方思敏， 李夢圓， 趙美萍

(北京分子科學(xué)國家實(shí)驗(yàn)室，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871)

5′核酸外切酶是一類重要的核酸損傷修復(fù)酶，具有5′～3′方向的外切活性，參與DNA的復(fù)制、重組和修復(fù)過程，對于維持基因組的穩(wěn)定性具有非常重要的作用[1 - 5]。人類核酸外切酶1(hEXO1)是人體中主要的5′外切酶，它參與堿基錯(cuò)配修復(fù)(MMR)、雙鍵斷裂修復(fù)(DSBR)等多種DNA損傷修復(fù)途徑[6]，同時(shí)對于轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的端粒結(jié)構(gòu)重組中端粒的維持具有重要意義[7]。hEXO1的活性缺陷可導(dǎo)致堿基錯(cuò)配修復(fù)不及時(shí)，會(huì)對人體健康造成嚴(yán)重的危害，如導(dǎo)致自發(fā)性變異[8 - 10]、遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌[11 - 12]以及15%～25%散發(fā)性腫瘤的發(fā)展[13]；而雙鍵斷裂修復(fù)不及時(shí)則會(huì)導(dǎo)致染色體重排或消失、癌癥或過早老化[14]。5′外切酶活性的異常與疾病密切相關(guān)，因此，開發(fā)其特異性熒光探針，用于生物樣品中該酶活性的一步快速檢測具有重要的生物學(xué)研究和臨床診斷的意義。

目前關(guān)于5′核酸外切酶參與DNA損傷修復(fù)的機(jī)理方面已開展了大量研究[1 - 7]，但關(guān)于生物樣品中5′外切酶活性及含量定量檢測方法的報(bào)道非常缺乏。DNA熒光探針法由于具有靈敏度高、成本低、設(shè)計(jì)靈活、操作簡單和響應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于核酸酶的分析檢測和成像[15 - 16]。本工作以與hEXO1具有序列同源性、酶切性質(zhì)相近且易獲得的T5外切酶作為模型酶[17]，根據(jù)其與DNA底物反應(yīng)的特性設(shè)計(jì)了對5′外切酶具有高選擇性、高靈敏度的DNA熒光探針。該探針具有3′突出末端，5′末端磷酸化修飾以及連續(xù)三對錯(cuò)配堿基的雙鏈內(nèi)環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)，能有效抑制其它核酸外切酶和內(nèi)切酶的非特異性水解作用，避免其干擾檢測。此外，研究中發(fā)現(xiàn)輔助蛋白和非離子表面活性劑的存在能夠明顯提高探針對目標(biāo)酶的響應(yīng)。該探針成功用于人血清樣品中5′外切酶的一步快速測定，這是首例報(bào)道的可用于人血清中5′外切酶一步快速定量檢測的熒光探針方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Nano Drop 2000c 分光光度計(jì)(美國，Thermo)；Rotor-Gene Q 實(shí)時(shí)熒光PCR儀(德國，QIAGEN)；E -Centrifuge離心機(jī)(德國，Wealtec)；MLS-3020高壓滅菌器(日本，Sanyo)；渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器(中國)制造有限公司)。

T5外切酶(T5 Exo)、脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)、外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)、外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)及其對應(yīng)緩沖溶液(表1)，均購自美國NEB；TE緩沖溶液(10 mmol/L Tri-HCl,1 mmol/L EDTA,pH=8.0)；人血清白蛋白(HSA,≥96%)、牛血清白蛋白(BSA,≥98%)，均購自美國Sigma-Aldrich；鏈霉親和素(>17 U/mg,1 U 結(jié)合1 μg D -生物素，pH=8.9)購自中國生工；Triton X-100購自中國西隴化工。

表1 各種核酸酶對應(yīng)的最適緩沖溶液組成及pH值

本文中使用的寡核苷酸探針由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)過高效液相色譜(HPLC)純化。各探針序列如表2所示。

表2 寡核苷酸探針序列

abold represents mismatched bases;the stem part of the hairpin probe is underlined;FAM is 6-carboxy-fluorescein and Texas red is 7-amino-4-methylcoumarin;BHQ1 and BHQ2 are Black Hole Quenchers 1 and 2;*represents phosphorothioated nucleotides.

1.2 探針結(jié)構(gòu)優(yōu)化

酶切反應(yīng)均在200 μL封閉PCR管中進(jìn)行，反應(yīng)體系的總體積為50 μL，探針終濃度為100 nmol/L 或200 nmol/L。熒光強(qiáng)度的檢測由Rotor-Gene Q完成，程序設(shè)置為在37 ℃每5圈測定一次熒光強(qiáng)度，共循環(huán)250圈，增益值設(shè)為10。熒光基團(tuán)FAM的激發(fā)和發(fā)射波長分別為470 nm和510 nm，熒光基團(tuán)Texas Red的激發(fā)和發(fā)射波長分別為595 nm和620 nm。根據(jù)熒光曲線初始上升階段直線部分的斜率計(jì)算熒光上升的速率。

1.3 探針的線性范圍和選擇性

將T5酶的標(biāo)準(zhǔn)品(0.25～12.5 U/mL)與100 mg/mL BSA以及0.5%Triton X-100預(yù)混。然后取1.0 μL酶標(biāo)樣加入含有200 nmol/L探針P-6的緩沖溶液(67 mmol/L Glycine -KOH、6.7 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 2-Mercaptoethanol)中，終體積為50 μL，實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。由熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的直線部分線性擬合得出熒光上升的速率再與酶濃度作圖，得到檢測的線性范圍。

將200 nmol/L探針P-6分別與T5、DNase Ⅰ、Exo Ⅲ、Exo Ⅰ 在其對應(yīng)的緩沖溶液(表1)中反應(yīng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光上升信號。T5、DNase Ⅰ、Exo Ⅲ、Exo Ⅰ的終濃度分別為2.0 U/mL、10 U/mL、10 U/mL、10 U/mL。

1.4 新鮮人血清中5′外切酶含量的測定

取4.0 μL人血清樣品，加入含200 nmol/L探針P-6的反應(yīng)緩沖溶液(67 mmol/L Glycine -KOH、6.7 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 2-Mercaptoethanol、2.0 mg/mL BSA和0.01% Triton X-100)中，反應(yīng)體系的終體積和熒光測定方法同上。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中T5酶標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0.01 U/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針結(jié)構(gòu)優(yōu)化

圖1 DNA雙鏈末端結(jié)構(gòu)對T5外切酶切割速率的影響。P-3、P-4和P-5的3′末端突出堿基個(gè)數(shù)分別為5、10、20；探針濃度：100 nmol/L；T5外切酶濃度：10 U/mL。F表示熒光基團(tuán)，Q表示猝滅基團(tuán)Fig.1 Effects of different terminal structures(P-1 and P-2) and overhang bases(P-3,P-4 and P-5) on the cleavage rate of T5 exoThe probe concentration is 100 nmol/L and the concentration of T5 Exo is 10 U/mL.F and Q represent FAM and BHQ1,respectively.

5′核酸外切酶可沿5′至3′方向移除位于線性或環(huán)狀雙鏈DNA的5′末端、切口或缺口處的核苷酸[18]。以T5外切酶作為5′核酸外切酶的模型酶，我們首先研究了不同雙鏈DNA末端結(jié)構(gòu)對酶切速率的影響。如圖1和表2所示，當(dāng)雙鏈DNA中標(biāo)有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的單鏈5′末端為平末端(P-1)或突出末端(P-2)時(shí)，T5核酸外切酶對探針的切割速率非常慢。而當(dāng)標(biāo)記單鏈為5′凹末端時(shí)，酶切反應(yīng)的速率明顯加快(P-3、P-4 和P-5)。推測這一現(xiàn)象是由于互補(bǔ)鏈的3′突出結(jié)構(gòu)更有利于T5外切酶與雙鏈底物穩(wěn)定地結(jié)合，從而使酶對標(biāo)記單鏈的切割能更快速地發(fā)生[19 - 20]。我們進(jìn)一步比較了互補(bǔ)鏈3′末端突出的堿基個(gè)數(shù)對酶切速率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3′末端突出堿基的個(gè)數(shù)改變時(shí)(從5個(gè)增加到15個(gè))，酶對探針的切割速率變化不大?？紤]到實(shí)際生物樣品中除了目標(biāo)酶外，還可能同時(shí)存在其他3′外切酶。根據(jù)已有的研究報(bào)道，當(dāng)雙鏈DNA的3′末端突出4個(gè)以上堿基時(shí)，可以不受雙鏈3′外切酶(如Exo Ⅲ)的影響。而3′單鏈外切酶(如Exo Ⅰ)則需要與3′末端至少6個(gè)堿基結(jié)合才能對底物有效切割[21]。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和非目標(biāo)外切酶的特性，5′外切酶適合的DNA探針底物3′末端的突出堿基個(gè)數(shù)為5。

除上述核酸外切酶外，在生物樣品如血液和細(xì)胞環(huán)境中，還可能同時(shí)存在含種核酸內(nèi)切酶，如非限制性核酸內(nèi)切酶(DNase Ⅰ)、各種限制性核酸內(nèi)切酶和脫堿基核酸內(nèi)切酶(Ape1)等。未經(jīng)保護(hù)的核酸熒光探針極易受到核酸內(nèi)切酶，尤其是DNaseⅠ的攻擊，發(fā)生水解和產(chǎn)生假陽性信號[22 - 23]。雖然通過對磷酸骨架的硫酰化可以阻止這些內(nèi)切酶的切割作用，但若在靠近5'末端的區(qū)域?qū)α姿峁羌苓M(jìn)行修飾，也會(huì)同時(shí)抑制目標(biāo)酶對探針的水解作用。在我們之前報(bào)道的Ape1 檢測方法中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在天然的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部引入兩個(gè)連續(xù)的錯(cuò)配堿基對時(shí)，可有效減慢DNaseⅠ的水解作用，而繼續(xù)增加一對含空位的錯(cuò)配堿基對可使探針被DNaseⅠ水解的速率進(jìn)一步減小到只有上述連續(xù)兩錯(cuò)配結(jié)構(gòu)的10%左右[16]，這一結(jié)果表明第三對錯(cuò)配堿基對的引入對提高探針的選擇性具有至關(guān)重要的作用。為使5′外切酶探針不受各種核酸內(nèi)切酶的非特異性水解的影響，應(yīng)在探針的雙鏈區(qū)域設(shè)計(jì)至少連續(xù)3個(gè)錯(cuò)配堿基對形成的內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。

圖2 5′核酸外切酶的特異性熒光探針P-6的結(jié)構(gòu)和檢測原理示意圖Fig.2 Schematic representation of P-6 for measurement of the activity of 5′ exonuclease

綜上，如圖2所示，我們將5′外切酶的探針結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為具有3′突出末端的發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，并對5′末端進(jìn)行磷酸化修飾，以利于5′外切酶識別并結(jié)合底物[24]。3′突出末端的突出堿基個(gè)數(shù)為5，探針莖部靠近5′末端第7～9個(gè)堿基的位置設(shè)計(jì)了連續(xù)三錯(cuò)配堿基形成的內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)，而在內(nèi)環(huán)的另一側(cè)，對莖部骨架均進(jìn)行了硫代保護(hù)。為了使酶切底物后迅速產(chǎn)生熒光信號，我們將熒光基團(tuán)標(biāo)記在5′末端第1個(gè)核苷酸的堿基上，而猝滅基團(tuán)BHQ2標(biāo)記在距5′末端的第10位堿基上，既能有效猝滅熒光又能避免產(chǎn)生空間位阻影響5′外切酶的酶切反應(yīng)。當(dāng)體系中無目標(biāo)酶存在時(shí)，由于熒光基團(tuán)與猝滅基因之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用，熒光被猝滅；當(dāng)體系中加入目標(biāo)酶時(shí)，位于5′末端的第一個(gè)核苷酸迅速被切除，堿基上標(biāo)記的熒光基團(tuán)被釋放到自由溶液中，熒光信號快速上升。

2.2 反應(yīng)緩沖溶液組成的優(yōu)化

在我們之前的研究工作中發(fā)現(xiàn)，在酶與DNA熒光探針的反應(yīng)液中加入HSA對加快反應(yīng)速率和提高檢測的回收率有顯著的作用[16]。利用上述設(shè)計(jì)合成的探針(P-6)我們研究了在反應(yīng)液中加入HSA對T5酶切反應(yīng)的影響。隨著反應(yīng)溶液中HSA濃度的增加，酶切反應(yīng)速率逐漸增大，但熒光上升速率與酶濃度之間的線性關(guān)系并不理想。我們進(jìn)一步嘗試了在反應(yīng)液中加入BSA或非離子表面活性劑Triton X-100，考察對反應(yīng)速率的影響，同樣也觀察到了加速現(xiàn)象，且當(dāng)將高濃度蛋白或表面活性劑先與T5外切酶預(yù)混，再加入含有探針的反應(yīng)液中時(shí)，熒光上升速率更快。在兩種反應(yīng)條件下，方法的最佳線性范圍均為0.1～1.0 U/mL，靈敏度為0.1 U/mL。在此基礎(chǔ)上，我們先將BSA和Triton X-100混合，然后再與目標(biāo)酶預(yù)混，之后再加入到含有探針的反應(yīng)液中，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，探針對目標(biāo)酶的響應(yīng)靈敏度進(jìn)一步顯著提高，表明BSA和Triton X-100對酶切反應(yīng)的加快機(jī)理可能不同，并且二者之間可能還存在協(xié)同作用，其確切的作用機(jī)理目前還需進(jìn)一步研究。經(jīng)過詳細(xì)優(yōu)化，當(dāng)BSA和Triton X-100在反應(yīng)液中的終濃度分別為2.0 mg/mL和0.01%時(shí)，方法的靈敏度最高，對目標(biāo)酶的檢測限可達(dá)到0.005 U/mL，線性范圍為0.005～0.1 U/mL，見圖3。

圖3 (A)不同T5外切酶濃度下探針P-6被水解過程的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化；(B) 探針P-6的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性范圍：0.005～0.1 U/mL,R2=0.998(內(nèi)插圖為在T5外切酶低濃度范圍的熒光曲線圖)Fig.3 (A)Time courses of the hydrolytic reaction of P-6(200 nmol/L) by T5 at different concentrations;(B) Linear working range of the assay: 0.005 to 0.1 U/mL,R2=0.998(Inset:shows the fluorescence curves obtained at low concentration levels of T5 Exo,from 0.005 to 0.025 U/mL)

在上述反應(yīng)條件下，測定了探針P-6對其它可能共存酶(DNaseⅠ、Exo Ⅲ、Exo Ⅰ)的響應(yīng)，并與其在各自最佳緩沖溶液(表1)中的反應(yīng)速率進(jìn)行了對比。結(jié)果表明，探針P-6與各干擾酶在上述T5的最佳緩沖溶液中的反應(yīng)速率均不及在各自最佳緩沖溶液中測到的結(jié)果。圖4(A)對比了各種干擾酶在自身的最佳緩沖液中對P-6的切割速率與目標(biāo)酶在上述最優(yōu)反應(yīng)液中與P-6反應(yīng)的熒光上升速率。可見，即使干擾酶的濃度高達(dá)目標(biāo)酶濃度的40倍，P-6探針對其的熒光響應(yīng)速率也遠(yuǎn)小于對目標(biāo)酶，表明所設(shè)計(jì)的P-6探針結(jié)構(gòu)對目標(biāo)酶有良好的選擇性。

2.3 人血清樣品中5′外切酶含量的測定

基于以上研究結(jié)果，我們將探針P-6用于測定人血清樣品中5′外切酶的活性，并利用T5外切酶進(jìn)行了加入回收實(shí)驗(yàn)。共分析兩份人血清樣品，測得原血清中5′外切酶的含量為0.09±0.01 U/mL，加標(biāo)回收率為100%±5% (n=3)。為了進(jìn)一步排除血清樣品中可能存在的其他酶的干擾，確保熒光信號確實(shí)是由5′外切酶切割探針P-6產(chǎn)生的，我們設(shè)計(jì)合成了對照探針P-6-C。該對照探針與P-6序列相同，不同之處是在探針的5′末端標(biāo)記了生物素，并對該末端的兩個(gè)磷酸二酯鍵進(jìn)行了硫代修飾。這樣得到的探針5′末端能完全抑制目標(biāo)酶的作用，而由于其他結(jié)構(gòu)與P-6完全一致，因此可以用來檢驗(yàn)血清樣品中是否含有其他活性物質(zhì)能破壞P-6的結(jié)構(gòu)從而產(chǎn)生假陽性信號。結(jié)果表明，在上述優(yōu)化好的反應(yīng)條件下，只有當(dāng)T5濃度高于0.25 U/mL時(shí)，對照探針P-6-C才有微弱的熒光上升信號，其切割速率僅為相同濃度T5對P-6切割速率的約20%。而其它幾種酶即使?jié)舛雀哌_(dá)10 U/mL，仍不會(huì)產(chǎn)生明顯的熒光信號。將P-6和P-6-C用于對同樣的血清樣品進(jìn)行測定，如圖4(B)所示，P-6的熒光信號快速上升，而對照探針P-6-C基本沒有產(chǎn)生熒光上升信號。這一結(jié)果有力地證實(shí)了探針P-6可用于特異性地定量檢測血清中存在的5′外切酶。

圖4 (A) 探針P-6的選擇性。T5：2.0 U/mL;DNaseⅠ: 10 U/mL;Exo Ⅲ: 10 U/mL;Exo Ⅰ: 10 U/mL;(B) 工作探針P-6和對照探針P-6-C對血清樣品響應(yīng)的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化Fig.4 (A)Selectivity of P-6(200 nmol/L) to T5(2.0 U/mL) over other nucleases(DNaseⅠ: 10 U/mL;Exo Ⅲ 10 U/mL;Exo Ⅰ 10 U/mL);(B) Time courses of the hydrolytic reaction of P-6(200 nmol/L) and P-6-C(200 nmol/L) by serum samples

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)合成了對5′外切酶具有高選擇性、高靈敏度的DNA熒光探針P-6。該探針為3′末端突出5個(gè)堿基，5′末端磷酸化修飾的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分別標(biāo)記在距5′末端的第1位和第10位堿基上，并且在雙鏈部分距5′末端第7-9位堿基處引入了由連續(xù)3對錯(cuò)配堿基形成的內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了上述設(shè)計(jì)可有效避免探針被3′外切酶及各種內(nèi)切酶破壞，對5′外切酶具有高選擇性。研究還發(fā)現(xiàn)，在外加蛋白BSA與非離子表面活性劑Triton X-100的輔助下，探針P-6對5′外切酶具有很高的靈敏度，線性范圍為0.005～0.1 U/mL，檢測限為0.005 U/mL。利用該探針，我們成功實(shí)現(xiàn)了人血清樣品中5′外切酶的一步快速測定，測得血清中5′外切酶的含量為0.09±0.01 U/mL，回收率為100%±5%(n=3)。本文的研究結(jié)果不僅為實(shí)時(shí)監(jiān)測生物樣品中5′核酸外切酶的含量變化提供了簡便有效的方法，也為臨床疾病診斷、酶抑制劑的高通量篩選和更多功能相關(guān)的DNA修復(fù)蛋白的鑒定提供了非常有用的工具。