張慧慧,仇薪鑫,王興龍,楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

陜西林麝肺源致病性大腸埃希菌分離鑒定及藥敏試驗

張慧慧,仇薪鑫,王興龍*,楊增岐*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為分析致林麝肺炎的病原菌，從發(fā)病死亡的林麝肺臟進行細菌分離，對分離所得細菌進行微生物學(xué)和生化特性鑒定及動物試驗。細菌分離結(jié)果顯示，病死林麝肺臟主要為2種不同菌落形態(tài)的細菌，經(jīng)挑純后，測定其16 S rRNA 序列，發(fā)現(xiàn)2株細菌均為大腸埃希菌，菌株1與EscherichiacoliO104:H4序列同源性均為100%，菌株2與EscherichiacoliO78序列同源性為100%。用2株菌進行動物試驗，發(fā)現(xiàn)2株大腸埃希菌對小鼠的致死率均為75%；藥敏試驗結(jié)果表明，頭孢類(頭孢唑啉、頭孢曲松)和單環(huán)β內(nèi)酰胺類(氨曲南)對2株林麝肺部致病性大腸埃希菌均敏感；氨基糖苷類(鏈霉素)對其均中度敏感；對其他類別抗生素均呈現(xiàn)不同程度的耐藥性。

肺炎；大腸埃希菌；16 S rRNA；藥敏試驗；林麝

林麝為國家一級保護動物，其麝香為傳統(tǒng)的名貴中藥材和高級動物香料，具有重要的社會價值和經(jīng)濟價值[1]。人工養(yǎng)殖情況下，疾病是導(dǎo)致林麝死亡的重要原因，圈養(yǎng)林麝常見疾病包括消化道疾病、呼吸道疾病及寄生蟲造成的林麝疾病。其中，消化道疾病及寄生蟲疾病為馴養(yǎng)林麝的高發(fā)疾病，但是致死率不高。而呼吸系統(tǒng)，尤其是肺部疾病則是人工養(yǎng)殖林麝的高致死疾病[2-3]。其中報道較多的是致病性大腸埃希菌(Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli，ExPEC)引起的肺炎。

腸外致病性大腸埃希菌能引起人類和動物腸外組織感染，可致使不同宿主發(fā)生呼吸道感染、泌尿道感染、腦膜炎和敗血癥等，而且有研究表明其耐藥性明顯高于其他菌群[4-6]。目前已在人、牛、雞、狗、貓等體內(nèi)分離到ExPEC，由于林麝研究受到條件限制，國內(nèi)關(guān)于ExPEC引起林麝疾病的報道很少，本研究在患病死亡林麝肺內(nèi)成功分離到,2株ExPEC，并對其進行了藥敏試驗，為林麝臨床防控和用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集自陜西省寶雞市鳳縣林麝養(yǎng)殖基地，病料樣品為發(fā)病林麝的肺臟。

1.1.2 實驗動物 昆明小鼠12只，體重20 g～22 g,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。

1.1.3 細菌培養(yǎng)基和分子檢測試劑 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂、糖發(fā)酵管(包括乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖)、蛋白胨水培養(yǎng)基(吲哚試驗)、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(甲基紅MR和VP試驗)和枸櫞酸鹽利用培養(yǎng)基，購自楊凌寶鑫生物技術(shù)有限公司；DNA Marker DL 2 000、2×TaqMasterMix，南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 藥敏紙片 藥敏紙片：青霉素類(氨芐西林)、頭孢類(頭孢唑啉、頭孢曲松)、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(氨曲南)、喹諾酮類(氧氟沙星)、氨基糖苷類(鏈霉素、阿米卡星)、大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素)、林可酰胺類(克林霉素)、葉酸代謝途徑抑制劑(復(fù)方新諾明)、酰胺醇類/氯霉素類(氯霉素)、四環(huán)素類(四環(huán)素)，所用藥敏紙片均購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.1.5 引物設(shè)計與合成 16 S rRNA擴增通用引物:27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。

1.2 方法

1.2.1 采集病料 剖檢死亡林麝，并無菌采集肺臟病料，觀察其病理變化。

1.2.2 病原菌的分離與鑒定

1.2.2.1 細菌的分離培養(yǎng) 將采集的林麝肺臟樣品立即無菌接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基， 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，觀察菌落種類及相對數(shù)量，記錄菌落特征。挑取單個菌落進行革蘭染色并鏡檢，觀察疑似病原菌菌體的形態(tài)，并劃線接種于普通瓊脂、麥康凱瓊脂和鮮血瓊脂， 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，觀察并記錄菌落特征，同時挑取單菌落進行革蘭染色鏡檢，觀察其菌體形態(tài)。

將分離培養(yǎng)得到的典型菌落，挑取單菌落劃線接種于三糖鐵瓊脂斜面，進行純化培養(yǎng)，取單菌落接于于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min搖床進行過夜培養(yǎng)增菌，保菌備用。

1.2.2.2 生化試驗 將菌液接種于普通培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落分別進行糖發(fā)酵試驗(葡萄糖、蔗糖、芽糖、乳糖)、MR試驗、VP試驗、靛基質(zhì)試驗、檸檬酸鹽利用試驗，每個試驗分別重復(fù)3次。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》判定試驗結(jié)果[7]。

1.2.2.3 16 S rRNA PCR鑒定 取1 mL菌液，沸水加熱10 min，冷卻15 min，12 000r/min離心2min，取上清液作為PCR反應(yīng)的DNA模板。依據(jù)羅燕等報道的用16 S rRNA PCR的通用引物27F和1492R進行PCR擴增[8]。PCR產(chǎn)物送西安擎科澤西生物科技有限責任公司進行測序。

1.2.3 動物試驗 將試驗小鼠分為3組，對照組(C組)、試驗組(G1)和試驗組(G2)。試驗前禁食、禁水24 h。G1組小鼠腹腔注射菌株1菌液1 mL/只(約含細菌2×109CFU)。G2組小鼠同方法同劑量注射菌株2菌液。C組小鼠同方法注射生理鹽水1 mL/只。

攻菌后,各組分籠飼養(yǎng)，每天觀察記錄各組小鼠的食欲、精神狀況等臨床表現(xiàn)，連續(xù)觀察1周，并記錄各組小鼠的發(fā)病和死亡情況。對死亡小鼠剖檢，觀察記錄病理變化，采集肺臟涂片，革蘭染色鏡檢。

1.2.4 藥敏試驗 將分離鑒定出的致病菌株進行藥敏試驗。采用KB法，將含藥敏紙片的瓊脂培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h[9]。根據(jù)CLSI的標準判讀試驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 林麝發(fā)病臨床表現(xiàn)及剖檢病理變化

發(fā)病林麝死亡前無明顯臨床發(fā)病癥狀，突然倒地，伸頸，呼吸困難，口鼻流出少量液體；剖檢可見胸腔積液、心包積液，心包壁渾濁；主要病理變化見于肺臟，可見肺臟的充血、出血，及大面積的肺臟淤血(圖1)。

圖1 死亡林麝及肺臟病理變化

2.2 細菌分離

從林麝肺臟中分離得到2株細菌，分別為菌株1和菌株2。菌株1為表面光滑，半透明，直徑3 mm左右的灰白色菌落，鏡檢呈革蘭陰性短桿菌，兩端鈍圓，成對或散在；菌株2為表面光滑，邊緣整齊，半透明，直徑1 mm左右的灰白色菌落，鏡檢呈革蘭陰性桿菌，聚集成堆。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 挑取生長于三糖鐵瓊脂斜面的分離菌的純培養(yǎng)物，經(jīng)革蘭染色鏡檢，菌株1為革蘭陰性短桿菌，兩端鈍圓，散在或成對，0.5 μm×2 μm；菌株2為革蘭陰性短桿菌，兩端鈍圓，聚集成堆，0.5 μm×1 μm。

2.3.2 生化試驗結(jié)果 經(jīng)糖發(fā)酵試驗(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖)、MR試驗、VP試驗、靛基質(zhì)試驗、檸檬酸鹽利用試驗共5項生化試驗鑒定，根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》判斷標準，可以確定該株菌為大腸埃希菌。結(jié)果見表1。

2.3.3 分離菌株的16 S rRNA PCR分子鑒定 分離菌株進行16 S rRNA PCR檢測，所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，每株菌可見1條1.6 kb左右的特異性條帶(圖2)。

表1 分離菌株的生理生化鑒定結(jié)果

注：糖發(fā)酵試驗：“+”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣；“- ”表示不發(fā)酵。其他試驗：“+”表示陽性；“- ”表示陰性。

Note：In pentasaccharides fermentation test,“+ ”stands for production of gas and acid; “- ”stands for no fermentation.In other tests,“+ ”stands for positive;and “- ”stands for negative.

M.DNA標準DL 2 000;1、2.菌株1；3.陰性對照；4、5.菌株2

M.DNA Marker DL 2 000;1,2.Strain 1；3.Negative control；4,5.Strain 2

圖2分離菌株的16 S rRNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig.2 Electrophoresis products of 16 S rRNA PCR results of isolated strains

將所測得的基因序列與GenBank中已有的序列進行比對，選取同源性高的菌株并結(jié)合菌株的生理生化特性對所測菌株進行鑒定。菌株1與EscherichiacoliO104:H4序列同源性達100%，菌株2與EscherichiacoliO78序列同源性達100%，兩者均為致病性大腸埃希菌。

2.4 分離菌株的小鼠致病性試驗結(jié)果

小鼠在接種后先后表現(xiàn)出不同程度的精神沉郁，被毛散亂，食欲降低。C組小鼠精神狀態(tài)表現(xiàn)良好,食欲飲欲等正常。1 d后，G1組1只小鼠死亡；2 d后，G2組2只小鼠死亡，G1組1只小鼠死亡；3 d后，G1組和G 2組各有1只小鼠發(fā)生死亡。死亡統(tǒng)計結(jié)果見表2。

死亡小鼠剖檢后，肺臟均有少量出血淤血癥狀，其他無明顯病理變化。G1組和G2組的死亡小鼠肺臟中分離細菌進行回歸檢測,陽性率為100%。小白鼠致病試驗表明2株由林麝肺臟分離的大腸埃希菌能引起小鼠發(fā)病死亡，并從小鼠肺臟中能分離到大腸埃希菌(結(jié)果未顯示)。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

以抑菌圈直徑大小作為判斷敏感性高低的標準。細菌對該藥的敏感性越高則產(chǎn)生的抑菌圈直徑越大。根據(jù)不同的抑菌圈直徑分為高度敏感,中度敏感和耐藥。各菌株的藥敏試驗結(jié)果見表3。

表2 小鼠腹腔注射結(jié)果

表3 藥敏試驗結(jié)果

注：抑菌環(huán)直徑，單位：mm;S.敏感；I.中介；R.耐藥。

Note:Antibacterial ring diameter,mm ; “S” represents sensitive; “I” represents intermediary; “R” represents resistance.

從表3可見，在12種抗生素中,頭孢類抗生素對2株林麝肺部致病性大腸埃希菌的抑菌作用最強。頭孢類(頭孢唑啉、頭孢曲松)和單環(huán)β內(nèi)酰胺類(氨曲南)對2株菌均敏感；氨基糖苷類(鏈霉素)對其均中度敏感，兩株分離菌對其他幾種藥物均呈現(xiàn)耐藥性。

3 討論

本試驗從林麝肺臟組織中分離得到2株細菌，分別為菌株1、菌株2。經(jīng)分離培養(yǎng)與純培養(yǎng)、染色鏡檢后，初步懷疑菌株1和菌株2均為大腸埃希菌，且菌株1菌落比菌株2略大。通過生化試驗鑒定，結(jié)果均基本符合《伯杰氏細菌鑒定手冊》所描述的大腸埃希菌典型生化特征。

小鼠致病性試驗中，感染小鼠病程短，死亡快，試驗組小鼠死亡率均為75%，且出現(xiàn)了較明顯的臨床發(fā)病癥狀，雖然實質(zhì)器官病理變化不明顯，但都能從死亡小鼠的肺臟中分離到攻菌菌株，因此可以認定為是致病性大腸埃希菌。

擴增分離菌株的16 S rRNA序列，將所得序列與GenBank中已知序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株1與EscherichiacoliO104:H4序列同源性達100%，菌株2與EscherichiacoliO78序列同源性達100%，兩者均為致病性大腸埃希菌。其中，EscherichiacoliO104:H4為腸出血性大腸埃希菌，腸出血性大腸埃希菌感染是一種人畜共患病，并且傳染性較強[10-11]。EscherichiacoliO78是禽致病性大腸埃希菌，可導(dǎo)致各年齡段家禽感染，也有從牛、羊、鹿等組織中分離出禽致病性大腸埃希菌的報道[12-13]。由此可以推測，林麝對常見家養(yǎng)畜禽致病病原也有較高的敏感性，因此建議林麝飼養(yǎng)應(yīng)與家養(yǎng)畜禽保持一定距離。而藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌對常用預(yù)防和治療用抗菌藥物均有耐藥性，更進一步提示分離菌可能來源于家養(yǎng)畜禽。

[1] 汪 松.中國瀕危動物紅皮書[M].北京：科學(xué)出版社，1998:237-240.

[2] 許 珂,卜書海,梁宗鎖.林麝研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2014(4):147-150.

[3] 姜海瑞,陸祎瑋.陜西鳳縣林麝野生資源調(diào)查記[J].大自然,2015(4):68-69.

[4] Sanchez-Sosa S, Aguirre-Lombardo M, Jimenez-Brito G,et al.Characterization of extraintestinal pathogenicEscherichiacoliisolated from retail poultry meats from Alberta,Canada.[J].Int J Food Microbiol,2014,177:49-56.

[5] 張 桃,蘇戰(zhàn)強,夏利寧,等.牛源大腸桿菌O157:H7分離與鑒定及其毒力基因檢測[J].中國人獸共患病學(xué)報,2015,31(12):1136-1141.

[6] 徐引弟,王治方,朱文豪,等.腸外致病性大腸桿菌的研究進展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2011(7):21-23.

[7] Buchanan R R,Gibbons N E.Bergey’s Manual of determinative bacteriology,eight [M].Baltimore：Williams and Wikins,1974:385-389.

[8] 羅 燕,王 朋,趙洪明,等.林麝肺源致病性大腸桿菌分離鑒定及毒力基因PCR檢測[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2012,34(8):615-618.

[9] 林亞軍,季建莉,趙紅瓊,等.新疆地區(qū)牛和新引進牛大腸埃希菌耐藥性比較[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2016,37(11):126-128,129.

[10] Radosavljevic V,Finke E J,Belojevic G.Analysis ofEscherichiacoliO104:H4 outbreak in germany in 2011 using differentiation method for unusual epidemiological events.[J].Central European Journal of Public Health,2016,24(1):9-15.

[11] Vladan R,Ernst-Juergen F,Goran B,et al.EscherichiacoliO104:H4 outbreak in Germany-clarification of the origin of the epidemic[J].Eur J Public Health,2015,25(1):125-129.

[12] Zhao Kelei,Tian Yongqiang,Yue Bisong,et al.Virulence determinants and biofilm production amongTrueperellapyogenesrecovered from abscesses of captive forest musk deer.[J].Arch Microbiol,2013,195(3):203-209.

[13] Zhang L Y, Lv S, Wu S C, et al.Inhibitory effects of α-cyperone on adherence and invasion of avian pathogenicEscherichiacoliO78 to chicken type Ⅱ pneumocytes[J].Vet Immunol Immunopathol,2014,159(1/2):50-57.

Abstract:To isolate and identify the pathogenicEscherichiacolifrom lungs of dead forest musk deer，bacterial culture,biochemical assays and pathogenic test were used.Two different colony morphology of bacteria in forest musk deer were isolated and identified.16 S rRNA PCR test result showed that two strains of bacteria wereEscherichiacoli.Strain 1 was 100% similar withE.coliO104:H4,Strain 2 was 100% similar withE.coliO78.The two isolates could cause death in mice.The death rate of mice was 75%.12 kinds of commonly used antibacterials were used to measure their drug sensitivity,cephalosporins have the strongest effect against bacteria among the 12 kinds of antibacterials.Cephalosporins (cefazolin,ceftriaxone) and monocyclic β- lactam (aztreonam) are sensitive to the two strains of pathogenicE.coli; aminoglycosides (streptomycin) was moderately sensitive to them; they were resistant to other categories of antibacterials.The findings in the research provided important information for the prevention and control of forest musk deer pneumonia.

Keywords:musk deer; pneumonia;Escherichiacoli; 16 S rRNA PCR; drug susceptibility test

Isolation,IdentificationandDrugSusceptibilityTestofPathogenicEscherichiacolifromMuskDeerLungsinShannxi

ZHANG Hui-hui,QIU Xin-xin,WANG Xing-long,YANG Zeng-qi

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling，Shaanxi,712100,China)

S852.612;S865.41

B

1007-5038(2017)08-0118-04

2016-12-08

張慧慧(1989-)，女，山東濱州人， 碩士研究生，主要從事動物傳染病的檢測研究。*