王 濤 郭 歡 王海濤 張永東 郭紅云 劉元強 蘇海翔

(甘肅省醫(yī)學科學研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心，甘肅 蘭州 730050)

白藜蘆醇對血紅素氧化酶-1誘導(dǎo)的離體星形膠質(zhì)細胞損傷的保護作用

王 濤 郭 歡 王海濤 張永東 郭紅云 劉元強 蘇海翔

(甘肅省醫(yī)學科學研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心，甘肅 蘭州 730050)

目的探討白藜蘆醇對血紅素氧化酶(HO)-1誘導(dǎo)的離體星形膠質(zhì)細胞損傷的保護作用。方法體外培養(yǎng)、純化獲得星形膠質(zhì)細胞，并構(gòu)建 HO-1 基因轉(zhuǎn)染入星形膠質(zhì)細胞，在施加白藜蘆醇干預(yù)后，運用CCK-8 法檢測細胞損傷情況，Western印跡檢測HO-1 蛋白的表達及普魯士藍染色法檢測鐵離子的沉積情況。結(jié)果GFAP 鑒定顯示95%以上的細胞為星形膠質(zhì)細胞；轉(zhuǎn)染HO-1基因入星形膠質(zhì)細胞后 HO-1 蛋白顯著升高2.3倍；在施加白藜蘆醇干預(yù)后，100 μmol/L白藜蘆醇均能降低HO-1 蛋白的表達；同時，10、50 μmol/L白藜蘆醇也能夠降低55%鐵離子的沉積。結(jié)論白藜蘆醇對HO-1誘導(dǎo)的離體星形膠質(zhì)細胞損傷具有較好的保護作用。

白藜蘆醇；血紅素氧化酶-1；星形膠質(zhì)細胞；鐵沉積

研究表明，白藜蘆醇在帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中發(fā)揮著重要保護作用〔1,2〕。血紅素氧化酶(HO)能夠催化血紅素降解的酶，其中誘導(dǎo)型的 HO-1 所催化的酶解反應(yīng)被認為是一種由氧應(yīng)激引起的細胞保護性反應(yīng)機制〔3〕。有研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦組織的病理改變有β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積，線粒體過量鐵沉積、氧化性損傷、功能障礙等，這些病理變化與患者腦組織 HO-1 高表達密切相關(guān)〔4〕。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，HO-1 的高表達對離體星形膠質(zhì)細胞具有損傷作用〔5〕，同時會增加細胞內(nèi)的鐵離子沉積〔6〕，促進線粒體的氧化性損傷〔4〕。本實驗構(gòu)建 HO-1 過表達的星形膠質(zhì)細胞模型，觀察白藜蘆醇對 HO-1 誘導(dǎo)的離體星形膠質(zhì)細胞 HO-1 表達和鐵離子沉積的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 DMEM/F12 培養(yǎng)基和胎牛血清購于 Hyclone公司；HO-1兔抗大鼠多克隆抗體購于Abcam公司；β-actin小鼠抗大鼠單克隆抗體、GFAP兔抗大鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠 IgG 購于中杉金橋公司；白藜蘆醇(CAS No.：501-36-0)購于 Aladdin 公司；CCK-8 購于日本同仁公司；GenEscortTMⅡ轉(zhuǎn)染試劑體購于慧基生物有限公司；普魯士藍染色試劑盒購于索萊寶公司。

1.2星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及鑒定 參照Gupta等〔4〕的方法，取新生2 d內(nèi)的乳鼠，超凈臺內(nèi)無菌條件下斷頭取腦分離出大腦皮層剪碎，胰酶消化，離心、吹打及過濾后，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)45～60 min后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，采用差速貼壁處理〔7〕，去除成纖維細胞成分。5～7 d 傳代 1 次，傳至第3代時，使用GFAP抗體的免疫組化鑒定星形膠質(zhì)細胞。

1.3建立 HO-1 過表達的星形膠質(zhì)細胞模型 參照Song等〔8〕的方法，擴增的 HO-1 基因片段與 pcDNA3.1/Zeo 載體連接，轉(zhuǎn)化 E.Coli Top10 感受態(tài)細胞，提取、純化的質(zhì)粒用紫外分光計測定 A260/A280 值和濃度，內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定，并送上海生工生物技術(shù)有限公司測序進一步驗證，按照相同的方法，制備 1 個不帶有 HO-1 基因片段的表達載體作為陰性對照。細胞培養(yǎng)用含有10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃條件下、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h接種星形膠質(zhì)細胞至24孔板，每孔細胞約2×105個，轉(zhuǎn)染時細胞融合度達到80%～90%。按照 GenEscortTMⅡ 說明書配制質(zhì)粒和脂質(zhì)體復(fù)合物，轉(zhuǎn)染體系為 200 μl，每孔終體積為2 ml，放入37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后換液，同時設(shè)立陰性對照組。

1.4實驗分組 將實驗分為HO-1組和HO-1+白藜蘆醇組，其中白藜蘆醇濃度分為25、50、100、200、400和800 μmol/L 6個亞組，測定細胞增殖情況，計算IC50值。將細胞分為Sham組(轉(zhuǎn)染陰性對照)、HO-1 組和 HO-1+白藜蘆醇組，其中白藜蘆醇濃度分為 10、50和100 μmol/L 3個亞組，鑒定 HO-1 蛋白表達水平和鐵離子的沉積情況。

1.5CCK-8 測定細胞抑制率 將轉(zhuǎn)染后的模型細胞接種于96孔板，同時設(shè)空白對照組(未施加白藜蘆醇處理)，陰性對照組(不加 CCK-8)，每孔加200 μl含不同濃度白藜蘆醇的 DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后加入 10 μl CCK-8 溶液，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，酶標儀450 nm下測各孔吸光度。每個檢測濃度下設(shè)4個復(fù)孔，重復(fù)3次檢測，并計算白藜蘆醇對過表達HO-1細胞模型的抑制率。根據(jù)Bliss法運用SPSS16.0計算IC50值。抑制率計算公式：細胞抑制率=〔(對照孔-實驗孔)/(對照孔-空白孔)〕×100%。

1.6Western印跡檢測白藜蘆醇對模型細胞HO-1表達的影響 取等量蛋白樣品加入10%SDS-PAGE分離后，以半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至 NC 膜上，加入脫脂牛奶室溫搖床封閉2 h；分別加入稀釋的一抗，4℃過夜；次日洗脫緩沖液洗膜，分別加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，洗膜；電化學發(fā)光(ECL)顯色后，置于Chemi Doc XRS+凝膠成像系統(tǒng)中曝光并拍照。采用 Image Lab 5.2 軟件對顯影條帶進行分析，計算HO-1條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值，作為 HO-1 蛋白的相對表達水平。

1.7白藜蘆醇對HO-1過表達細胞模型中鐵沉積的影響 細胞爬片用4%的多聚甲醛固定10～20 min，蒸餾水沖洗2次，每次2 min。配置Perls stain普魯士藍染液(亞鐵氰化鉀溶液和濃鹽酸以1∶1的比例混合)，滴在爬片上，室溫孵育60 min后，棄染液，蒸餾水沖洗2次，每次2 min。置于顯微鏡下觀察普魯士藍染色的分布，400倍下每組各取10個視野照相存檔。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對普魯士藍染色結(jié)果進行免疫組化定量分析，觀察值用平均光密度(IOD)值表示。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件包進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1星形膠質(zhì)細胞鑒定結(jié)果 星形膠質(zhì)細胞傳代至第3代時采用GFAP抗體免疫組化鑒定，陽性率達95%以上，結(jié)果說明絕大多數(shù)細胞為星形膠質(zhì)細胞，見圖1。

2.2HO-1 過表達細胞模型的建立 Western印跡技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染陰性對照載體的星形膠質(zhì)細胞的HO-1蛋白(32 kD) 條帶較淺，而轉(zhuǎn)染目的基因載體的星形膠質(zhì)細胞HO-1蛋白表達顯著增強，與Sham組相比升高2.3倍，其 Mean IOD比值有顯著差異，見圖2。每種細胞β-Tubulin 蛋白條帶表達水平相同，提示上樣量無差異。

圖1 星形膠質(zhì)細胞的免疫組化鑒定(×400)

圖2 Western印跡分析質(zhì)細胞和轉(zhuǎn)染HO-1過表達細胞模型

2.3CCK-8測定細胞抑制率 25、50、100、200、400、800 μmol/L白藜蘆醇對HO-1基因轉(zhuǎn)染后的星形膠質(zhì)細胞生長抑制率分別為(12.65±1.02)%、(35.75±1.92)%、(50.51±3.33)%、(55.48±4.11)%、(78.72±7.21)%及(85.26±5.10)%，細胞抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)，并具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.959。根據(jù) Bliss 法運用SPSS16.0軟件擬合線性回歸方程，計算出白藜蘆醇的 IC50值為(118.03±2.49)μmol/L。

2.4Western印跡檢測白藜蘆醇對模型細胞 HO-1表達的影響 白藜蘆醇對細胞模型的HO-1表達的影響見圖3，與Sham組相比，HO-1組 HO-1蛋白表達增加7.14倍。與 HO-1組相比，10、50、100 μmol/L白藜蘆醇能不同程度地降低過表達HO-1的星形膠質(zhì)細胞中HO-1蛋白的表達，分別降低到37.70%，32.85%及39.81%。

2.5白藜蘆醇對HO-1過表達細胞模型中鐵沉積的影響 普魯士藍染色顯示，Sham 組大鼠細胞幾乎沒有藍色鐵沉積。與 Sham 組相比較，HO-1組細胞內(nèi)可見明顯藍色鐵沉積。與HO-1組比較，白藜蘆醇組藍色染色均明顯減少。見圖4。定量分析顯示，與 Sham 組(2.16)比較，HO-1組的Mean IOD值(5.55)提高了2.58倍(P<0.01)；與HO-1組比較，白藜蘆醇能不同程度地減少由于過表達HO-1而導(dǎo)致的鐵離子，10 μmol/L白藜蘆醇降低到55.17%(3.06，P<0.01)，50 μmol/L白藜蘆醇降低到55.63%(3.09，P<0.01)。

1～5:Sham組、HO-1組、HO-1+10、50、100 μmol/L白黎蘆醇組圖3 白藜蘆醇作用細胞模型后HO-1表達的 Western印跡檢測結(jié)果

箭頭所示為鐵沉積部位圖4 白藜蘆醇對HO-1引起的鐵沉積的影響 (普魯士藍染色，×400)

3 討 論

HO是參與血紅素降解的重要酶類之一，可把血紅素氧化為膽綠素、游離的Fe2+和一氧化碳〔9〕，其中誘導(dǎo)型的HO-1所催化的酶解反應(yīng)被認為是一種由氧應(yīng)激引起的細胞保護性反應(yīng)機制〔10〕。研究表明，AD患者腦組織中線粒體過量鐵沉積、氧化性損傷、β淀粉樣蛋白沉積等病理變化與患者腦組織HO-1高表達密切相關(guān)〔4〕。輕微認知障礙(MCI)患者的顳葉皮層和海馬神經(jīng)膠質(zhì)細胞中HO-1表達水平顯著高于非癡呆組，而與AD患者相近〔11〕。這說明皮層和海馬的氧化脅迫造成的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中HO-1的高表達現(xiàn)象是 AD 發(fā)病機制的早期事件。由于AD的病因不明，目前臨床上主要針對AD膽堿能神經(jīng)元受損假說使用神經(jīng)遞質(zhì)替代治療藥物及非特異性神經(jīng)保護類藥物以延緩神經(jīng)元退行性病變的進展，如雌激素、非甾體類抗炎藥、神經(jīng)營養(yǎng)因子、促神經(jīng)細胞代謝藥等。但是，目前國內(nèi)外在臨床上尚缺乏針對調(diào)節(jié)HO-1通路的 AD治療藥物。因此，尋找毒性低、能降低HO-1損傷、提高治療效果的藥物顯得尤為重要。白藜蘆醇是具有多種有益的生物學效應(yīng)的多酚類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、增強免疫調(diào)節(jié)、保護心血管等多種有益于人類健康的藥理活性，Jin等〔12〕發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對 6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的PD模型大鼠具有明顯的保護效應(yīng)，能夠降低模型大鼠腦黑質(zhì)中炎癥相關(guān)因子環(huán)氧化酶(COX)-2及腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達。王剛等〔1〕也發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠改善小鼠海馬神經(jīng)元的神經(jīng)可塑性，從而逆轉(zhuǎn)Aβ引起的小鼠的學習記憶損傷。由于星形膠質(zhì)細胞增生與激活在AD的發(fā)病機制中起著重要的作用。AD病理性神經(jīng)血管單元的重塑與星形膠質(zhì)細胞損傷有關(guān)，且在疾病早期出現(xiàn)，能導(dǎo)致認知異?！?3〕。本實驗表明白藜蘆醇可能對HO-1高表達導(dǎo)致的細胞模型損傷具有保護作用。這與Juan等〔14〕的研究關(guān)于白藜蘆醇在≥20 μmol/L時，降低HO-1的表達和啟動子的活性的研究結(jié)論一致。本研究表明白藜蘆醇對HO-1誘導(dǎo)的離體星形膠質(zhì)細胞的損傷具有保護作用，而這種保護能力可能與其能夠清除由于HO-1催化血紅素分解而產(chǎn)生的自由基有關(guān)。此結(jié)果與HO-1抑制劑錫中卟啉(SnMP)或DEX可消除人HO-1基因過表達的影響，減少鐵離子的沉積的研究結(jié)果非常相似〔15〕。

鐵可催化H2O2還原成活性極強的羥自由基，可能是造成氧脅迫的主因，同時，HO-1表達水平升高是星形神經(jīng)膠質(zhì)細胞線粒體鐵沉積的關(guān)鍵，而多酚類的化合物由于具有天然螯合鐵的能力，因此可減輕鐵超載導(dǎo)致的神經(jīng)細胞損傷。本實驗結(jié)果證實白藜蘆醇能夠降低HO-1表達的同時，也具有清除HO-1高表達所引起的鐵沉積的能力，10 μmol/L白藜蘆醇是保護血紅素氧化酶-1誘導(dǎo)的離體星形膠質(zhì)細胞損傷的最佳濃度。

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〔2016-07-16修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R741

A

1005-9202(2017)18-4452-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.009

甘肅省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目(No.GZK-2010-Z7)

蘇海翔(1963-)，女，博士，研究員，主要從事衰老、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤相關(guān)的機制研究。

王 濤(1981-)，男，助理研究員，碩士，主要從事抗神經(jīng)退行性疾病、抗腫瘤藥物篩選及其機制研究。