孔凡鵬， 時(shí)曉慧， 舒迎爭(zhēng)， 范楠楠， 梁慕文， 唐 波

(分子與納米探針教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東師范大學(xué)化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014)

1 引言

細(xì)胞與活體中的小分子(Rective Small Molecules,RSMs)通過(guò)維持分子網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)生命活動(dòng)的調(diào)控，它們中的活性小分子變化行為與疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。準(zhǔn)確檢測(cè)這些生物活性小分子，探究它們參與的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，對(duì)剖析重大疾病發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制以及診療意義重大。在眾多成像技術(shù)中，熒光成像技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)[1 - 3]，如：可達(dá)到單分子檢測(cè)的高靈敏性、可控,可實(shí)現(xiàn)對(duì)亞細(xì)胞器及納秒級(jí)的時(shí)空分辨。近年來(lái)，越來(lái)越多的結(jié)構(gòu)多樣、靈敏度高、選擇性好的小分子熒光探針被應(yīng)用于活細(xì)胞與活體內(nèi)活性分子的成像檢測(cè)[4 - 6]。

2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

2.1 還原性活性小分子的熒光檢測(cè)

谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的小分子巰基化合物，在清除體內(nèi)毒素和自由基的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9]。GSH含量的異?？赡軐?dǎo)致癌癥、衰老、心血管疾病以及其他病癥。Kim研究組[10]設(shè)計(jì)合成了能定位于線粒體的近紅外熒光探針1用于特異性檢測(cè)GSH(圖1)。由于硝基偶氮苯對(duì)花菁母體的熒光猝滅效應(yīng)，該探針本身無(wú)熒光，GSH使硝基偶氮苯從花菁母體上解離，從而使近紅外熒光恢復(fù)。在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行的共聚焦成像顯示，探針作為線粒體內(nèi)GSH示蹤劑，其性能優(yōu)于目前商業(yè)化的GSH探針和線粒體定位染料。Yoon研究組[11]設(shè)計(jì)合成了一種以花菁為母體，5-二甲氨基-丹酰胺作為識(shí)別基團(tuán)的特異性檢測(cè)GSH的近紅外熒光探針2(圖1)，并成功應(yīng)用于對(duì)小鼠體內(nèi)的肝臟、腎臟、脾臟和肺等器官中GSH水平變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

圖1 探針1和2的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.1 Structures and response mechanisms of probes 1 and 2

楊清正研究組[12]設(shè)計(jì)出一種以氯代BODIPY為母體的比率型熒光探針3(圖2)，該探針中的氯原子首先與巰基發(fā)生巰基-鹵素親核取代反應(yīng)生成硫代BODIPY，Cys和Hcy結(jié)構(gòu)中的氨基與硫原子發(fā)生重排形成氨基取代的BODIPY，而GSH與探針只發(fā)生巰基-鹵素親核取代反應(yīng)形成硫代BODIPY，兩種不同取代的BODIPY呈現(xiàn)不同的光物理性質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)探針對(duì)GSH 的特異性識(shí)別。Li研究組[13]以乙二醛腙為反應(yīng)位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成了一種近紅外熒光探針4(圖2)。GSH與探針中的醛基進(jìn)行加成反應(yīng)，隨后內(nèi)酰胺水解開(kāi)環(huán)形成具有強(qiáng)熒光的部花菁。而Cys或Hcy能與探針形成穩(wěn)定的五環(huán)或六環(huán)雜環(huán)，無(wú)法使內(nèi)酰胺開(kāi)環(huán)，部花菁熒光不能恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)探針對(duì)GSH的特異性檢測(cè)。

圖2 探針3和4的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.2 Structures and response mechanisms of probes 3 and 4

H2S是繼NO和CO之后的第三種氣體信號(hào)分子。研究發(fā)現(xiàn)H2S在許多生理過(guò)程中，例如在調(diào)節(jié)血壓、傳遞神經(jīng)信號(hào)等方面發(fā)揮著重要作用[14]?；贖2S可將疊氮還原為氨基的原理， Pluth研究組[15]設(shè)計(jì)合成了兩種熒光探針5和6(圖3)用于特異性檢測(cè)H2S。在H2S的作用下探針5結(jié)構(gòu)中的疊氮還原為氨基，從而使內(nèi)酯螺環(huán)結(jié)構(gòu)開(kāi)環(huán)，導(dǎo)致熒光顯著增強(qiáng)，利用該探針實(shí)現(xiàn)了斑馬魚(yú)體內(nèi)H2S的可視化熒光成像。探針自身基本沒(méi)有熒光，與H2S反應(yīng)后生成熒光團(tuán)，同時(shí)釋放氧硫化碳，氧硫化碳在碳酸酐酶的作用下轉(zhuǎn)化為H2S。探針6區(qū)別于以往探針的最大特點(diǎn)在于反應(yīng)消耗一分子H2S的同時(shí)釋放一分子H2S，從而保持生物樣品中H2S的濃度不變。

圖3 探針5和6的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.3 Structures and response mechanisms of probes 5 and 6

Bea研究組[16]設(shè)計(jì)合成測(cè)H2S濃度變化的比率型雙光子熒光探針7(圖4)。 并利用雙光子成像實(shí)現(xiàn)了對(duì)星形細(xì)胞和腦切片中由胱硫醚-β-合成酶催化產(chǎn)生的內(nèi)源性的H2S的監(jiān)測(cè)?；贖2S與碳氮雙鍵的親核加成反應(yīng)，郭子建研究組[17]設(shè)計(jì)合成了一種比率型熒光探針8該探針由香豆素和部花菁組成，在生理pH環(huán)境下，HS-與探針中碳氮雙鍵發(fā)生親核加成反應(yīng)，使得探針652 nm處的特征發(fā)射峰熒光明顯下降，510 nm處特征發(fā)射峰熒光顯著增加，從而實(shí)現(xiàn)了探針對(duì)H2S的比率熒光檢測(cè)。采用該探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)MC-7細(xì)胞線粒體中內(nèi)源性H2S的可視化成像?；诖?lián)親核加成反應(yīng)，唐波研究組[18]設(shè)計(jì)合成了一種以花菁為熒光母體的近紅外比率型H2S熒光探針9(圖4)。探針在780 nm處有熒光發(fā)射，H2S對(duì)醛基親核加成后，生成的巰基中間體進(jìn)一步與酯羰基發(fā)生親核加成反應(yīng)，釋放出酮式花菁，在625 nm處出現(xiàn)新的熒光發(fā)射峰。探針在625nm和780nm的熒光強(qiáng)度比值I625/I780與H2S濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。作者利用該探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞中內(nèi)源性H2S的比率熒光成像檢測(cè)。

圖4 探針7，8和9的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.4 Structures and response mechanisms of probes 7,8 and 9

圖5 探針10和11的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.5 Structures and response mechanisms of probes 10 and 11

過(guò)硫化氫(H2S2)及多硫化氫(H2Sn，n>2)是H2S參與生命體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的產(chǎn)物。因此，設(shè)計(jì)可選擇性檢測(cè)多硫化物的熒光探針具有非常重要的意義。Xian研究組[19]設(shè)計(jì)合成了首個(gè)可檢測(cè)H2S2的熒光探針10(圖5)。探針本身熒光微弱，當(dāng)H2S2存在時(shí)，探針結(jié)構(gòu)中的巰基與H2S2反應(yīng)生成含有-S-SH的中間體，該中間體進(jìn)一步發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化，形成含有二硫鍵的五元環(huán)脫去，釋放出熒光團(tuán)，致使熒光顯著增加。以此探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)H9C2細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中H2S2的熒光成像檢測(cè)。基于多硫化物H2Sn含有兩個(gè)-SH的結(jié)構(gòu)特性，Xian研究組[20]設(shè)計(jì)合成了以熒光素為母體，含有兩個(gè)親電反應(yīng)基團(tuán)的熒光探針11(圖5)。探針本身基本沒(méi)有熒光，當(dāng)H2S2存在時(shí)，巰基首先與氟原子發(fā)生親核取代反應(yīng)，形成含有-S-SH結(jié)構(gòu)的中間體，而中間體中的-SH可與酯羰基發(fā)生親核加成反應(yīng)，然后消除含有二硫鍵的五元環(huán)，釋放出熒光素，使得熒光顯著增強(qiáng)。利用該探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)HeLa細(xì)胞中H2S2的可視化熒光成像檢測(cè)。

圖6 探針12和13的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.6 Structures and response mechanisms of probes 12 and 13

硒在許多代謝過(guò)程中都起著至關(guān)重要的作用[24]，研究表明硒的生理功能依賴(lài)于其在生物體內(nèi)存在的化學(xué)形態(tài)[25]。硒主要是以硒代半胱氨酸參與體內(nèi)蛋白質(zhì)、酶和輔酶的合成，進(jìn)來(lái)研究表明硒對(duì)于癌癥具有預(yù)防和治療作用。唐波研究組[26]設(shè)計(jì)合成了一種以部花菁為熒光基團(tuán)，苯并硒二唑?yàn)轫憫?yīng)基團(tuán)的熒光探針14(圖7)。在pH=7.4的生理?xiàng)l件下，探針結(jié)構(gòu)中的苯并硒二唑與硒醇反應(yīng)，生成鄰苯二胺供電子基團(tuán)，熒光顯著增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞中硒醇的可視化熒光成像，并研究了Na2SeO3誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡與硒醇含量的關(guān)系。H2Se是體內(nèi)硒元素重要的代謝中間體，涉及多種病理生理學(xué)過(guò)程。唐波研究組[27]設(shè)計(jì)合成了一種近紅外熒光探針15(圖7)在細(xì)胞及活體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)H2Se的熒光成像。H2Se打斷探針結(jié)構(gòu)中的硒氮鍵，將苯并硒二唑結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)猷彵蕉饭╇娮芋w，致使熒光增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度隨著H2Se濃度在一定范圍的增加而顯著加強(qiáng)，且兩者具有良好的線性關(guān)系。作者采用該探針并初步揭示了在乏氧條件下亞硒酸鈉的抗癌機(jī)制為非氧化脅迫作用。

圖7 探針14和15的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.7 Structures and response mechanisms of probes 14 and 15

硫氧還蛋白還原酶(TrxR)是一種重要的硒酶，房建國(guó)研究組[28]設(shè)計(jì)合成了以萘酰亞胺為熒光母體，環(huán)內(nèi)二硫鍵為識(shí)別基團(tuán)的熒光探針16(圖8)，用于檢測(cè)TrxR的酶活性。探針本身熒光很弱，與TrxR反應(yīng)后，S-S鍵被-SeH進(jìn)攻，使得S-S鍵斷裂，進(jìn)而與酯羰基發(fā)生分子內(nèi)的環(huán)化，形成的五元環(huán)脫落，釋放出萘酰亞胺熒光母體，利用該探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)硫氧還蛋白還原酶的可視化成像。在檢測(cè)硫氧還蛋白還原酶基礎(chǔ)上，房建國(guó)研究組[29]設(shè)計(jì)篩選出了一種以香豆素為熒光母體的檢測(cè)硒醇的熒光探針17(圖8)。2,4-二硝基苯磺?；鳛槿彪娮拥臒晒忖缁鶊F(tuán)與香豆素相連，使得探針本身熒光猝滅，在pH=7.4的生理?xiàng)l件下，R-Se-親核進(jìn)攻探針的響應(yīng)基團(tuán)，致使2,4-二硝基苯磺?；撀?，香豆素的熒光恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)了HepG2細(xì)胞內(nèi)源性硒醇的可視化成像分析。

圖8 探針16和17的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.8 Structures and response mechanisms of probes 16 and 17

2.2 氧化性活性小分子的檢測(cè)

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)主要包括羥基自由基、過(guò)氧化氫、單線態(tài)氧、羥基自由基和超氧陰離子等，它們?cè)诩?xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[30]和免疫[31]作用中起著重要的作用。然而,ROS濃度水平過(guò)高會(huì)破壞機(jī)體內(nèi)生物分子，引起多種疾病[32]。

在諸多活性氧中，·OH氧化能力最強(qiáng)，能夠通過(guò)將蛋白質(zhì)、糖類(lèi)降解，使脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA斷裂，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可修復(fù)的損傷，影響生物體的生理學(xué)和病理學(xué)過(guò)程，進(jìn)而引發(fā)各類(lèi)疾病。Turro研究組[33]以2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧自由基為識(shí)別基團(tuán)設(shè)計(jì)合成了特異性檢測(cè)羥基自由基的熒光探針18(圖9)。探針結(jié)構(gòu)中的氮氧自由基能捕獲·OH與二甲亞砜(DMSO)反應(yīng)后產(chǎn)生的·CH3，導(dǎo)致羅丹明開(kāi)環(huán)，熒光恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)·OH的間接測(cè)定。利用該探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)PMA刺激下HepG2細(xì)胞線粒體中·OH的熒光成像。Tae 研究組[34]設(shè)計(jì)了一個(gè)以酰肼為識(shí)別基團(tuán)的羅丹明類(lèi)熒光探針19(圖9)用于特異性檢測(cè)·OH，并成功應(yīng)用于A549細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中·OH的熒光成像。張忠平研究組[35]基于熒光素染料設(shè)計(jì)合成了能區(qū)別HClO和·OH的熒光探針20(圖9)。 該探針與HClO反應(yīng)時(shí)，內(nèi)酰胺螺環(huán)打開(kāi)，呈現(xiàn)熒光素的綠色熒光；而與氧化性更強(qiáng)的·OH反應(yīng)時(shí)，熒光素中苯環(huán)被氧化開(kāi)環(huán)，形成青色熒光產(chǎn)物。作者實(shí)利用該探針現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞線粒體中HClO和·OH的熒光成像檢測(cè)。

圖9 探針18,19和20的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.9 Structures and response mechanisms of probes 18,19 and 20

基于PET和形成分子間氫鍵的機(jī)理，劉志洪研究組[36]以酰肼為識(shí)別位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成了檢測(cè)丙二醛的熒光探針21(圖10)，并利用該探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)H2O2刺激條件下HeLa細(xì)胞中丙二醛濃度變化的熒光熒光成像。林偉英研究組[37]以肼為識(shí)別基團(tuán)設(shè)計(jì)合成了靶向線粒體檢測(cè)丙二醛熒光探針22(圖10)，并實(shí)現(xiàn)了HeLa細(xì)胞中丙二醛的熒光成像。

圖10 探針21和22的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.10 Structures and response mechanisms of probes 21 and 22

圖11 探針23和24的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.11 Structures and response mechanisms of probes 23 and 24

圖12 探針25,26和27的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.12 Structures and response mechanisms of probes 25,26 and 27

基于中位吡咯基團(tuán)對(duì)BODIPY母體的“增強(qiáng)型”P(pán)ET效應(yīng)和能被HClO的選擇性氧化，彭孝軍研究組[43]設(shè)計(jì)合成了 “增強(qiáng)型PET”的HClO熒光探針28(圖13)，可用于超靈敏(檢測(cè)限為0.56 nmol)、快速、高選擇性地檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)本真次氯酸的含量。該探針被用于對(duì)癌細(xì)胞內(nèi)HClO和由伊利司莫誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞HClO濃度波動(dòng)進(jìn)行成像。HBrO的缺乏會(huì)影響膠原蛋白的活性，進(jìn)一步影響動(dòng)物的發(fā)育，唐波研究組[44]設(shè)計(jì)合成了一種極易商品化的小分子熒光探針29用于HBrO超靈敏檢測(cè)(圖13)。該探針通過(guò)HBrO催化產(chǎn)生共軛度擴(kuò)增產(chǎn)物，極大提高信噪比，首次成功區(qū)分了正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞內(nèi)HBrO水平的差異，以及斑馬魚(yú)不同發(fā)育期體內(nèi)HBrO分布的狀況。因此，探針29將成為一種有前景的實(shí)用探針材料用于HBrO調(diào)控膠原蛋白活性及膠原蛋白過(guò)量表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)研究?；谂鹚狨ズ土騼?nèi)酯雙識(shí)別基團(tuán)，Yoon研究組[45]設(shè)計(jì)合成了一種對(duì)HClO特異性響應(yīng)的熒光探針30(圖13)。該探針只有在ClO-作用下，發(fā)生芳基硼酸酯和硫內(nèi)酯水解，形成熒光素。利用該探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)果蠅體內(nèi)ClO-熒光成像。馬會(huì)民研究組[46]以硫內(nèi)酯為識(shí)別基團(tuán)構(gòu)建了能定位于線粒體ClO-的熒光探針31(圖13)。并對(duì)處于細(xì)菌感染期的巨噬細(xì)胞的線粒體中的ClO-進(jìn)行了熒光成像。

圖13 探針28，29，30和31的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.13 Structures and response mechanisms of probes 28,29,30 and 31

基于硒化物消除反應(yīng)，江華研究組[47]設(shè)計(jì)合成了兩種基于的對(duì)HClO特異性響應(yīng)的熒光探針32(圖14)，并成功應(yīng)用于Raw264.7細(xì)胞中HClO的熒光成像?；赑ET機(jī)理，以硒醚為識(shí)別基團(tuán)，唐波研究組[48]設(shè)計(jì)合成了一種用于可逆檢測(cè)HClO的雙光子熒光探針33(圖14)。并成功地對(duì)在斑馬魚(yú)和小鼠中的HClO水平進(jìn)行了雙光子熒光成像。Yoon研究組[49]以咪唑啉-2-硫酮為識(shí)別基團(tuán)設(shè)計(jì)合成了對(duì)ClO-特異性響應(yīng)的熒光探針34(圖14)，并利用雙光子熒光成像技術(shù)，對(duì)活細(xì)胞和組織中ClO-進(jìn)行的成像分析。

圖14 探針32,33和34的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.14 Structures and response mechanisms of probes 32,33 and 34

活性氮(RNS)是生物體內(nèi)另一類(lèi)重要氧化性活性物種[50 - 51]，其主要包括NO、NO2、過(guò)氧亞硝酰、硝酰等。RNS在各種生理和病理過(guò)程中起重要作用，如NO是重要的氣體信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)血壓、傳遞神經(jīng)信號(hào)等方面發(fā)揮著重要作用[52 - 53]；過(guò)氧亞硝酰能氧化脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物和DNA，從而導(dǎo)致心血管疾病、神經(jīng)性疾病、炎癥和癌癥產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞與活體內(nèi)特異性檢測(cè)RNS具有重要的意義。Nakagawa研究組[54]設(shè)計(jì)合成了第一個(gè)不含金屬離子的檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)硝酰的分子熒光探針35(圖15)。通過(guò)三苯基膦與硝酰的反應(yīng)形成氮雜內(nèi)鎓鹽導(dǎo)致羅丹明熒光團(tuán)的開(kāi)環(huán)，產(chǎn)生強(qiáng)熒光。錢(qián)旭紅研究組[55]設(shè)計(jì)合成了用于檢測(cè)過(guò)氧亞硝基陰離子的三通道熒光探針36(圖15)。在過(guò)氧亞硝氧化作用下，經(jīng)歷一個(gè)橙色發(fā)光中間體37后，形成紅色的試鹵靈衍生物38，其他ROS和RNS對(duì)于過(guò)氧亞硝酰的檢測(cè)均不產(chǎn)生干擾。該探針已成功地應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧亞硝酰陰離子的熒光成像。

圖15 探針35和36的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.15 Structures and response mechanisms of probes 35 and 36

2.3 金屬離子的檢測(cè)

在生物體內(nèi)，鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、銅、鋅等金屬離子廣泛參與生命過(guò)程，它們是維持生命活動(dòng)所必需的元素[56]。銅是一種必須的微量元素，它常以輔基的形式參與細(xì)胞內(nèi)多種重要的代謝途徑。如在賴(lài)氨酸氧化酶參與結(jié)締組織的形成和胺原交聯(lián)，超氧化物歧化酶清除體內(nèi)自由基，細(xì)胞內(nèi)銅離子調(diào)控這些酶的活性，其濃度影響這些酶的功能的發(fā)揮[57 - 58]。Taki研究組[59]設(shè)計(jì)了第一個(gè)反應(yīng)型的Cu(Ⅰ)熒光探針39(圖16)， Cu(Ⅰ)催化氧化使探針結(jié)構(gòu)中芐基醚C-O鍵斷裂，導(dǎo)致熒光素?zé)晒饣謴?fù)。Chang研究組[60]基于與銅離子螯合的硫醚基團(tuán)和線粒體定位基團(tuán)三苯基鏻設(shè)計(jì)了熒光探針40(圖16)，該探針能有效地檢測(cè)線粒體內(nèi)的銅離子濃度變化，并成功應(yīng)用于監(jiān)測(cè)抗壞血酸鹽誘導(dǎo)C6細(xì)胞中Cu(Ⅰ)的濃度波動(dòng)。Chang研究組[61]還設(shè)計(jì)了一種基于雜化熒光素Cu(Ⅱ)熒光探針41(圖16)，探針結(jié)構(gòu)中三氟甲基可使芳基-芳基旋轉(zhuǎn)的非輻射衰減最小化，進(jìn)而提高熒光團(tuán)的量子產(chǎn)率。研究者利用該探針研究了Cu(Ⅱ)在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮的生理作用。

圖16 探針39,40和41的結(jié)構(gòu)式Fig.16 Structures of probes 39,40 and 41

K+是生物體中最為豐富的金屬離子之一， K+除了與Na+一起維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓及電解質(zhì)平衡，在肌肉收縮、神經(jīng)傳遞、腎臟功能等諸多方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用[62]。人體中K+的失衡是許多疾病的誘因，如心臟病、糖尿病、癌癥等。因此，急需發(fā)展高選擇性、高靈敏度的檢測(cè)細(xì)胞及活體中K+的熒光探針。Meldrum研究組[63]報(bào)道了一個(gè)高選擇性檢測(cè)線粒體中K+的熒光探針42(圖17)。探針結(jié)構(gòu)以氮雜穴狀配體作為K+識(shí)別基團(tuán)，以親脂性三苯基膦陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)定位線粒體，以BODIPY作為熒光團(tuán)。該探針能很好地響應(yīng)30～500 mmol/L的K+，且pH值及其他各種金屬離子不干擾。作者利用該探針成功可視化了HeLa及U87MG細(xì)胞在離子霉素誘導(dǎo)下線粒體中K+的外流。

唐波研究組[64]設(shè)計(jì)合成了一個(gè)近紅外熒光探針43(圖17)，結(jié)合微流控芯片技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)正常/腫瘤細(xì)胞中Na+和K+的同時(shí)定量分析。探針主體結(jié)構(gòu)為氮雜BODIPY結(jié)構(gòu)，其空腔結(jié)構(gòu)識(shí)別Na+、K+離子。結(jié)合微流控芯片技術(shù)，該探針能準(zhǔn)確定量檢測(cè)單個(gè)HepG2細(xì)胞內(nèi)Na+和K+的濃度。方法被用于檢測(cè)正常/腫瘤細(xì)胞內(nèi)Na+和K+的濃度比率，結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞具有更高的Na+/K+比值。最后，該探針被成功應(yīng)用于檢測(cè)白藜蘆醇誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中Na+和K+的濃度變化。

圖17 探針42和43的結(jié)構(gòu)式Fig.17 Structures of probes 42 and 43

鐵是人體中含量最豐富的過(guò)渡金屬，主要分布在血紅細(xì)胞中。鐵能與生物分子產(chǎn)生各種鍵合作用，作為活性中心形成酶、激素等，從而發(fā)揮電子轉(zhuǎn)移、載氧等重要的生理功能[65 - 66]。Chang研究組[67]設(shè)計(jì)了一種高靈敏度、高選擇性的Fe2+催化氧化反應(yīng)型熒光探針44(圖18)，用于檢測(cè)活細(xì)胞中的Fe2+。探針44加入Fe2+后在有氧環(huán)境中發(fā)生氧化脫烷基化作用，C-O鍵斷裂，熒光素共軛體系恢復(fù)。該探針對(duì)Fe2+具有特異性，并成功應(yīng)用于檢測(cè)鐵調(diào)素、抗壞血酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中Fe2+濃度變化。基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)機(jī)理，Chang研究組[68]還發(fā)展了一種高靈敏度、高選擇性的Fe2+熒光比率成像探針45(圖18)。探針以1,2,4-三氧雜環(huán)戊烷為識(shí)別基團(tuán)，以5-氨甲基熒光素(5-AMF)為熒光供體和花菁(Cy3)為熒光受體，通過(guò)三氧雜環(huán)與Fe2+發(fā)生芬頓反應(yīng)前后呈現(xiàn)FRET比率信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)Fe2+的熒光比率成像。利用該探針，作者研究了正常人類(lèi)乳腺上皮細(xì)胞(HEK 293T)和人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞(MCF-10A)、人類(lèi)骨癌細(xì)胞(MDA-MB-231)的比率熒光成像，驗(yàn)證了腫瘤細(xì)胞中Fe2+的濃度變化幅度超過(guò)正常細(xì)胞。

圖18 探針44和45的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.18 Structures and response mechanisms of probes 44 and 45

2.4 pH值熒光探針

細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的pH對(duì)有機(jī)體正常生理功能的維持至關(guān)重要[69 - 70]， pH失衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和分化異常、細(xì)胞功能紊亂，進(jìn)而影響到神經(jīng)系統(tǒng)以及誘發(fā)多種疾病。唐本忠研究組[71]通過(guò)將四苯乙烯與部花菁偶聯(lián)，設(shè)計(jì)合成了一種聚集誘導(dǎo)(AIE)型的pH熒光比率探針46(圖19)，并將其成功應(yīng)用于HeLa細(xì)胞溶酶體內(nèi)pH的熒光比率成像。

圖19 探針46的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.19 Structures and response mechanisms of probe 46

基于可定位于溶酶體的嗎啉基團(tuán)，馬會(huì)民研究組[72]設(shè)計(jì)合成了近紅外熒光比率pH探針47(圖20)。并利用該探針，實(shí)現(xiàn)了熱休克情況下MCF-7細(xì)胞溶酶體內(nèi)pH的變化的熒光成像，并證明熱休克會(huì)引起溶酶體pH值的增加，且這一過(guò)程在活細(xì)胞中是不可逆的。Kim研究組[73]基于苯并咪唑設(shè)計(jì)合成了能夠檢測(cè)酸性pH值變化的雙光子熒光比率探針48(圖20)，并對(duì)HeLa細(xì)胞溶酶體內(nèi)和小鼠大腦組織中pH值進(jìn)行了雙光子成像。

圖20 探針47和48的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.20 Structures and response mechanisms of probes 47 and 48

Cho研究組[74]利用嘧啶上N原子質(zhì)子化設(shè)計(jì)合成了雙光子比率pH熒光探針49(圖21)，并對(duì)人的胃和食管組織的pH變化進(jìn)行比率成像，成功地區(qū)分了正常的食管和發(fā)炎的食管。Kim研究組[75]將對(duì)酸性pH值敏感的羅丹明和對(duì)堿性pH值敏感的熒光素相連合成了對(duì)寬范圍pH(3～10)檢測(cè)的熒光探針50(圖21)。作者利用該探針發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的氧化還原平衡可以調(diào)控溶酶體內(nèi)的pH。

圖21 探針49和50的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.21 Structures and response mechanisms of probes 49 and 50

3 展望

綜上，隨著化學(xué)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)迅速發(fā)展，對(duì)應(yīng)用于復(fù)雜的細(xì)胞及活體中熒光成像的小分子探針的性質(zhì)和功能提出更高的要求。雖然與生理病理相關(guān)的重要活性小分子的熒光探針相繼被開(kāi)發(fā)，但細(xì)胞與活體內(nèi)大部分活性小分子含量低、活性高、分布狀況各異、合成與代謝迅速、生物效應(yīng)多樣，這些特性對(duì)熒光探針的發(fā)展提出了更高的要求和新的挑戰(zhàn)。為了更能真實(shí)地反映生命的過(guò)程，結(jié)合熒光成像技術(shù)的發(fā)展，今后用于細(xì)胞與活體內(nèi)活性小分子成像的熒光探針研究將會(huì)在今后聚焦于以下幾個(gè)方面：

(1)需發(fā)展量子產(chǎn)率高，波長(zhǎng)位于近紅外(650～900 nm)或近紅外二區(qū)(NIR-Ⅱ，1 000～1 700 nm)的熒光探針；或設(shè)計(jì)具有更大的吸收截面值的雙光子熒光探針，從而降低光在穿透生物組織中的散射及生物體自發(fā)熒光的影響，提高成像深度和空間分辨率，實(shí)現(xiàn)探針在活體成像中的成功應(yīng)用。

(2)在保證識(shí)別特異性的前提下，發(fā)展新的識(shí)別機(jī)理，通過(guò)探針與活性小分子反應(yīng)后，共軛程度擴(kuò)展，熒光發(fā)射波長(zhǎng)紅移，降低檢測(cè)背景，提高信噪比，實(shí)現(xiàn)對(duì)極低含量水平活性小分子的超靈敏檢測(cè)。

(3)在探針?lè)肿又幸肱c特定蛋白結(jié)合的錨定基團(tuán)，提高探針在細(xì)胞與組織內(nèi)駐留時(shí)間問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜生理和病理過(guò)程的長(zhǎng)時(shí)間熒光成像。

(4)發(fā)展與活性小分子瞬時(shí)響應(yīng)、動(dòng)態(tài)可逆結(jié)合的熒光探針，精確示蹤細(xì)胞與活體內(nèi)分子事件過(guò)程。

相信，隨著越來(lái)越多性能優(yōu)異的熒光探針的涌現(xiàn)，會(huì)使人們對(duì)生物活性小分子的認(rèn)識(shí)與了解會(huì)更加全面深刻，會(huì)對(duì)小分子參與的重要生命過(guò)程及其對(duì)重大疾病發(fā)生發(fā)展的影響研究帶來(lái)新的機(jī)遇和新的希望。