陳 程，吳 帆，王藝暉，王桂琴

(寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021)

銀川地區(qū)牛乳中頭孢類藥物與慶大霉素殘留的檢測

陳 程，吳 帆，王藝暉，王桂琴*

(寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021)

抗生素殘留一直是威脅食品安全的重大問題，為了解銀川地區(qū)牛乳中抗生素殘留情況，采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，對銀川地區(qū)部分養(yǎng)殖場和超市共計350份乳樣進行了頭孢類藥物和慶大霉素殘留的檢測。結果顯示，來自養(yǎng)殖場的200份乳樣中，有4份樣品的頭孢類藥物檢測結果不合格，5份樣品的慶大霉素檢測結果不合格，分別占檢測樣品的2%和2.5%。來自超市的150份乳樣中，有3份樣品的頭孢類藥物檢測結果不合格，2份樣品的慶大霉素檢測結果不合格，分別占檢測樣品的2%和1.3%。說明在銀川地區(qū)部分養(yǎng)殖場和超市的牛乳中均存在頭孢類藥物和慶大霉素殘留超標的問題。

頭孢類藥物；慶大霉素；殘留；酶聯(lián)免疫吸附試驗

牛乳及牛乳制品中含有人們需要的豐富的營養(yǎng)物質，牛乳中所含有的氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質對人體的發(fā)育有著重要的促進作用。然而，近年來乳品不安全事件頻發(fā)，抗生素殘留超標問題讓人們恐懼，人們一度談“乳”色變[1]。因此，牛乳及牛乳制品的檢測監(jiān)控技術和體系建立已成為保障廣大消費群體健康的重要課題[2]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技術是20世紀70年代發(fā)展起來的一項非常成熟的檢測技術，在醫(yī)學、生化及食品檢測等各個領域都有著廣泛的應用。

頭孢類藥物和慶大霉素是寧夏地區(qū)獸醫(yī)臨床常用抗生素。頭孢菌素(Cephalosporins) 類抗生素是一類具有β內酰胺環(huán)的廣譜半合成抗生素[3]，慶大霉素是一種氨基糖苷類抗生素。長期食用抗生素殘留的動物源性食品會對人類的健康造成很大威脅。我國農業(yè)部規(guī)定牛乳中頭孢氨芐、頭孢噻呋等藥物最高殘留為100 ng/mL，慶大霉素最高殘留為200 ng/mL[4]。為了解這兩類抗生素在銀川地區(qū)牛乳中殘留的情況，本試驗采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗對牛乳中頭孢類藥物和慶大霉素的殘留進行檢測，以期為銀川地區(qū)的牛乳中抗生素殘留監(jiān)測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳樣 鮮牛乳，采自銀川地區(qū)10個規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場，共200份。超市成品乳，不同廠家、不同批次的市售純牛乳，共150份。

1.1.2 主要儀器和試劑盒 離心機、微量移液器，Eppendorf有限公司產品；振蕩器，中國其林貝爾儀器制造有限公司產品；酶標儀，美國Thermo公司產品；頭孢類藥物快速檢測試劑盒(批號：20151203-1)、慶大霉素快速檢測試劑盒(批號：20151104-12)，深圳市寶安康生物技術有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 試劑盒與牛乳樣品的前處理 ①從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，至室溫(20℃～25℃)平衡30 min以上，注意每種液體試劑使用前均需搖勻，然后將2×濃縮復溶液用去離子水按照1∶1稀釋，將40 mL濃縮洗滌液用去離子水按照1∶19稀釋，或按所需用量配制洗滌液。②將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置，為了便于檢測與測定過程中標準品與樣品的辨別，按照微量測試孔條上的編號，分別在1號～2號和3號～12號微孔條上添加標準品和樣品。③取1 mL乳樣于4℃、3 000 r/min離心15 min后，去除上層脂肪，取上清液移至干凈的離心管中，按1∶39的比例與配好的復溶液稀釋后取50 μL進行ELISA分析。

1.2.2 ELISA試驗 ①加標準品/樣本50 μL/孔，然后加入抗體工作液50 μL/孔。振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境中反應30 min。取出將孔內液體甩干，用洗液250 μL/孔洗板4次～5次，每次間隔15 s～30 s，用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破。②每孔加入酶標記物100 μL,蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應30 min。將孔內液體甩干，用洗滌液250 μL/孔洗板4次～5次，用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破。③每孔加入底物A液50 μL,再加入底物B液50 μL,振蕩搖勻，25℃環(huán)境中避光顯色15 min。④每孔加入終止液50 μL,輕輕振蕩混勻，設定酶標儀與450 nm處，測定OD值。

2 結果

2.1 頭孢類藥物測定結果

2.1.1 粗略判定 用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/mL)。假設樣本1的光密度值為0.3，樣本2的光密度值為1.0，標準液光密度值分別是：0為2.243，1 ng/mL為1.816，3 ng/mL為1.415，9 ng/mL為0.74，27 ng/mL為0.313，81 ng/mL為0.155。則樣本1的濃度范圍是27 ng/mL～81 ng/mL，樣本2的濃度范圍是3 ng/mL～9 ng/mL，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中頭孢類藥物實際濃度。

2.1.2 標準曲線的建立 所獲得的每個濃度標準溶液和樣本光密度值的平均值(B)除以第一個標準(0標準)的光密度值(B)，再乘以100%，即百分光密度值。

以所獲得的每個濃度標準溶液或樣本光密度值的平均值為B，以標準品的光密度值為B0，以標準品百分吸光率(y=B/B0)為縱坐標，以頭孢類藥物標準品濃度(ng/mL)的半對數為橫坐標，繪制頭孢類藥物快速檢測試劑盒標準曲線(圖1)。

圖1 頭孢類藥物快速檢測試劑盒標準曲線

將樣本的百分吸光率帶入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中頭孢類藥物實際濃度，從而可知其頭孢類藥物殘留量。由圖1可得，標準曲線的線性回歸方程為y=-20.224x+112.32，相關系數為0.996 8，可見其各數據之間具有非常好的相關性，表明該頭孢類藥物快速檢測試劑盒針對頭孢類藥物殘留的檢測分析是準確可靠的。

2.1.3 乳樣中頭孢類藥物檢測結果 使用ELISA快速檢測試劑盒對分別來自規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場和超市共計350份乳樣進行頭孢類藥物殘留檢測，并使用藥物類殘留檢測分析軟件對檢測結果進行分析。 經統(tǒng)計，在200份采自規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場的乳樣中有4份不合格樣品，即不合格率為2%；而來自150份超市的乳樣有3份不合格樣品，不合格率為2%(表1)。

表1 乳樣中抗生素殘留合格率的檢測

2.2 慶大霉素測定結果

2.2.1 粗略判定 用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/mL),假設樣本1的光密度值為0.310，樣本2的光密度值為0.820，標準液光密度值分別是：0為1.510，0.1 ng/mL為1.320，0.3 ng/mL為1.030，0.9 ng/mL為0.660，2.7 ng/mL為0.389，8.1 ng/mL為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7 ng/mL～8.1 ng/mL，樣本2的濃度范圍是0.3 ng/mL～0.9 ng/mL，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中慶大霉素實際濃度。

2.2.2 標準曲線的建立 所獲得的每個濃度標準溶液和樣本光密度值的平均值(C)除以第一個標準(0標準)的光密度值(C),再乘以100%，即百分光密度值。

以所獲得的每個濃度標準溶液或樣本光密度值的平均值為C，以標準品的光密度值為C0，以標準品百分吸光率(y=C/C0)為縱坐標，以慶大霉素標準品濃度(ng/mL)的半對數為橫坐標，繪制慶大霉素快速檢測試劑盒標準曲線(圖2)。

圖2 慶大霉素快速檢測試劑盒標準曲線

將樣本的百分吸光率帶入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中慶大霉素實際濃度，從而可知慶大霉素殘留量。由圖2可得，標準曲線的線性回歸方程為y=-18.215x+101.01，相關系數為0.992 5,可見其各數據之間具有非常好的相關性，表明該慶大霉素快速檢測試劑盒針對慶大霉素的殘留進行檢測分析是準確可靠的。

2.2.3 乳樣中慶大霉素檢測結果 使用ELISA快速檢測試劑盒對分別來自規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場和超市的350份乳樣進行慶大霉素的殘留進行檢測，并使用藥物類殘留檢測分析軟件對檢測結果進行分析。經統(tǒng)計，采自規(guī)?；B(yǎng)殖場的200份乳樣中有5份不合格樣品，即不合格率為2.5%，而來自超市的150份的乳樣有2份不合格樣品，不合格率為1.3%(表1)。

3 討論

目前用于檢測藥物殘留的方法主要有微生物法[5-7]、色譜法或色譜-質譜聯(lián)用分析法[8-18]、免疫分析法等[19-23]。微生物檢測法操作簡單，但其檢測周期長且結果誤差較大。色譜法或色譜-質譜等聯(lián)用技術雖然靈敏度高，但是樣品前處理及測定操作繁瑣、費用高，不適于大量樣品的快速檢測。而本試驗所用ELISA檢測的350個樣品中每80個樣品為一個檢測批次，每批次檢測用時僅75 min左右。從ELISA快速檢測試劑盒標準曲線及相關系數(R2=0.989)可以看出，各標準品數據間相關性較高。由此可見，ELISA快速檢測試劑盒具有較高的靈敏性、高效性、特異性和簡便性等優(yōu)點，可廣泛用于獸藥殘留的現場監(jiān)控和大規(guī)模樣品篩查。

頭孢菌素由于其具有殺菌力強、毒副作用小、過敏反應少等特點[23]，在畜牧動物養(yǎng)殖中廣泛用于奶牛乳房炎的預防與治療，但由于其使用方法不當或不遵守休藥期規(guī)定等多方面原因，在乳產品中殘留過多，進而轉移到人體中，對人體造成重大危害[24]。本試驗利用ELISA方法對銀川地區(qū)350份牛乳進行頭孢類藥物和慶大霉素殘留檢測，陽性率均為2%。我國各地區(qū)的牛乳中都有一定程度的抗生素殘留,其陽性率有一定差異。導致陽性率差異的原因有多方面，可能與檢測方法的特異性和靈敏度有關，另外可能還與抗生素的使用情況、乳牛的飼養(yǎng)管理等有關。

由于該試劑盒使用前是在2℃～8℃環(huán)境冷藏(不可冷凍)，故使用前應當將試劑盒中所有試劑溫度回升至室溫20℃～25℃，否則會導致所有的OD值偏低。其次，從本試驗各個環(huán)節(jié)和結果來看，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。若在洗板過程中如果出現洗板干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性、重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。另外，混合要均勻否則會出現重復性不好的現象。由于反應終止液為2 mol/L硫酸，試驗過程中需做好防護工作，避免試劑接觸皮膚，造成不必要的損傷。

本試驗使用ELISA快速檢測試劑盒分別對來自銀川地區(qū)部分規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場和超市共計350份乳樣進行頭孢類藥物和慶大霉素的殘留檢測，結果顯示，銀川地區(qū)部分養(yǎng)殖場的牛乳中頭孢類藥物殘留檢測合格率為98%，慶大霉素檢測合格率為97.5%。來自超市的牛乳中頭孢類藥物殘留檢測合格率為98%，慶大霉素檢測合格率為98.7%。說明在銀川地區(qū)的牛乳中存在頭孢類藥物和慶大霉素殘留及殘留超標現象，需繼續(xù)加大監(jiān)控力度，確保乳品安全。

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Abstract:Antibiotic residues have been a major threat to food security.In order to understand the residues of cephalosporins and gentamicin in cow milk in Yinchuan,cephalosporins and gentamicin residues were tested on 350 milk samples collected from farms and supermarkets by indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The results showed that 4 samples of cephalosporin test results and 5 samples of gentamicin test results were unqualified in 200 milk samples from the farms,which accounting for 2% and 2.5% of the samples respectively.From the market in 150 milk samples,3 samples of cephalosporin test results were unqualified and 2 samples of gentamicin test results were unqualified, which accounting for 2% and 1.3% of the samples respectively.It revealed that the cephalosporin and gentamicin excessive residues in milk existed in the farms and supermarkets of Yinchuan.

Keywords:cephalosporins;gentamicin;residue;enzyme-linked immunosorbent assay

文獻綜述

DetectionandAnalysisofCephalosporinsandGentamicinResiduesinCowMilkinYinchuan

CHEN Cheng,WU Fan,WANG Yi-hui,WANG Gui-qin

(CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750021,China)

S859.84

A

1007-5038(2017)08-0076-04

2016-07-19

國家自然科學基金項目(31360626)

陳 程(1992-)，男，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)藥理學研究。*