吳聰慧，張振威，袁王俊

河南大學(xué) 中藥研究所，開封 475004

杜仲內(nèi)生真菌Alternariasp.抗菌活性部位篩選

吳聰慧，張振威，袁王俊

河南大學(xué) 中藥研究所，開封 475004

〔目的〕 篩選杜仲內(nèi)生真菌Alternariasp.的抗菌活性部位。〔方法〕 分別提取其發(fā)酵液的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位，采用紙片擴散法評價對病原菌的抑菌活性?！步Y(jié)果〕 乙酸乙酯部位能有效抑制多種致病菌，具有廣譜抗菌作用，正丁醇部位的抑菌效果次之，石油醚部位僅對個別測試菌有微弱抑菌效果?！步Y(jié)論〕乙酸乙酯部位是杜仲內(nèi)生菌Alternariasp.最主要的活性部位。

Alternariasp.，抑菌作用，活性部位

Abstract: 〔Objective〕To study the antibacterial activity site of endophytic fungusAlternariasp. 〔Methods〕A review by Disc diffusion method of the secondary metaboites were extracted from the fermentation broth by three different kinds of organic solvent, the petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol.〔Results〕The ethyl acetate fraction could effectively inhibit a variety of pathogenic bacteria, with broad-spectrum antibacterial effect. The antibacterial effect of butanol part showed weaker than the ethyl acetate fraction. Petroleum ether parts of the individual test bacteria showed weakest inhibitory effect. 〔Conclusion〕Ethyl acetate extractive fraction is the best active part fromAlternariasp.

Keywords:Alternariasp., Bacteriostasis, agens site

內(nèi)生真菌是在其生活史或生活史中某一段時間生活在植物組織內(nèi)，但不會引起植物組織明顯病害癥狀的真菌[1]。內(nèi)生真菌不僅與宿主的次生代謝產(chǎn)物的合成有關(guān)，能直接影響藥用植物的品質(zhì)，還可產(chǎn)生具有特殊結(jié)構(gòu)或者新穎的生物活性。內(nèi)生真菌是一類篩選新醫(yī)藥、農(nóng)藥活性物質(zhì)的重要微生物資源，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥及食品工業(yè)中具有很大的應(yīng)用潛力[2]。

本課題組前期發(fā)現(xiàn)一株杜仲內(nèi)生真菌Alternariasp.具有較好的抑菌作用。本研究擬篩選其抑菌活性部位，以期為杜仲內(nèi)生真菌Alternariasp.抑菌活性成分的進一步篩選及新的抗菌藥物的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

杜仲內(nèi)生真菌Alternariasp.由本課題組篩選。病原菌為金色葡萄球菌Staphylococcusaureus，大腸桿菌Escherichiacoli，蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus，柑橘潰瘍病菌XanthomonasCampestris，枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，小麥赤霉病菌Fusariumgraminearum，禾谷鐮刀菌Fusariumgraminearum，白色念珠菌Moniliaalbican均由河南大學(xué)中藥研究所保存菌種。

1.2 方法

將內(nèi)生真菌Alternariasp.接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)7 d左右，總發(fā)酵量為5 L。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液超聲30 min后用布氏漏斗除去菌絲后離心10 min(12 000 rpm/min)，取上清液分別用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇等體積萃取3次，減壓濃縮得到發(fā)酵液浸膏，精確稱重。以甲醇做溶劑，配置成0.02 mg/L溶液，利用KB紙片法測試發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌效果[3]。取20 μL溶液滴加在空白藥敏紙片Φ=6 mm，充分飽和后，轉(zhuǎn)接于涂布各病原菌檢測平板中，作3個重復(fù)。置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)(生物檢測平板：細(xì)菌37 ℃，24 h；真菌28 ℃，48 h)觀察結(jié)果。設(shè)純甲醇溶液為空白對照。

2 結(jié)果

內(nèi)生真菌Alternariasp.不同提取部位浸膏量如下：石油醚部位0.639 2 g，乙酸乙酯部位1.449 3 g，正丁醇部位1.897 5 g。正丁醇和乙酸乙酯部位提取物量較多，石油醚部位量最少。

由表1可以看出，內(nèi)生真菌Alternariasp.的石油醚，乙酸乙酯部位和正丁醇部位抗菌活性顯著不一致。石油醚部位僅對柑橘潰瘍病菌，蠟樣芽孢桿菌有微弱抗菌效果。乙酸乙酯部位對供試致病菌均具有較好的抑菌活性，抑菌圈直徑為16.03～23.19 mm，特別是柑橘潰瘍桿菌抑菌圈達(dá)到23.19 mm，對禾谷鐮刀菌抑菌圈也達(dá)到19.36mm；乙酸乙酯部位對白色念珠菌抑菌效果相對較差，但抑菌圈也達(dá)到16.03 mm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出其他部位對白色念珠菌的抑菌活性。正丁醇部位也具有較好廣譜抗菌作用，對各種致病菌均有抑作用，抑菌圈直徑為1.05～15.13 mm，其中對柑橘潰瘍病菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性，抑菌圈達(dá)到15.13 mm，正丁醇部位對各種致病菌抑菌效果不如乙酸乙酯部位?？傊?，內(nèi)生真菌Alternariasp.發(fā)酵液的乙酸乙酯部位不僅含量高而且抑菌活性強。

表1 內(nèi)生真菌Alternaria sp.不同部位對7種致病菌的抗菌效果(mm)

注：所有測量均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，每行中不同字母表示差異顯著(P<0.05)，“-”表示沒有抑菌活性。

A.乙酸乙酯部位；B.正丁醇部位；C.石油醚部位；D.甲醇圖1 內(nèi)生真菌Alternaria sp.不同提取部位對柑橘潰瘍病菌的抑菌效果

3 結(jié)論

內(nèi)生真菌是一類篩選新醫(yī)藥、農(nóng)藥活性物質(zhì)的重要微生物資源，在農(nóng)業(yè)和天然藥物研究開發(fā)和應(yīng)用中具有應(yīng)用潛力[4-5]。本研究篩選了一株抑菌效果好的杜仲內(nèi)生真菌Alternariasp.發(fā)酵液的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3個不同部位的抑菌活性。結(jié)果表明，內(nèi)生真菌Alternariasp.發(fā)酵液乙酸乙酯部位的抑菌活性效果最好，其次為正丁醇部位。應(yīng)優(yōu)先從其發(fā)酵液的乙酸乙酯部位篩選活性成分。

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[責(zé)任編輯段金卯]

ScreenofantibacterialactivitysitefromEucommiaulmoidesendophyticfungusAlternariasp.

WU Conghui, ZHANG Zhenwei, YUAN Wangjun

Institute of Chinese Materia Medica, Henan University, Kaifeng 475004, China

R927.1

A

1672-7606(2017)03-0174-03

2016-11-17

河南省教育廳自然科學(xué)重點項目(13A180057)

吳聰慧(1991-)，女，河南平頂山人，在讀研究生，研究方向：中藥資源。