高 瑤，孟星宇，羅玉子，胡永浩，仇華吉*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150069；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070)

等溫擴增技術(shù)的原理及其在病原檢測中的應(yīng)用

高 瑤1,2，孟星宇1，羅玉子1，胡永浩2*，仇華吉1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150069；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070)

等溫擴增技術(shù)(IAT)作為一種新型的體外核酸擴增技術(shù)，與PCR相比，該技術(shù)具有特異性強、敏感性高、簡單便捷和成本低等優(yōu)點。目前，等溫擴增技術(shù)在病原檢測方面得以應(yīng)用，論文對環(huán)介導等溫擴增(LAMP)、依賴解旋酶的等溫擴增(HDA)、依賴核酸序列的等溫擴增(NASBA)、鏈置換等溫擴增(SDA)、交叉引物擴增(CPA)5種擴增技術(shù)的原理、特點及應(yīng)用分別予以介紹，為該技術(shù)在病原檢測的實際應(yīng)用提供參考。

等溫擴增技術(shù)；原理；病原檢測

體外核酸擴增是分子生物學中一類常規(guī)實驗技術(shù)，Mullis K等[1]在20世紀80年代建立的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)應(yīng)用最為廣泛。PCR通過變性、退火和延伸3個階段特異地擴增目的片段。常規(guī)PCR技術(shù)存在以下缺陷：①PCR儀價格昂貴；②影響擴增因素眾多；③耗時較長等。因此，限制了其在基層的推廣使用。等溫擴增技術(shù)(isothermal amplification technology，IAT)是一類更具特色的核酸擴增技術(shù)，通過不同的酶和特異性引物在恒定溫度下進行快速擴增。與PCR方法相比，等溫擴增技術(shù)使用的儀器設(shè)備簡單且擴增時間縮短[2]。

根據(jù)反應(yīng)原理的不同，等溫擴增可分為環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、依賴核酸序列的等溫擴增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、依賴解旋酶的等溫擴增(helicase-dependent amplification，HDA)、鏈置換等溫擴增(strand displacement amplification，SDA)和交叉引物擴增(cross-priming amplification，CPA)等。這些技術(shù)各有優(yōu)缺點，在病原檢測中有不同的應(yīng)用。

1 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)

1.1 原理

環(huán)介導等溫擴增(LAMP)是Notomi T等[3]于2000年建立的在恒溫條件下僅用一種酶進行核酸快速擴增的技術(shù)。①引物設(shè)計：針對靶基因3′端的F3c、F2c和F1c區(qū)及5′端的B1、B2和B3區(qū)6個特異位點設(shè)計4種引物，上游內(nèi)引物FIP由F1c和F2組成，下游內(nèi)引物BIP由B1c和B2組成，上游外引物F3與F3c互補，下游外引物B3與B3c互補。②啞鈴狀模板構(gòu)造的形成：FIP引物中的F2序列與模板DNA上F2c結(jié)合，在鏈置換DNA聚合酶的作用下向前延伸并啟動鏈置換反應(yīng)，外引物F3與模板F3c區(qū)域結(jié)合，共同置換出FIP延伸的單鏈，此單鏈上F1c與F1互補，堿基配對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以此鏈為模板，BIP引物與其結(jié)合并延伸，同時環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開。隨后，B3在聚合酶作用下置換出新的互補鏈，被置換的單鏈兩端均存在互補序列，可發(fā)生自我堿基配對形成啞鈴狀DNA結(jié)構(gòu)。③擴增循環(huán)：以啞鈴狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與其F2c區(qū)結(jié)合開始鏈置換合成，通過再循環(huán)和延伸得到長度不同的DNA產(chǎn)物。整個過程在63℃左右45 min～60 min即可完成。其技術(shù)原理見圖1。

1.2 優(yōu)缺點

優(yōu)點：該方法在等溫條件下進行，不需要循環(huán)儀等昂貴的儀器；擴增反應(yīng)快，一般在1 h內(nèi)完成；擴增產(chǎn)生的特異性產(chǎn)物含量較大，通過肉眼、電泳或比濁儀均可判定結(jié)果；敏感性高、特異性強，極適用于病原檢測。

缺點：對引物設(shè)計要求極高，設(shè)計的4條引物Tm互有差別且需要識別6個不同的區(qū)域[4]。擴增的靶序列長度需控制在300 bp以下，故不能擴增較長的目的片段。由于靈敏度高，在操作中極易出現(xiàn)假陽性，故試驗要嚴格區(qū)分溶液配制區(qū)、樣品處理區(qū)和檢測區(qū)。

a．引物設(shè)計位點；b．啞鈴狀模板構(gòu)造形成的原理圖 a．Primer design site；b．The schematic of forming dumbbell-shaped template structure

1.3 發(fā)展與應(yīng)用

最初LAMP引物設(shè)計采用2對引物識別6個位點，后來Nagamine K等[5]建立了一種通過加入額外的引物(環(huán)引物)加速LAMP反應(yīng)的方法。改進的LAMP方法采用環(huán)引物，反應(yīng)時間比原始LAMP方法縮短一半。雖然內(nèi)引物和環(huán)引物都通過環(huán)反應(yīng)，但它們的反應(yīng)機制不同。Hong T C等[6]研究出一種新型的逆轉(zhuǎn)錄LAMP檢測方法，在LAMP反應(yīng)混合體系中加入病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，實現(xiàn)一步法擴增，可快速檢測非典型肺炎病毒(Severe acute respiratory syndrome virus，SARSV)。結(jié)果顯示，RT-LAMP最低檢測限為0.01 pfu，而RT-PCR只能檢測1 pfu，因此，RT-LAMP的靈敏度較RT-PCR提高了100倍；RT-LAMP的檢測特異性是100%，而RT-PCR是87%。

近年來，LAMP已用于多種細菌和病毒的檢測。其中將逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導等溫擴增(RT-LAMP)與化學發(fā)光(chemiluminescence，CL)結(jié)合建立的H7N9病毒檢測方法，經(jīng)優(yōu)化可檢測到103拷貝/mL的H7N9流感病毒RNA，與RT-PCR-CL相比，處理時間顯著縮短[7]。同時LAMP還可與膠體金試紙條聯(lián)合，在1對內(nèi)引物中間設(shè)計1組探針，擴增產(chǎn)物直接用試紙條檢測，使檢測結(jié)果更直觀、易于判定。

2 依賴解旋酶的等溫擴增技術(shù)

2.1 原理

依賴解旋酶等溫擴增技術(shù)(HDA)是由美國NEB公司研究人員Vincent M等在2004年建立的一種模擬生物體內(nèi)DNA自然復(fù)制的擴增技術(shù)。HDA擴增過程可分為5個階段：解旋酶解開DNA雙鏈；單鏈DNA結(jié)合蛋白(single strand DNA-binding protein，SSB)結(jié)合其上得到完整的單鏈DNA；引物結(jié)合；聚合酶催化合成靶序列和解旋酶解新鏈再循環(huán)。反應(yīng)初，在輔助蛋白的輔助下解旋酶與雙鏈DNA結(jié)合，把雙鏈DNA解成單鏈；體系中的SSB馬上與產(chǎn)生的單鏈DNA結(jié)合，防止單鏈重新形成雙鏈；同時引物與單鏈結(jié)合，在聚合酶的催化下合成靶序列。新合成的序列作為模板進入新一輪擴增，經(jīng)過不斷循環(huán)，目的片段呈指數(shù)增長[8-9]。其原理見圖2。

圖2 HDA的原理(Jeong Y J et al.2009)

2.2 優(yōu)缺點

優(yōu)點：HDA是一種真實模擬體內(nèi)擴增的等溫核酸擴增方法，且引物設(shè)計簡單[10]。HDA依靠解旋酶、SSB和DNA聚合酶催化靶序列擴增，因此可以在恒溫下進行，適于在基層實驗室推廣使用。

缺點：受解旋酶解旋速度的限制，HDA只能擴增短序列。雖然HDA擴增原理簡單，但體系擴增步驟復(fù)雜，優(yōu)化受限，尚未廣泛用于病原檢測和基因擴增。

2.3 發(fā)展與應(yīng)用

為提高HDA反應(yīng)效率，研究人員從細菌中提取到一種耐熱的解旋酶(Tte-UvrD)，可在60℃～65℃擴增目的片段，體系不需添加DNA錯配修復(fù)蛋白MutL和SSB。該方法已應(yīng)用于痰液、胸膜液和尿液樣品中結(jié)核分支桿菌的檢測[11]，通過磁珠捕獲擴增的DNA序列，進行擴增后雜交試驗，以提高靈敏性和特異性。同時，還可以利用熱穩(wěn)定的HDA體系建立一種檢測RNA片段的擴增方法[12]。

另外，通過對T7噬菌體復(fù)制機制的研究，在最初反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上又建立了一種高效快速的HDA檢測方法，稱為環(huán)狀HDA體系(circular HDA system,cHDA)。T7噬菌體復(fù)制系統(tǒng)可以擴增環(huán)形DNA和長達10 kb的目的片段[13]。Schwenkbier L等[14]成功將磁珠法提取植物DNA、HDA和DNA芯片雜交技術(shù)相結(jié)合，建立了一種植物疫霉的現(xiàn)場快速檢測方法，最低檢測限可達10 pg/μL。

3 依賴核酸序列的等溫擴增技術(shù)

3.1 原理

依賴核酸序列等溫擴增(NASBA)是一種由Compton J報道的可對RNA序列進行擴增的新技術(shù)[15]。反應(yīng)體系包括AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、噬菌體T7 RNA聚合酶、RNase H和2種特別設(shè)計的特異性引物等。RNA模板鏈進入反應(yīng)體系后，含有T7啟動子的引物P1先與模板鏈3′端結(jié)合，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成互補鏈，然后RNase H降解與DNA雜交結(jié)合的RNA鏈，隨后引物P2與單鏈DNA的3′端結(jié)合并延伸，最后依賴于DNA的T7 RNA聚合酶通過識別雙鏈DNA上的T7啟動子合成大量RNA補償鏈，反應(yīng)循環(huán)進行。NASBA還可用于DNA的擴增，即在擴增前將DNA加熱變性，再依原理加入相應(yīng)的酶進行反應(yīng)，擴增產(chǎn)物仍然是RNA[16]。其原理見圖3。

圖3 NASBA的原理(Gao S D et al.2009)

3.2 優(yōu)缺點

優(yōu)點：NASBA在42℃即可進行大量擴增。因反應(yīng)產(chǎn)物是單鏈RNA，不易造成交叉污染而出現(xiàn)假陽性，同時還能通過雜交檢測系統(tǒng)進一步提高檢測的敏感性和特異性，是一種適合檢測RNA序列的擴增技術(shù)[17]。

缺點：反應(yīng)成分復(fù)雜，成本高，需要3種酶共同作用完成擴增。

3.3 發(fā)展與應(yīng)用

基于NASBA的一系列優(yōu)點，該技術(shù)已應(yīng)用于病毒、細菌和寄生蟲等研究中。植物細胞壁中含有大量多糖、酚類物質(zhì)，提取植物病毒RNA也存在著穩(wěn)定性差和效率低等問題，而RNA本身容易降解，導致最終提取的RNA病毒含量較低，對檢測方法的靈敏度和穩(wěn)定性要求較高。而NASBA技術(shù)將反轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)一步完成，適合各種RNA樣品的分析。因此,NASBA技術(shù)與分子信標結(jié)合建立了草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus，SVBV)的檢測方法，其靈敏度可達1 ng[18]。

侵襲性曲霉菌(Invasive aspergillosis，IA)可危及免疫受損患者的生命，因此對早期感染患者快速、靈敏的檢測至關(guān)重要。Du L等[19]建立了檢測曲霉菌的NASBA-ELISA方法以滿足需要。在高度保守的18 S rRNA區(qū)域特異位點處設(shè)計引物，并標記地高辛(digoxigenin，DIG)，DIG標記的RNA擴增產(chǎn)物與固定在鏈霉親和素包被的微量滴定板上的特異性生物素化DNA探針雜交，通過加入與ALP和底物(磷酸4-硝基苯酯二鈉)連接的抗DIG抗體來比色檢測雜交體。NABSA-ELISA方法的檢測限為1 CFU，與其他細菌和真菌無交叉反應(yīng)。與RT-PCR和半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)相比，NASBA-ELISA、RT-PCR和GM-ELISA的靈敏度分別為80.56%、72.22%、58.33%，特異性為80.00%、84.00%、82.00%?？傊琋ASBA與ELISA結(jié)合，可用于大規(guī)模樣品檢測并有半定量結(jié)果，具有很好的參考價值。

4 鏈置換等溫擴增技術(shù)

4.1 原理

Walker G T等[20]于1992年報道了關(guān)于鏈置換擴增(SDA)的研究，標志著一種新的核酸等溫擴增技術(shù)的誕生。反應(yīng)體系包括限制性核酸內(nèi)切酶、鏈置換DNA聚合酶、兩對引物等。反應(yīng)包括3個階段：①引物與DNA單鏈上對應(yīng)的靶DNA序列結(jié)合，使靶DNA兩端帶上被化學修飾的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列；②核酸內(nèi)切酶在其識別位點將DNA鏈打開缺口，DNA聚合酶在缺口處向3′端延伸并置換出DNA單鏈；③被替換下來的DNA單鏈可分別與引物結(jié)合并延伸形成雙鏈。在37℃條件下反復(fù)循環(huán)2 h，擴增靶序列的拷貝數(shù)可達108。其原理見圖4。

圖4 SDA的原理(Walker G T et al.1992)

4.2 優(yōu)缺點

優(yōu)點：鏈置換依靠具有鏈置換活性的DNA聚合酶進行循環(huán)擴增，基于此，其他等溫擴增技術(shù)相繼出現(xiàn)，使核酸擴增方法效率更高、更快速簡便。

缺點：SDA必須使用修飾過的dNTP，不能完成長片段的擴增；在建立缺口時要加入非標準核苷酸，因此成本增加的同時擴增效率卻降低；SDA產(chǎn)物兩端還殘留著核酸內(nèi)切酶的識別序列，不能用于克隆。

4.3 發(fā)展與應(yīng)用

SDA在疾病和基因診斷等方面已有報道。為了彌補其缺點，鄧世瓊等[21]將缺口酶Nt.Bst- NBI代替限制性內(nèi)切酶，通過體系優(yōu)化建立了一種低成本的新型檢測方法，可在30 min內(nèi)檢測到2 pmol/L的質(zhì)粒DNA，具有很好的應(yīng)用前景。

馬雯[22]將SDA與電化學傳感技術(shù)聯(lián)用構(gòu)建核酸多酶標記體系，建立了一種高效、快速的miRNA檢測方法。利用磁性納米顆粒作為液相檢測的微載體，將探針連接至微載體后體系中的miRNA與微載體上的探針結(jié)合，可將引物與聚合酶連接到探針上進行延伸并進入循環(huán)擴增。擴增結(jié)束后，加入鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶(streptavidin-alkaline phosphatase，Sa-ALP)通過磁性分離，可在磁性顆粒上標記大量酶而產(chǎn)生酶促產(chǎn)物抗壞血酸，經(jīng)電極氧化為脫氫抗壞血酸，最終檢測產(chǎn)生的氧化峰電流。該方法檢測限為9 fM，與熒光定量PCR結(jié)果一致。

針對SDA必須使用修飾過的dNTP的問題，優(yōu)思達公司研發(fā)出一種切刻內(nèi)切酶等溫擴增技術(shù)(nicking enzyme mediated isothermal amplification，NEMA)，將限制性內(nèi)切酶用嗜熱切刻內(nèi)切酶替換，該方法不但減少成本，還能擴增長片段。王紀東等[23]已建立了檢測蠟樣芽胞桿菌質(zhì)粒的NEMA技術(shù)，得到450 bp的擴增產(chǎn)物。目前，已經(jīng)開發(fā)出NEMA試劑盒并獲得專利。

5 交叉引物等溫擴增技術(shù)

5.1 原理

交叉引物擴增技術(shù)(CPA)是杭州優(yōu)思達生物公司新研發(fā)的一種等溫擴增技術(shù)，中國首個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的核酸擴增技術(shù)[24]。根據(jù)交叉引物數(shù)量的不同，CPA可分為雙交叉擴增和單交叉擴增。

雙交叉引物擴增包括3對引物(兩條交叉引物、兩條剝離引物和兩條探針)、Bst DNA聚合酶、甜菜堿及其他必要成分。正向交叉引物中的1s與模板互補序列結(jié)合，在鏈置換DNA聚合酶的作用下完成延伸，剝離引物3s將合成的DNA單鏈置換下來，反向交叉引物2a與其結(jié)合并延伸，經(jīng)剝離引物4a置換，即可產(chǎn)生帶有交叉引物位點的擴增產(chǎn)物。以帶有交叉引物位點的擴增產(chǎn)物為模板，通過交叉引物和DNA聚合酶的循環(huán)雜交、延伸，就可得到大量重復(fù)帶有交叉位點的擴增產(chǎn)物。其原理見圖5。

單交叉引物擴增體系中只有一條交叉引物，首先交叉引物中的1s與模板互補序列結(jié)合延伸，剝離引物4s置換出新合成的單鏈，將2a引入到擴增產(chǎn)物中，在鏈置換DNA聚合酶作用下，以新合成的單鏈為模板，引入特異引物3a、2a，得到兩條不同的單鏈DNA。2a和交叉引物分別與單鏈DNA產(chǎn)物迅速結(jié)合并延伸，形成兩條不同長度的產(chǎn)物。以此產(chǎn)物為模板，引物1s或3a、2a與其結(jié)合、延伸，不斷循環(huán)雜交，最終得到大量擴增產(chǎn)物。其原理見圖6。

a．引物設(shè)計位點；b．帶有交叉引物位點擴增模板的產(chǎn)生 a．Primer design site；b．Generation of the template with cross-priming site

a．引物設(shè)計位點；b．帶有引物位點模板的產(chǎn)生 a．Primer design site；b．Generation of the template with primer site

5.2 優(yōu)缺點

優(yōu)點：操作簡單，在水浴鍋內(nèi)63℃左右條件下1 h即可得到大量產(chǎn)物，結(jié)合膠體金試紙條技術(shù)可快速得到檢測結(jié)果。

缺點：反應(yīng)體系復(fù)雜，方法不穩(wěn)定，有假陽性現(xiàn)象[25]。

5.3 發(fā)展與應(yīng)用

為解決開蓋檢測帶來的污染，尤思達公司發(fā)明了一次性核酸檢測裝置，并相繼研發(fā)了多種檢測試劑盒。趙婷婷等已成功建立了炭疽芽胞桿菌的CPA檢測方法，其靈敏度可達5.4 pg，對炭疽Sterne疫苗株的檢測限為6×103CFU/mL，與其他相似菌株均無交叉反應(yīng)[26]。表明建立的方法特異性好、靈敏度高，可應(yīng)用于國境檢疫及公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域。

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是一種高度傳播的冠狀病毒，可引起仔豬尤其是新生仔豬嚴重的腸道疾病。Wang F X等開發(fā)了快速檢測PEDV的CPA-NATS方法，針對PEDV的N基因序列特異設(shè)計5條引物，其中兩個特異引物5′端分別連接生物素和FITC，可與膠體金試紙條上的相應(yīng)抗體結(jié)合，根據(jù)試紙條檢測線和質(zhì)控線處有無條帶判定擴增結(jié)果。結(jié)果表明，該方法對PEDV的檢測特異性高，雖然檢測限與PCR一致，但用時少，不需要復(fù)雜的儀器，為現(xiàn)場快速準確診斷該病提供了很好的解決方法[27]。

6 應(yīng)用前景及展望

診斷檢測方法的建立，最終目的均是應(yīng)用到實際檢測中去。等溫擴增技術(shù)無需復(fù)雜的儀器，不需要熱變性與溫度循環(huán)，同時具有簡便、快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，因此被寄予厚望。然而，等溫擴增技術(shù)作為一種新興技術(shù)仍具有很大的改進空間。首先，LAMP、CPA、SDA和NASBA方法涉及到引物較多和引物設(shè)計要求較高等問題，從而限制了其在病原檢測中的應(yīng)用。其次，等溫擴增產(chǎn)物多為同一片段形成的多拷貝長鏈，反應(yīng)體系中即使只含有一條因氣溶膠污染而存在的擴增產(chǎn)物，其擴增的目的片段濃度也提高了幾十倍甚至幾千倍，因此該方法極易產(chǎn)生假陽性。針對這一問題，Hsieh K等[28]在反應(yīng)體系中加入dUTP，將擴增產(chǎn)物的胸腺嘧啶替換為尿嘧啶，同時加入的尿嘧啶-DNA-糖基化酶(uracil-DNA-glycosylase，UDG)通過特異性地降解尿嘧啶來消除污染。另外，杭州尤思達生物公司研制了一次性檢測裝置，等溫擴增反應(yīng)階段及檢測階段均在密閉的檢測裝置內(nèi)進行，避免開蓋帶來的污染，有效解決了氣溶膠帶來的污染問題[29]。

目前，等溫擴增技術(shù)如何與可視化生物傳感器相結(jié)合并進行高通量的現(xiàn)地檢測成為當前研究的熱點。微流控芯片技術(shù)通過與等溫擴增技術(shù)相結(jié)合，僅在一個芯片上即可完成核酸提取、擴增和檢測等過程，具有快速、簡便、結(jié)果直觀和可進行高通量篩選等優(yōu)點[30]。隨著相應(yīng)的便攜式裝置的開發(fā)及費用的降低，等溫擴增-微流控芯片技術(shù)必將成為下一代基因快速檢測的發(fā)展方向。

綜上所述，等溫擴增技術(shù)以其操作簡便、省時省力和不需要昂貴儀器的特性逐漸得到廣泛應(yīng)用，隨著對它們的不斷完善，一定會成為在生物學、醫(yī)學和獸醫(yī)學領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的檢測方法。

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Abstract:Isothermal amplification technology is a new type of nucleic acid amplificationinvitrothat grows rapidly in recent years.Compared with traditional PCR,this technology takes advantages such as low cost,easy-to-operate,higher sensitivity and specificity.Many isothermal amplification technologies are applied to the detection of bacteria,viruses and other pathogens.Here the principle,feature and application of isothermal amplification technologies are reviewed including loop-mediated isothermal amplification (LAMP),helicase-dependent isothermal amplification (HDA),nucleic acid sequence-based amplification (NASBA),strand displacement amplification (SDA),and cross priming amplification (CPA).It provides a reference for the practical applications in the detection of pathogens.

Keywords:isothermal amplification technology; principle; pathogen detection

ApplicationofIsothermalAmplificationTechnologyinDetectingPathogens

GAO Yao1,2,MENG Xing-yu1,LUO Yu-zi1,HU Yong-hao2,QIU Hua-ji1

(1.StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin,Heilongjiang,150069,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu,730070,China)

S854.4

A

1007-5038(2017)08-0103-07

2017-02-09

國家重點研發(fā)計劃畜禽重大疫病防控與高效安全養(yǎng)殖綜合技術(shù)研發(fā)專項(2016YFD0500705)

高 瑤(1991- )，女，河南鶴壁人，碩士研究生，主要從事動物傳染病分子診斷技術(shù)研發(fā)。*