張 冰，張?jiān)?，左曉靜，王 瀟*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室，新疆烏魯木齊市 830011；2.解放軍第四七四醫(yī)院，新疆烏魯木齊市 830054)

新疆某醫(yī)院糞便樣品中隱孢子蟲種類的鑒定

張 冰1，張?jiān)?，左曉靜2，王 瀟2*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室，新疆烏魯木齊市 830011；2.解放軍第四七四醫(yī)院，新疆烏魯木齊市 830054)

為了解新疆某醫(yī)院糞便樣本中人源性隱孢子蟲種系基因型，將收集來的腹瀉病人糞便樣本采用乙酸乙酯-改良抗酸染色法進(jìn)行卵囊鑒定，同時(shí)提取隱孢子蟲感染陽性樣本的核酸，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增隱孢子蟲的18 S rRNA基因和HSP70基因，依據(jù)所獲得的目的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生分析。結(jié)果表明，新疆地區(qū)人糞便中隱孢子蟲的陽性率為16.5%，高于全國(guó)平均水平。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，其分子生物學(xué)特征主要為微小隱孢子蟲(C.parvum)和人隱孢子蟲(C.hominis)。說明新疆地區(qū)人源性隱孢子蟲種系主要為C.parvum及C.hominis，具備人獸共患傳播的可能性。

人源性隱孢子蟲；18 S rRNA基因；HSP70基因；種系發(fā)育

隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)是重要的人獸共患寄生原蟲之一，可寄生于包括人在內(nèi)的各類脊椎動(dòng)物消化道上皮細(xì)胞內(nèi)，引起以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)的隱孢子蟲病，嚴(yán)重威脅生命。隱孢子蟲多通過“糞-口”途徑傳播，近年來，隱孢子蟲除地方性流行和暴發(fā)外，在旅游者中感染也很常見，故有“旅游者腹瀉”之稱[1-2]。隱孢子蟲因其具有廣泛的宿主范圍，且具有人獸間傳播的流行病學(xué)特征，在5個(gè)常見的感染人隱孢子蟲種類中，絕大多數(shù)地區(qū)微小隱孢子蟲(C.parvum)和人隱孢子蟲(C.hominis)占到人隱孢子蟲病病因的90%以上[3-4]，而且人感染C.parvum和C.hominis在分布上也有顯著的地理區(qū)域差異和短暫時(shí)間段的差異。目前，我國(guó)人源隱孢子蟲遺傳學(xué)分析方面的報(bào)道較少，主要利用分離株分子特征揭示隱孢子蟲病流行病學(xué)的復(fù)雜性[5-6]。新疆地區(qū)地理環(huán)境復(fù)雜，是否存在新的人源性隱孢子蟲基因型尚未可知，本項(xiàng)目試圖從分子流行病學(xué)調(diào)查入手，從分子特征數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)新疆地區(qū)人源性隱孢子蟲的群體遺傳結(jié)構(gòu)、傳播規(guī)律等流行病學(xué)特點(diǎn)，進(jìn)而從分子水平解讀新疆地區(qū)人源性隱孢子蟲種系發(fā)育的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)樣本 本項(xiàng)目共收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院第五住院部感染科收診的腹瀉病人糞便230例，收集樣本用干凈容器留取5 g～10 g即可。收集后及時(shí)送檢。運(yùn)輸中密封保存。檢測(cè)后樣本置-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 糞便DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，美國(guó)OMEGEA公司產(chǎn)品；T100PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)Bio-rad公司產(chǎn)品；引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成；其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)檢查 將糞便在玻片上涂成2 cm×2 cm大小的圓形糞膜，待自然干燥后，用甲醛固定， 用金胺酚染色，再以改良抗酸染色法復(fù)染，然后光學(xué)顯微鏡檢查。連續(xù)2次查見卵囊者為陽性。

1.2.2 樣本DNA的提取 取鏡檢結(jié)果為陽性的糞便樣本，按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行提取，并將提取物置-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR及反應(yīng)體系 18 S rRNA基因、HSP70基因的引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增條件分別參照Xiao等方法進(jìn)行合成。反應(yīng)體系設(shè)計(jì)中18 S rRNA基因反應(yīng)體系為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，目的基因大小為450 bp;HSP70基因反應(yīng)體系為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，目的基因大小為550 bp。

1.2.4 測(cè)序 測(cè)序工作由北京擎科生物技術(shù)有限公司完成，采用雙脫氧終止法進(jìn)行雙向測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在GenBank上用BLAST進(jìn)行同源性序列搜索。

1.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 用Lasergene 7.1軟件包的程序進(jìn)行序列的拼接，并計(jì)算核苷酸和氨基酸序列的同源性。分別用ML方法(phyML)和貝葉斯方法(Mrbayes)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。ML方法構(gòu)建進(jìn)化樹采用100個(gè)多序列組(replicates)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 新疆地區(qū)人源性隱孢子蟲感染情況

共收集感染科收診的腹瀉病人糞便230例，經(jīng)鏡檢陽性標(biāo)本43例 。經(jīng)PCR擴(kuò)增分析，實(shí)驗(yàn)室確診的病例為38例，感染率為 16.5%。在所有確診病例中，6(15.79%)例來自烏魯木齊本地，17例(44.74%來自新疆其他地區(qū))，12(31.57%)例為居住在烏魯木齊當(dāng)?shù)氐耐鈦砣丝凇Ｔ趯?shí)驗(yàn)室確診病例中，患者的年齡最小為28，最大為49歲。其中36位患者為男性。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)用金胺酚-改良抗酸染色法確定陽性標(biāo)本42例。染色后進(jìn)行光鏡的形態(tài)學(xué)鑒定。糞便中卵囊呈現(xiàn)圓形或橢圓形，呈現(xiàn)玫瑰紅色。

2.3 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

基于18 S rRNA基因位點(diǎn)和HPS70基因位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增后，成功擴(kuò)增目的片段(圖1和圖2)，其中18 S rRNA基因片段大小為450 bp左右，HPS70基因片段大小為550 bp左右。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.人源隱孢子蟲樣本1；2.人源隱孢子蟲樣本2；3.人源隱孢子蟲樣本3；4.人源隱孢子蟲樣本4；5.人源隱孢子蟲樣本5

M.DNA Marker DL 2 000;1.Sample ofCryptosporidiumfrom human-1；2.Sample ofCryptosporidiumfrom human-2；3.Sample ofCryptosporidiumfrom human-3；4.Sample ofCryptosporidiumfrom human-4；5.Sample ofCryptosporidiumfrom human-5

圖1 18 S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.1 RT-PCR results of 18 S rRNA gene

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.人源隱孢子蟲樣本6;2.人源隱孢子蟲樣本7;3.人源隱孢子蟲樣本8;4.人源隱孢子蟲樣本9;5.人源隱孢子蟲樣本10

M.DNA Marker DL 5 000;1.Sample ofCryptosporidiumfrom human-6；2.Sample ofCryptosporidiumfrom human-7；3.Sample ofCryptosporidiumfrom human-8；4.Sample ofCryptosporidiumfrom human-9；5.Sample ofCryptosporidiumfrom human-10

圖2 HPS70基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.2 RT-PCR results of HPS70 gene

2.4 序列分析和進(jìn)化樹繪制

DNA Star 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，并利用MegAlign程序中的Clustal V method 程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。在18 S rRNA基因構(gòu)建的進(jìn)化樹上可以看出，Human-1、Human-2、Human-3、Human-4、Human-5及已報(bào)道的Cryptosporidium hominis(KJ910026)處于一個(gè)大的分支上，且中間無小分支出現(xiàn)(圖3)，同源性在93.5%～98.2%間不等，其中Human-2與C.parvum/CPRM1(AF112569)同源性較高，為94.3%，各樣本之間同源性為91%～97%不等。在 HSP70基因構(gòu)建的進(jìn)化樹上可以看出，各樣本均為于同一分支，與已報(bào)道的Cryptosporidiumhominis同源性可達(dá)到100%(圖4)。

3 討論

隱孢子蟲病作為全球重要的食源性/水源性疾病之一,目前公認(rèn)的有效種有27個(gè)[7],多數(shù)具有宿主特異性，如寄生在牛體內(nèi)的隱孢子蟲主要為微小隱孢子蟲(C.parvum)、牛隱孢子蟲(C.bovis)、安氏隱孢子蟲(C.andersoni)和賴氏隱孢子蟲(C.ryanae)[8]。鴕鳥體內(nèi)可自然感染C.baileyi[9-10],鴕鳥源隱孢子蟲的種類鑒定及同時(shí)因長(zhǎng)期宿主相互適應(yīng)形成協(xié)同進(jìn)化關(guān)系[11]，發(fā)現(xiàn)同時(shí)可感染鼠隱孢子蟲(C.muris),并且C.muris可感染人[12]。

1987年，我國(guó)首次在南京發(fā)現(xiàn)了人體隱孢子蟲病病例[13]，隨后在安徽、內(nèi)蒙古和福建等省市都有相繼報(bào)道，我國(guó)人群隱孢子蟲感染率為0.85%～12.3%[14]，尚無大規(guī)模暴發(fā)的報(bào)道。1998年，世界衛(wèi)生組織(WHO)將人的隱孢子蟲病列為艾滋病懷疑指標(biāo)之一[15]。2003年，我國(guó)衛(wèi)生部門將其列為2個(gè)重要新發(fā)寄生蟲病之一。據(jù)徐隆祺等[16]統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)人體隱孢子蟲感染調(diào)查，1998年初，全國(guó)共檢出44 789人，發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染者938人，分布在19個(gè)省(區(qū)、市)。其中，14個(gè)省對(duì)20 977例腹瀉兒童進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染者共449例，各地感染率為0.91%～9.70%，平均感染率為2.140%。本項(xiàng)目對(duì)新疆230例艾滋病患者人糞標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)38例陽性，感染率高于全國(guó)平均水平[17]。

圖3 新疆人源性隱孢子蟲分離株18 S rRNA序列進(jìn)化樹

圖4 新疆人源性隱孢子蟲分離株HSP70序列進(jìn)化樹

目前，在我國(guó)人源隱孢子蟲分子遺傳學(xué)分析方面的研究報(bào)道較少。Peng M M等[18]分析天津的5個(gè)兒童隱孢子蟲分離株，均為C.hominis。Feng Y等[19]報(bào)道上海污水樣品中，C.hominis占PCR陽性樣本數(shù)的93．7%(59/63)。王強(qiáng)等[20]對(duì)河南開封地區(qū)6 093份人糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)6例隱孢子蟲病例，感染率為0.1%，并分離到的6個(gè)人源隱孢子蟲所進(jìn)行的分子解析顯示6個(gè)分離株均為C.hominis，這與本研究的結(jié)果相符合，本研究以18 S rRNA和HSP 70檢測(cè)新疆人源性隱孢子蟲，其分子生物學(xué)分析顯示均為C.hominis。

本研究從分子流行病學(xué)調(diào)查人手，從分子特征數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)新疆地區(qū)人源性隱孢子蟲的群體遺傳結(jié)構(gòu)和傳播規(guī)律等流行病學(xué)特點(diǎn)，進(jìn)而從分子水平了解新疆地區(qū)人源性隱孢子蟲種系發(fā)育的特點(diǎn)，限于條件，本研究有待進(jìn)一步擴(kuò)大流行病學(xué)調(diào)查范圍，獲取更多分離株分析研究。

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Abstract:To investigate the genetic diversity of humanCryptosporidiumin Xinjiang region, an initial screening ofCryptosporidiumfrom human fecal specimens with diarrhea symptom was performed by morphological identification with ethyl acetate-modified acid fast staining method. The 18 S rRNA and HSP70 genes ofCryptosporidiumwere amplified,and phylogenetic analyses were performed using data sets comprising the two genes from each positive sample. The results showed that samples collected from the hospital had much higherCryptosporidium-positive rates than the national average, with prevalence values of 16.5%. Phylogenetic analyses revealed the main species ofCryptosporidiumfound in Xinjiang wereC.parvumandC.hominis. Therefore,theCryptosporidiumcirculating in Xinjiang may be served as the important zoonotic pathogens.

Keywords:Cryptosporidiumfrom human; 18 S rRNA gene; HSP70 gene； phylogenetic relationship

IdentificationofCryptosporidiumSpeciesfromFecalSamplesofOneHospitalinXinjiang

ZHANG Bing1,ZHANG Yuan-zhou2,ZUO Xiao-jing2,WANG Xiao2

(1.HumanParasitologyTeachingandResearchSection,CollegeofBasicMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang,830011,China;2.TheNO.474hospitalofPLA，Urumqi，Xinjiang，830054,China)

S852.723

A

1007-5038(2017)08-0053-04

2017-04-25

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012211B13)

張 冰(1981-)，女，甘肅蘭州人，講師，碩士研究生，主要從事感染與免疫學(xué)研究。 *