技術(shù)中，高通量篩選技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。并且，高通量篩選技術(shù)與目前先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)、計(jì)算機(jī)篩選技術(shù)、微流控芯片技術(shù)[29 - 31]等的有效結(jié)合，加速了中草藥活性成分的篩選進(jìn)程。但是，近年來“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”概念的提出，篩選并研發(fā)靶點(diǎn)明確、療效突出、安全高效、穩(wěn)定可控的多靶點(diǎn)多組分天然藥物已逐漸成為棘手問題。然而，高通量篩選技術(shù)在基質(zhì)比較復(fù)雜的中草藥中篩選有效成分的過程中，需要一系列復(fù)雜的樣品前處理過程，導(dǎo)致天然藥物研發(fā)周期較長(zhǎng)的問題。并且，對(duì)于細(xì)胞水平的高通量篩選技術(shù)，其作用靶點(diǎn)仍不明確，靶點(diǎn)與有效成分作用比例也不明確。因此，在天然產(chǎn)物新藥研發(fā)中篩選技術(shù)需要?jiǎng)?chuàng)新性突破，并在簡(jiǎn)便快速、精準(zhǔn)有效等方面需要進(jìn)一步得到發(fā)展和完善。