陳燕超 陳澤華 張建新

(廈門市第二醫(yī)院，福建 廈門 361021)

硫酸軟骨素調(diào)配海藻酸鈉復(fù)合膠對兔骨折愈合的影響

陳燕超 陳澤華1張建新2

(廈門市第二醫(yī)院，福建 廈門 361021)

目的探討海藻酸鈉復(fù)合膠中加入硫酸軟骨素對兔骨折愈合的影響。方法新西蘭大白兔72只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為膠1組、膠2組、絲線組和模型組，每組18只。無菌手術(shù)條件下在橈骨上造成一大小為0.8 cm×0.4 cm蝶形骨塊，其中膠1組用A膠(海藻酸鈉∶羧甲基纖維素鈉：硫酸軟骨素=6.0∶2.5∶0.75)黏接固定，膠2組用B膠(海藻酸鈉∶羧甲基纖維素鈉=6.0∶2.5)黏接固定，并在黏接處滴飽和氯化鈣溶液5滴，使膠表面形成一層海藻酸鈣膜；絲線組以4號絲線將骨塊捆扎固定；模型組將骨塊放至原位置，不做任何固定；逐層縫合切口，用無菌敷料包扎。術(shù)后2 w、4 w和6 w分別對膠1組、膠2組、絲線組、模型組拍攝X線片，觀察骨折愈合情況，然后各組于各時間段處死6只取出骨折端進(jìn)行骨痂組織切片HE染色，鏡下觀察不同時間段各組骨痂生長情況；采集骨折局部皮下組織，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測不同時間段各組骨折局部皮下組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、白細(xì)胞介素(IL)-6含量。結(jié)果術(shù)后X線片：膠1組、膠2組術(shù)后6 w骨折骨性愈合，位線良好；絲線組骨折線基本消失，骨干外形成陳舊性骨折影；模型組骨折畸形愈合，可見明顯骨缺損。HE染色：膠1組、膠2組術(shù)后骨軟細(xì)胞成骨活躍，炎癥反較輕，絲線組和模型組肉芽組織增生明顯，炎癥反應(yīng)較重。術(shù)后2、4、6 w時骨折局部皮下組織中IL-6、BMP的ELISA檢測：骨折局部皮下組織中BMP的含量均為膠1組>膠2組>絲線組>模型組(P<0.05)；IL-6的水平以絲線組最高(P<0.05)，膠1組、膠2組和模型組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉的復(fù)合膠能有效黏合小骨折塊，炎癥反應(yīng)小；硫酸軟骨素能促進(jìn)骨折愈合過程中BMP的表達(dá)，在海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉的復(fù)合膠中加入一定比例的硫酸軟骨素制成的新型骨黏合劑更有利于骨折的愈合。

海藻酸鈉；羧甲基纖維素鈉；骨黏合劑；硫酸軟骨素；骨形態(tài)發(fā)生蛋；骨折

對骨折中粉碎的骨碎片，傳統(tǒng)方法一般采用骨片釘、克氏針等固定，骨碎片的拼湊、固定不僅延長了手術(shù)時間，同時有骨碎片再次碎裂的風(fēng)險，而且術(shù)后內(nèi)固定物需再次手術(shù)取出。隨著科技的發(fā)展，醫(yī)用黏合劑黏合骨碎片使骨碎片復(fù)位更簡便，因而臨床應(yīng)用越來越普遍〔1〕。醫(yī)用黏合劑在生物力學(xué)上能達(dá)到理想的固定強(qiáng)度〔2〕，同時能填補(bǔ)少量骨缺損，有效避免傳統(tǒng)植骨和骨折延遲愈合及中愈合等并發(fā)癥〔3〕。前期研究表明，海藻酸鈉為主體的復(fù)合膠的黏合強(qiáng)度介于瓜爾膠和羧甲基纖維素鈉之間，對小骨塊可以起到良好固定作用，且無明顯毒副作用〔4～7〕。本實(shí)驗(yàn)將海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉復(fù)合膠中加入一定比例硫酸軟骨素，制備新型骨黏合劑，通過觀察其黏合骨碎片對兔骨折愈合影響。

1 材料和方法

1.1動物和材料 72只新西蘭大白兔，普通級，雌雄各半，體重2.3～2.5 kg，由上海申旺動物養(yǎng)殖場提供，許可證號：SCXK(滬)2002-0011；海藻酸鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠，分析純A.R)；羧甲基纖維素鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純CP)；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、白細(xì)胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(博奧森生物科技有限公司)；無水氯化鈣(浙江衡州市宏遠(yuǎn)化試廠，分析純A.R)；注射用青霉素鈉(福建匯天生物藥業(yè)有限公司)；300MA X線放射機(jī)(北京醫(yī)療器械公司)；PYX-DHS恒溫箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；CUT4060石蠟切片機(jī)(Leica，德國)；BH-2光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，日本)；101A-2真空干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠)。

1.2分組和造模 新西蘭大白兔72只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為膠1組、膠2組、絲線組和模型組，每組18只。用速眠新+氯胺酮以1∶1(2 ml∶2 ml)配成麻醉劑按0.3 ml/kg肌肉注射麻醉，用8%硫化鈉給兔左前肢脫毛。將兔子固定在手術(shù)臺上，用碘伏消毒，鋪巾。無菌條件下，取左前臂中段切口，顯露尺橈骨，先將線鋸穿進(jìn)尺橈骨間，以橈骨內(nèi)上至外下方向?qū)锕卿彸梢恍毙喂钦郏缓笥靡Ч倾Q將骨折近端斷面咬下，造成一大小為0.8 cm×0.4 cm蝶形骨塊，其中膠1組斜形骨折及蝶形骨塊用A膠(海藻酸鈉：羧甲基纖維素鈉∶硫酸軟骨素=6.0∶2.5∶0.75)黏接固定，膠2組斜形骨折及蝶形骨塊用B膠(海藻酸鈉∶羧甲基纖維素鈉=6.0∶2.5)黏接固定，并在黏接處滴飽和氯化鈣溶液5滴，使膠表面形成一層海藻酸鈣膜；絲線組以4號絲線先固定骨干斜形骨折，再繞過橈骨和骨塊，將骨塊捆扎固定；模型組將骨塊放至原位置，不做任何固定；逐層縫合切口，用無菌敷料包扎。術(shù)后連續(xù)5天青霉素鈉(每天80萬U)肌注，預(yù)防感染。剔除術(shù)后死亡(膠1組和對照組各1只)和術(shù)后感染的兔(對照組和模型組各1只)，68只進(jìn)入實(shí)驗(yàn)范圍，其中膠1組17只、膠2組18只、絲線組16只和模型組17只。

1.3觀察指標(biāo) 術(shù)后2 w、4 w和6 w分別對膠1組、膠2組、絲線組、模型組拍攝X線片，觀察骨折愈合情況，然后各組處死6只取出骨折端進(jìn)行骨痂組織切片HE染色，鏡下觀察不同時段各組骨痂生長情況；采集骨折局部皮下組織，ELISA檢測不同時間段各組骨折局部皮下組織BMP、IL-6含量。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1術(shù)后X線片結(jié)果 術(shù)后2 w四組均未見到明顯骨痂生成，膠1組和膠2組均可見骨折斷對位良好，骨折線清晰可見，骨折塊固定在位；絲線組正位片可見小骨折塊移位，橈骨干斷端無明顯移位；而模型組骨折斷端分離，小骨折塊明顯移位。術(shù)后4 w，膠1組與膠2組均可見骨塊位置基本正常，橋接骨痂穿過骨折線，骨折線模糊，內(nèi)外骨痂開始塑形改造；絲線組骨塊位置基本正常，橋接骨痂穿過骨折線，小骨塊吸收，骨折端稍見畸形；模型組小骨折塊分離，骨折線清晰，主骨干與尺骨由橋接骨痂連接。術(shù)后6 w時，膠1組與膠2組均可見骨折線消失，骨干外形連續(xù)，骨髓腔已基本恢復(fù)；絲線組骨折線基本消失，骨干外形成陳舊性骨折影，骨髓腔已基本恢復(fù)且較規(guī)則；模型組骨折畸形愈合，可見明顯骨缺損。見圖1。

2.2各組各時段骨痂切片病理學(xué)觀察 術(shù)后2 w，膠1組可見不規(guī)則編織骨形成，斷端由大量纖維組織及軟骨細(xì)胞填充，成骨細(xì)胞較多；膠2組斷端可見不規(guī)則骨小梁，大量炎性肉芽組織及軟骨細(xì)胞形成，少量膠殘留，膠周圍可見少量淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤；絲線組表現(xiàn)為骨折間隙纖維組織向骨痂過渡，并可見少量軟骨細(xì)胞；模型組可見壞死骨組織被大量炎細(xì)胞包繞，少量纖維結(jié)締組織。術(shù)后4 w時，膠1組可見骨小梁增大，向斷端長入，大片軟骨帶形成，軟骨細(xì)胞成骨活躍；膠2組可見骨小梁增大增粗，向斷端長入，多核細(xì)胞包繞殘存膠及壞死組織；絲線組表現(xiàn)為骨間隙被骨小梁及纖維肉芽組織填充連接，絲線周圍大量多核巨細(xì)胞；模型組可見斷端分離，分離骨塊被吞噬細(xì)胞包圍，分離斷僅由纖維肉芽組織連接，可見較小軟骨細(xì)胞。術(shù)后6 w時，膠1組、膠2組和絲線均可見骨性骨痂形成，膠1組可見大量成熟骨細(xì)胞，髓腔中見到大量髓細(xì)胞，中無膠殘留；膠2組也可見大量成熟骨細(xì)胞，無膠殘留；絲線組斷端為骨性骨痂連接，骨小梁排列不規(guī)則，膠原纖維排列致密，絲線周圍少量炎細(xì)胞；模型組斷端分離，纖維肉芽組織填充，見少量骨性骨痂及骨細(xì)胞。見圖2。

2.3各組各時段骨折局部皮下組織BMP、IL-6含量比較 術(shù)后2、4、6 w時骨折局部皮下組織中BMP的含量膠1組>膠2組>絲線組>模型組(P<0.05)；IL-6的水平以絲線組最高(P<0.05)，膠1、膠2組和模型組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表1，表2。

圖2 各組不同時段骨痂生長情況(HE，×100)

組別n術(shù)后2w術(shù)后4w術(shù)后6w膠1組17324.6±28.061)2)3)360.6±23.091)2)3)279.3±24.121)2)3)膠2組18216.03±27.042)3)324.2±14.072)3)251.3±30.432)3)絲線組16160.3±32.163)263.3±25.533)206.4±16.033)模型組17102.2±26.53203.0±31.52120.2±52.41

與膠2組比較：1)P<0.05；與絲線組比較：2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.05

表2 各組不同時段骨折局部皮下組織IL-6含量比較

與絲線組比較：1)P<0.05

3 討 論

海藻酸鹽在鈣離子存在時通過交聯(lián)作用形成開放晶格的水凝膠，凝膠的晶格為細(xì)胞提供支撐，這種結(jié)構(gòu)和機(jī)體的細(xì)胞外基質(zhì)相似，可使細(xì)胞在其中立體排列生長，其成骨效率高〔8〕，同時海藻酸鈉凝膠還能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化〔9〕，是一種良好骨組織工程支架材料，可作為骨組織工程載體。海藻酸鈉膠配以羧甲基纖維素鈉制成的復(fù)合膠具有吸收性良好、無毒、無免疫原性及生物相容性良好等特點(diǎn)，可作為良好的生物膠材料，體外實(shí)驗(yàn)及動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該膠具有較好的黏合力，并有一定的促進(jìn)骨折愈合的能力，是一種良好的骨黏合劑〔10，11〕。而有研究表明，在海藻酸鈉水凝膠中加入其他生物相溶性物質(zhì)能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的細(xì)胞黏附和增殖〔12〕。以上所述，在海藻酸鈉復(fù)合膠中加入一定比例促進(jìn)骨組織形成的物質(zhì)或許能進(jìn)一步增強(qiáng)其促進(jìn)骨折愈合的能力。

硫酸軟骨素是細(xì)胞外基質(zhì)分子的重要組成部分，在促進(jìn)骨組織生成中起重要作用。同時硫酸軟骨素能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的生長、增殖和黏附，改善的BMP承載系統(tǒng)，使BMP 能在組織局部聚集成較高的濃度，從而有利于新骨的形成〔13〕。因此，硫酸軟骨素作為天然骨骼的3種基本成分之一，被應(yīng)用于骨修復(fù)材料中〔14〕。且有研究表明添加硫酸軟骨素的人工骨成骨速度、成骨范圍及Ⅰ型膠原分泌量均優(yōu)于未添加該物質(zhì)的人工骨〔15，16〕。臨床實(shí)驗(yàn)也證實(shí)硫酸軟骨素-A能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，加速種植體周骨質(zhì)的礦化〔17〕。本文結(jié)果表明，海藻酸鈉為主體的復(fù)合膠能有效黏合小骨折塊，促進(jìn)BMP的表達(dá)，而且炎癥反應(yīng)低于絲線；硫酸軟骨素能促進(jìn)骨折愈合過程中BMP的表達(dá)。因此，在海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉的復(fù)合膠中加入一定比例的硫酸軟骨素制成的新型骨黏合劑更有利于骨折的愈合。

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〔2016-10-30修回〕

(編輯 曹夢園)

R683.4

A

1005-9202(2017)18-4449-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.008

福建省衛(wèi)生教育聯(lián)合攻關(guān)項目(WKJ2008-2-38)

1 福建中醫(yī)藥大學(xué) 2 廈門市中醫(yī)院

張建新(1967-)，男,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師，主要從事骨缺損修復(fù)研究。

陳燕超(1985-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥治療骨與關(guān)節(jié)損傷研究。