邵 康， 聶阿秀， 韓鶴友

(農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖北武漢 430070)

1 引言

經(jīng)濟(jì)快速增長和人類訴求增加促進(jìn)了畜牧業(yè)的集約化和規(guī)?；l(fā)展。然而，隨之引發(fā)的動物疫病爆發(fā)以及疾病種類逐年增加，嚴(yán)重危害人類健康。據(jù)世衛(wèi)組織(WHO)報(bào)道，至少有140種以上的動物疫病(占動物疾病總量的70%)可以直接由動物傳染給人類。因此，開展動物重大疫病的檢測工作對控制疾病爆發(fā)與蔓延具有重大意義。傳統(tǒng)動物疫病檢測方法主要包括乳膠凝集法(LAT)[1]、原位雜交[2 - 5]、病毒中和試驗(yàn)[6]、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)[7 - 8]、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)[9 - 13]、 DNA芯片檢測技術(shù)[14]等。1986年，乳膠凝集法首次應(yīng)用于實(shí)際，并被批準(zhǔn)用于檢測豬偽狂犬病毒(PrV)特異性抗體[15]。例如，張慧敏等[1]利用靜電作用，將帶有磺酸基的三元聚合物乳膠微球與豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)單克隆抗體結(jié)合，隨后特異性結(jié)合病毒，使乳膠微球凝集實(shí)現(xiàn)對PCV2的檢測。2002年，Seuberlich等[16]首次開發(fā)出串聯(lián)的ELISA檢測技術(shù)，用于同時(shí)檢測PRRSV歐洲型和美洲型兩種抗體，成為日常診斷、流行病調(diào)查以及疾病爆發(fā)調(diào)查的有力工具。Chang等[17]利用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，實(shí)現(xiàn)了對PCV2的快速診斷和定量檢測，并能快速區(qū)分PCV2和PCV1。該方法在一定程度上推動了PCV2相關(guān)疾病的致病機(jī)理的研究，是一種簡單、可靠、價(jià)格低廉的檢測方法。

然而，傳統(tǒng)的檢測方法往往具有耗時(shí)、靈敏度低、假陽性高以及易受干擾等缺點(diǎn)，難以用于大范圍快速準(zhǔn)確地檢測動物病毒。因此，改進(jìn)傳統(tǒng)的檢測方法以及發(fā)展新型的高靈敏檢測技術(shù)對早期檢測動物病毒、減小經(jīng)濟(jì)損失以及提高人類健康水平都具有極其重要的意義。光電學(xué)傳感技術(shù)依托于光學(xué)和電學(xué)分析法，具有靈敏度高、檢測范圍寬、快速等優(yōu)點(diǎn)，已成功用于動物重大疾病的檢測。本文主要介紹比色[18 - 20]、熒光(FL)[21 - 24]、化學(xué)發(fā)光免疫(CLIA)[25]、電化學(xué)[26 - 28]、電化學(xué)發(fā)光(ECL)[29 - 31]以及表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)[32 - 34]傳感技術(shù)在動物疾病檢測中的應(yīng)用。

2 動物疾病的光學(xué)傳感技術(shù)

2.1 比色傳感技術(shù)

ELISA方法是以抗體與抗原特異性識別作用為基礎(chǔ)，利用酶促反應(yīng)的顯色現(xiàn)象和放大作用來達(dá)到檢測目的的一種比色傳感技術(shù)。1971年，ELISA方法首次被開發(fā)并應(yīng)用于免疫球蛋白的測定[18]。之后，ELISA成為實(shí)驗(yàn)室和臨床疾病診斷的黃金方法。然而，傳統(tǒng)的ELISA方法存在著穩(wěn)定性差、檢測限高、檢測范圍窄等缺點(diǎn)，還需要進(jìn)一步改善。針對上述問題，吳龍等[19]對傳統(tǒng)的ELISA方法進(jìn)行了改進(jìn)，用SiO2納米微球負(fù)載辣根過氧化物酶進(jìn)行信號放大，發(fā)展了一種高靈敏的免疫傳感器，并將其用于PCV2抗體的檢測。該方法表現(xiàn)出極高的檢測靈敏度，檢測限可達(dá)0.05 ng/mL。此外，該信號放大的ELISA策略具有檢測速度快、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，在臨床診斷中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

酶作為一種生物催化劑具有高度的專一性、高效性、多樣性等優(yōu)點(diǎn)。然而，酶的催化活性很容易受到溫度、pH等外界條件的影響，容易失活，這在很大程度上限制了它的進(jìn)一步應(yīng)用。吳龍等[20]以Au-Pt/SiO2納米微球(APS NCs)替代傳統(tǒng)的酶，并利用磁珠的捕獲和富集作用，發(fā)展了一種快速高效的無酶標(biāo)記免疫吸附方法(EFISA)，高靈敏檢測PCV2(圖1)。實(shí)驗(yàn)表明，APS NCs穩(wěn)定性好，克服了傳統(tǒng)酶的缺點(diǎn)，且有極好的類酶活性，為無酶免疫傳感提供了新的思路。

圖1 非酶免疫吸附測定系統(tǒng)用于PCV2抗體的檢測[20]Fig.1 Schematic of the enzyme-free immunosorbent assay system for the detection of PCV2 antibody[20]

2.2 熒光傳感

另一方面，信號放大是提高熒光傳感技術(shù)檢測靈敏度的重要手段。在傳統(tǒng)免疫熒光分析中，常常需要通過酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生信號放大[36 - 38]。隨著分析技術(shù)的發(fā)展，利用金屬離子對熒光試劑的信號增強(qiáng)或減弱原理設(shè)計(jì)的一種新的信號放大策略受到了科研工作者的廣泛關(guān)注[39 - 41]。李學(xué)普等[23]基于這種信號放大策略，設(shè)計(jì)出一種基于Ag+和CdSe QDs陽離子置換反應(yīng)的熒光檢測方法。利用釋放的Cd2+增強(qiáng)羅丹明5N的熒光這一特性，實(shí)現(xiàn)了PrV抗體的超靈敏檢測(圖2)。與傳統(tǒng)方法相比，該方法檢測限更低、線性范圍更寬，在動物疾病的檢測方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖2 CdSe QDs陽離子置換反應(yīng)的信號放大法檢測豬偽狂犬病毒抗體[23]Fig.2 The method for detecting PrV antibody based on CdSe QDs with the cation exchange[23]

此外，基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移原理，利用一些納米材料，如氧化石墨烯[42]、碳納米管[43]、Au納米粒子[44]、Fe3O4納米粒子[45]等作為熒光猝滅劑，可以開發(fā)出各種各樣的熒光傳感策略。陳璐等[24]首次將生物相容性好、不易于聚集、導(dǎo)電性好的PtNTs[46]用作QDs的熒光猝滅劑，并基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移原理設(shè)計(jì)了一種用于檢測豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)的熒光探針。與常規(guī)的QDs熒光分析法相比，該工作選取毒性比CdSe、CdTe QDs小的CdTe∶Zn QDs為熒光團(tuán)[47]，擴(kuò)寬了其在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。雖然利用納米材料作為猝滅劑的熒光分析法已經(jīng)普遍存在，但仍需發(fā)展新的納米猝滅劑來實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)檢測。

2.3 化學(xué)發(fā)光免疫傳感

化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)應(yīng)用廣泛，價(jià)格低廉、相比于傳統(tǒng)的ELISA和熒光分析法，避免了光源不穩(wěn)定的干擾，靈敏度和精確度均大大提高。張慧敏等[25]發(fā)展了一種在堿性條件下，NaCl-HCl-Br2氧化魯米諾，AuCl-4加速魯米諾電子轉(zhuǎn)移增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光用于超靈敏檢測豬血清樣品中的PCV2的免疫分析新方法，檢測限可達(dá)2.67×102copy/mL(圖3)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法發(fā)展迅速，但現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光體系有限，急需開發(fā)和完善。此外，進(jìn)一步研究有關(guān)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)制，提高化學(xué)發(fā)光效率也是很有必要的。

圖3 化學(xué)發(fā)光免疫分析法用于高靈敏檢測豬圓環(huán)病毒2型[25]Fig.3 Schematic of ultrasensitive CLIA for the detection of PCV2[25]

2.4 表面增強(qiáng)拉曼散射傳感

表面增強(qiáng)拉曼散射具有超高的靈敏度、高選擇性、高分辨率、無需樣品預(yù)處理以及對檢測樣品沒有損傷等優(yōu)點(diǎn)，在疾病診斷和生物分析中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。羅志輝等[32]基于多枝Au納米粒子的高SERS活性，以其為SERS增強(qiáng)基底，并用拉曼標(biāo)記分子p-巰基苯甲酸(p-MBA)對其進(jìn)行標(biāo)記，開發(fā)了單一組分SERS傳感器，并將其用于PCV2的檢測。這種SERS探針制備簡單、不需要太復(fù)雜的修飾，為SERS傳感器用于動物病毒的檢測提供了基礎(chǔ)。雖然這類探針已經(jīng)得到了較為廣泛的應(yīng)用，但是由于穩(wěn)定性和靈敏度方面還存在一些問題，限制了其更廣泛的應(yīng)用。羅志輝等[33]對原來單一組分SERS探針進(jìn)行改進(jìn)，利用種子生長法，以具有強(qiáng)SERS活性的p-巰基苯胺(p-ATP)包裹的雙金屬Au/Ag核殼納米粒子構(gòu)建SERS探針，用于豬鏈球菌病(SS2)的標(biāo)志物溶菌酶釋放蛋白(MRP)的檢測，從而為SS2的確認(rèn)提供有用的診斷信息(圖4)。這種方法檢測靈敏度高、快速，可應(yīng)用于各種疾病標(biāo)志物的實(shí)際檢測，為早期診斷提供科學(xué)依據(jù)。

3 動物疾病的電學(xué)傳感

3.1 電化學(xué)傳感

圖4 Au/Ag核殼納米粒子SERS探針的構(gòu)建及其用于MRP檢測[33]Fig.4 Schematic of SERS sensor based on pATP embedded Au/Ag core-shell nanostructures for detection of MRP[33]

電化學(xué)分析法具有成本低、功耗低、靈敏度高以及兼容性好等優(yōu)點(diǎn)。而納米技術(shù)與電化學(xué)技術(shù)的交叉融合，更促進(jìn)了電化學(xué)傳感技術(shù)的發(fā)展[48]。例如，利用磁性納米材料與磁性電極結(jié)合，可以大幅度提高生物分子或信號標(biāo)簽在電極表面的固定效率和穩(wěn)定性，減少了傳感器構(gòu)建過程的復(fù)雜性和不確定性[49]。李芳等[26]選用磁珠和Au納米粒子分別作為捕獲劑和電化學(xué)信號標(biāo)簽，利用抗原-抗體-二抗結(jié)合模式，構(gòu)建出基于自制磁性電極的電化學(xué)免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了快速、靈敏地檢測豬血清中的PrV抗體，適用于臨床診斷。

然而，抗原、抗體、DNA等電子惰性材料對電極有一定的封閉效應(yīng)，不利于電子的傳遞，導(dǎo)致電化學(xué)信號較弱，一定程度上會降低方法的檢測靈敏度[50]。因此，提高電極與電活性物質(zhì)間的電子傳遞速率以及降低惰性材料對電極的封閉效應(yīng)有利于電化學(xué)信號的增強(qiáng)。Huang等[27]利用導(dǎo)電性好、比表面積大、電子轉(zhuǎn)移速度快的石墨烯，構(gòu)建了一種基于石墨烯和Ag納米粒子信號放大的“三明治”式電化學(xué)傳感器，大幅度提高電子的傳遞速率，減少抗原抗體對電極的封閉效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對禽流感病毒H7的超靈敏檢測。Dong 等[28]首次將DNA四面體探針引入到電化學(xué)傳感器中，避免了單鏈DNA鈍化電極的問題，設(shè)計(jì)了DNA四面體納米探針，用于檢測禽流感病毒H7N9。該方法具有較好的選擇性、靈敏度和穩(wěn)定性，為DNA四面體支架用于基因水平上檢測病毒或病原體提供了基礎(chǔ)。

3.2 電化學(xué)發(fā)光傳感

電化學(xué)發(fā)光也叫電致化學(xué)發(fā)光(ECL)，是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)[51]。實(shí)現(xiàn)電化學(xué)發(fā)光傳感技術(shù)信號放大主要從以下三個(gè)層面：增強(qiáng)基底、提高單個(gè)信號標(biāo)簽的發(fā)光效率以及增加單位空間內(nèi)的信號標(biāo)簽數(shù)目。原位產(chǎn)生共反應(yīng)劑是一種較好的提高信號標(biāo)簽發(fā)光效率的策略。王海軍等[29]利用仿雙酶原位產(chǎn)生共反應(yīng)劑過二硫酸鹽，大幅度提高了信號標(biāo)簽的發(fā)光效率，實(shí)現(xiàn)了SS2的高靈敏檢測。然而，單單提高發(fā)光效率，靈敏度不能得到很大提高，邵康等[30]從信號放大的三個(gè)層面，以石墨烯-金的基底增強(qiáng)效應(yīng)，多孔SiO2微球的載體作用以及生物素-鏈霉親和素“生物橋”作用構(gòu)建了協(xié)同信號放大的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，提出了一種“伸展-裝載-生長”的通用放大策略，并首次將其應(yīng)用到PrV抗體的檢測中(圖5)。該方法靈敏度極高且可靠，尤其是提出的一種通用的可調(diào)諧信號放大策略對信號放大型傳感器的構(gòu)建有一定的指導(dǎo)和借鑒意義。

降低背景干擾是提高電化學(xué)發(fā)光傳感準(zhǔn)確度的重要方面。當(dāng)前的電化學(xué)發(fā)光傳感器的發(fā)射波長大多位于可見光區(qū)域，其電化學(xué)發(fā)光信號很容易受到生物樣品本身的背景信號干擾，近紅外區(qū)域的電化學(xué)發(fā)光可以解決這些問題。邵康等[31]首次將多孔的Au/PtAu雙金屬異質(zhì)結(jié)納米管作為催化劑引入到ECL傳感器中，利用CdTe/CdS QDs作為近紅外發(fā)射器，選用碳納米管作為增強(qiáng)基底，鉑金納米管作為類酶催化劑，并基于環(huán)糊精和金剛烷主客體識別作用進(jìn)行信號放大，構(gòu)建了近紅外區(qū)信號放大的“三明治”式ECL傳感器，對PRRSV進(jìn)行檢測。該傳感器具有高的靈敏度及穩(wěn)定性，推動了近紅外ECL傳感器的發(fā)展。此外，單信號電化學(xué)發(fā)光傳感器容易受到外界環(huán)境的影響，導(dǎo)致信號產(chǎn)生波動或不穩(wěn)定，從而影響檢測結(jié)果。而雙信號比率型檢測可以通過自校準(zhǔn)作用消除這些影響，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確可靠[52 - 54]。不過可惜的是，到目前為止，比率型電化學(xué)發(fā)光傳感器還未被應(yīng)用到動物疾病的檢測中。

縱觀以上檢測方法，其在動物疾病檢測中各有優(yōu)缺點(diǎn)。幾種檢測方法的比較如表1所示。比色法快速簡單，但誤差較大；熒光分析法提高了檢測靈敏度，但易于受到其他物質(zhì)的干擾，導(dǎo)致應(yīng)用受限；電化學(xué)及電化學(xué)發(fā)光方法具有高度的選擇性和靈敏性，但其重現(xiàn)性和穩(wěn)定性還有待改進(jìn)，且非特異性吸附等問題仍有待解決；表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)作為一種新的檢測技術(shù)，大大提高了檢測靈敏度，但拉曼基底的制備方面仍有待提高。

表1 比較檢測動物疾病的不同方法

5 總結(jié)與展望

近年來，隨著人們生活水平的提高，健康意識逐漸增強(qiáng)，而動物疾病的發(fā)生，不僅對畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，還會嚴(yán)重危害人類健康。因此，越來越多的科研工作者致力于開發(fā)簡單快速且靈敏高效的光電分析技術(shù)，用于早期診斷動物疾病。盡管針對動物疾病的檢測已經(jīng)發(fā)展出許多光電傳感策略，并取得了一定的進(jìn)展，但其在實(shí)用性及準(zhǔn)確性等方面仍需做出一些努力。一方面，設(shè)計(jì)高靈敏度、可重復(fù)使用的光電傳感技術(shù)，可明顯降低成本；實(shí)現(xiàn)檢測的自動化、微型化，有助于實(shí)時(shí)實(shí)地檢測動物疾病，為應(yīng)用于臨床提供了可能。另一方面，降低非特異性吸附，排除外界環(huán)境條件等因素干擾，提高識別特異性和選擇性，為動物疾病的精準(zhǔn)檢測提供基礎(chǔ)。此外，開發(fā)新型的傳感模式有利于深入研究疾病的致病機(jī)理，做到從基因水平研究疾病，推動基因檢測在動物疾病檢測中的發(fā)展。實(shí)現(xiàn)未來檢測動物疾病傳感器的微型化、功能化、智能化、集成化仍是一大挑戰(zhàn)，有待于科研工作者的共同努力。