狄婷婷 張 美 王瑞婷

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

不同濃度β-淀粉樣蛋白對大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白CD11b表達(dá)的影響

狄婷婷1張 美 王瑞婷

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

目的探討免疫細(xì)胞膜表面整合素 (CD11b)在β-淀粉樣蛋白(Aβ)所引起阿爾茨海默病(AD)中的作用、機制及與Aβ劑量的關(guān)系。方法雄性Wistar大鼠50只，隨機分為A、B、C、D、E 5組，每組10只；A組大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射5 μl生理鹽水，B～E組雙側(cè)海馬注射5 μl Aβ (分別含Aβ25～350.5、1、5、10 μg)；HE染色觀察五組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化；免疫組化(IHC)檢測海馬CA1區(qū)Aβ、CD11b表達(dá)；實時熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測CD11b mRNA表達(dá)。結(jié)果HE染色，光鏡下觀察D組、E組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯少于A組、B組、C組(P<0.01)；IHC檢測D組、E組兩組Aβ陽性表達(dá)率均高于A組、B組、C組(P<0.01)；D組、E組CD11b陽性表達(dá)率明顯高于A組、B組、C組(P<0.01)；qRT-PCR檢測大鼠海馬組織內(nèi)CD11b mRNA表達(dá)D組、E組組明顯高于A組、B組、C組(P<0.01)。結(jié)論Aβ可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，募集MG到Aβ沉積部位，Aβ沉積量和CD11b表達(dá)量呈正相關(guān)。

阿爾茨海默?。坏矸蹣拥鞍?；小膠質(zhì)細(xì)胞；免疫細(xì)胞膜表面整合素

阿爾茨海默病(AD)是一種以認(rèn)知功能障礙及記憶減退或缺失為主要特征的中樞神經(jīng)退行性疾病〔1〕，其病理改變以大腦皮層和海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞外老年斑(SP)〔2〕形成、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)〔3〕、神經(jīng)突觸的丟失和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡為主要特征〔4，5〕。其中，SP是AD最具特征性的病理改變，主要由β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積而成〔6，7〕，在SP周圍有大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)和炎性因子存在〔8，9〕。有研究認(rèn)為，MG是AD腦內(nèi)炎性反應(yīng)中最重要的炎性細(xì)胞，介導(dǎo)AD病理發(fā)展的全過程。免疫細(xì)胞膜表面整合素(CD11b)為MG的特異性表面標(biāo)志物，其主要在活化的MG胞質(zhì)中表達(dá)，MG在AD發(fā)生過程中起“雙刃劍”的作用，即Aβ激活MG，活化的MG清除、吞噬Aβ，起保護(hù)作用〔10〕。MG的“雙刃劍”作用有無轉(zhuǎn)折點，CD11b的表達(dá)是否與Aβ劑量有關(guān)，成為AD炎癥機制的研究熱點。

1 材料與方法

1.1實驗動物、儀器及主要試劑 Wistar大鼠50只，成年雄性，年齡10～12 w，體重(250±20)g，SPF級，動物證號No.11400700022071，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供〔許可證號：SCXK(京)2012-0001〕。江灣Ⅰ型C腦立體定位儀；微量進(jìn)樣器；Excelsior ES全自動組織脫水機；Z-BJ0010包埋聚合器；RM2125型石蠟切片機；CK40-F200相差倒置顯微鏡；Olympus顯微鏡攝像裝置；MDF-192型超低溫冰箱(-80℃)；DU80型紫外分光光度計；Mx3000P型實時熒光定量PCR儀；各種規(guī)格的微量移液器等。Aβ25～35(A4559，Lot：112M4775V)購自美國Sigma-Aldrich有限公司，HPLC檢測純度≥97%；通用型SP-9001免疫組化染色試劑盒(Lot：14188A)、辣根過氧化物酶、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒 (ZLI-9017，Lot：K136620C)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Aβ25～35抗體(Lot：980287W)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；CD11b抗體(Lot：Y-07D10A)購自武漢博士德生物工程有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒(RR820A，Lot：AK4505)、RNAiso Plus(9108Q，Lot：AK7602)、DEPC水(9013A，Lot：AA1801A)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A，Lot：AK3701)，購自大連寶生物工程有限公司；其他試劑為分析純。Aβ25～351 mg干粉溶于500 μl無菌生理鹽水(2 g/L)，-20℃保存，臨用前置于37℃孵育5～7 d成凝膠態(tài)。

1.2動物分組及處理方法 成年雄性Wistar 大鼠隨機分為5組編號A、B、C、D、E，每組10只。大鼠麻醉后，將其固定在江灣Ⅰ型C腦立體定位儀上，參照大鼠腦立體定位圖譜進(jìn)行腦立體定位海馬CA1區(qū)，A組大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射無菌生理鹽水5 μl，B～E組分別注射不同濃度的Aβ25～35稀釋液各5 μl(分別含Aβ25～350.5、1、5、10 μg)術(shù)后注射青霉素抗感染，于注射Aβ 14 d后處死，取腦組織標(biāo)本。

1.3免疫組化(IHC)檢測Aβ、CD11b表達(dá) 每組取4只大鼠腦組織制作標(biāo)本后，每個標(biāo)本選取海馬CA1區(qū)細(xì)胞損傷段2張石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水合，抗原修復(fù)，山羊血清封閉等步驟；滴加Aβ或CD11bⅠ抗(1∶80)，滴加Ⅱ抗，滴加ABC復(fù)合物，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替Ⅰ抗作為陰性對照。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，計算每組切片的光密度平均值，定量分析IHC檢測Aβ、CD11b陽性細(xì)胞反應(yīng)程度。

1.4qRT-PCR技術(shù)檢測CD11b mRNA表達(dá)水平 每組取6只大鼠，麻醉后，迅速取新鮮腦海馬組織暫存于超低溫冰箱(-80℃)。采用Trizol法提取總RNA；紫外分光光度計檢測RNA的純度；根據(jù)RNA純度檢測結(jié)果計算應(yīng)加入RNA樣品的使用量，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書于冰上將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA；以β-actin為內(nèi)參照，在GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)查找CD11b的基因序列，由TaKaRa生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物設(shè)計并合成，β-actin正義鏈5′-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3′，反義鏈5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′；CD11b正義鏈5′-ACCACTCATTGTGGGCAGCTC-3′，反義鏈5′-CACCGGCTTCATTCATCATGTC-3′。根據(jù)實時熒光定量PCR試劑盒說明書，總反應(yīng)體系為25 μl，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，退火51℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，40個反應(yīng)循環(huán)數(shù)，實時熒光定量PCR儀檢測AD大鼠腦組織中CD11b mRNA表達(dá)水平，記錄各組CT值，利用2-ΔΔCt的方法分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及SNKq檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 光鏡下觀察，A、B、C三組大鼠海馬CA1區(qū)均可見3～4層細(xì)胞，核染色深，形態(tài)完整而清晰，有神經(jīng)元的突起；而D、E組大鼠海馬CA1區(qū)可見大段神經(jīng)元缺失，細(xì)胞層數(shù)明顯減少，多為1～2層，剩余的細(xì)胞腫脹，其細(xì)胞核染色淺，呈空泡狀，突起消失，神經(jīng)元缺失部分有大量膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，以MG為主，并可見MG吞噬神經(jīng)元現(xiàn)象，見圖1。400倍視野下計數(shù)大鼠海馬CA1區(qū)正常完整的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)，D組(84.75±8.10)、E組(66.63±15.18)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯少于A組(126.25±17.37)、B組(120.63±11.34)及C組(114.75±17.79)(均P<0.01)，且A、B、C三組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，D組明顯高于E組(P<0.05)。

2.2IHC觀察Aβ沉積部位及海馬CA1區(qū)Aβ的表達(dá) Aβ陽性表達(dá)為棕黃色顆粒物，分布在神經(jīng)細(xì)胞外和MG胞質(zhì)中，Aβ沉積部位主要在注射區(qū)(即海馬CA1區(qū))周圍，見圖2。IHC檢測結(jié)果顯示，D組(0.020 2±0.005 7)、E組(0.025 7±0.007 4)Aβ陽性表達(dá)率均明顯高于A組(0.002 2±0.000 4)、B組(0.004 1±0.001 0)及C組(0.006 1±0.001 6)(均P<0.01)，且A、B、C三組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，D組明顯低于E組(P<0.05)。

2.3IHC觀察MG形態(tài)及CD11b表達(dá) CD11b陽性表達(dá)為棕黃色顆粒物，包繞在神經(jīng)元的周圍，主要表達(dá)在活化的MG中，表達(dá)部位與Aβ沉積部位相似。A、B、C三組大鼠海馬CA1區(qū)MG活化量少，且MG呈桿狀，分枝也較少；D、E兩組MG的胞體變大，呈橢圓，分枝增多，分布散落，見圖3。IHC檢測結(jié)果顯示，CD11b陽性表達(dá)D組(0.046 0±0.008 3)、E組(0.061 5±0.007 8)明顯高于A組(0.016 6±0.004 8)、B組(0.021 6±0.003 4)、C組(0.023 6±0.004 4)(均P<0.01)，且A、B、C三組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，D、E兩組間差異顯著(P<0.05)。

2.4qRT-PCR法檢測大鼠海馬組織CD11b mRNA表達(dá) 大鼠海馬組織內(nèi)CD11b mRNA表達(dá)水平D組(1.905 2±0.258 0)、E組(2.361 9±0.419 5)明顯高于A組(1.000 0±0.000 0)、B組(1.180 3±0.060 6)及C組(1.279 5±0.182 1)(均P<0.01)，且A、B、C三組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，D、E兩組間差異顯著(P<0.01)。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE，×400)

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)Aβ表達(dá)(IHC，×400)

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)CD11b表達(dá)(IHC，×400)

3 討 論

AD是老年人常見的一種多因異質(zhì)性疾病，其病理表現(xiàn)多樣，涉及多種病理機制。Aβ作為AD發(fā)病的始動因子已得到公認(rèn)〔11〕。體外凝聚狀態(tài)的Aβ25～35與AD患者腦內(nèi)的Aβ結(jié)構(gòu)相似，有研究表明Aβ能引起神經(jīng)元損傷〔12〕。本研究與汪保華等〔13〕研究結(jié)果相吻合，顯示大鼠腦海馬CA1區(qū)注射Aβ25～35可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷，該方法可以用于AD模型制作〔14〕。

MG是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞，參與炎癥和神經(jīng)損傷，是神經(jīng)退行性疾病的始動因子和促進(jìn)因素〔15〕。MG處于靜息狀態(tài)時，缺乏吞噬功能，但具有吞飲和一定的遷移能力，可清除代謝產(chǎn)物，起到“清道夫”的作用。CD11b為MG的特異性表面標(biāo)志物，其主要在活化的MG胞質(zhì)中表達(dá)，本研究提示Aβ沉積可使MG活化，吞噬Aβ，與相關(guān)研究結(jié)果一致〔16～18〕，本研究顯示Aβ劑量增長倍數(shù)為1∶2∶10∶20，而CD11b表達(dá)量為1∶1.08∶1.6∶2，即當(dāng)Aβ劑量達(dá)到5 μg時活化的MG雖然明顯增多，但不足以清除過多的Aβ，致使Aβ通過依賴和不依賴于MG途徑引起D、E 兩組神經(jīng)元損傷。因此可以推測，當(dāng)大鼠腦內(nèi)注射凝膠態(tài)的Aβ后，MG被激活，當(dāng)Aβ劑量較低時，MG對Aβ的吞噬和清除能力明顯，可能還具有神經(jīng)保護(hù)作用；但隨著Aβ劑量不斷增加，MG吞噬和清除Aβ的能力已經(jīng)不足以清除腦內(nèi)過多得Aβ，導(dǎo)致Aβ通過不依賴于MG途徑引起神經(jīng)元損傷。黃月等〔19〕采用不同劑量移植MG對AD大鼠腦內(nèi)Aβ的作用發(fā)現(xiàn)Aβ有趨化MG的作用，但大劑量的MG在對Aβ吞噬作用的同時加速了Aβ的形成?？梢?，Aβ可激活MG，募集MG到Aβ沉積部位，Aβ沉積量和CD11b的表達(dá)量呈正相關(guān)。

1賈建平，陳生弟.神經(jīng)病學(xué)〔M〕.第7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013:217-8.

2Wong CW，Quaranta V，Glenner GG.Neuritic plaques and cerebrovascular amyloid in Alzheimer′s disease are antigenically related〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1985；82(24)：8729-32.

3Barton AJ，Harrison PJ，Najlerahim A，etal.Increased tau messenger RNA in Alzheimer′s disease hippocampus〔J〕.Am J Pathol，1990；137(3)：497-502.

4莊麗英，張志珺.神經(jīng)炎癥與阿爾茨海默病〔J〕.中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2012；21(7)：664-5.

5陳 祥，鐘 翎.阿爾茨海默病中β淀粉樣蛋白神經(jīng)毒性作用研究進(jìn)展〔J〕.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2008；34(5)：315-7.

6Fu HJ，Liu B，F(xiàn)rost JL，etal.Amyloid-beta immunotherapy for Alzheimer′s disease〔J〕.CNS Neurol Disord Drug Targets,2010；9(2)：197-206.

7李慧源，董玉霞，姜 源，等.小膠質(zhì)細(xì)胞與阿爾茨海默病炎性反應(yīng)的相關(guān)研究〔J〕.中國臨床研究，2015；28(1)：129-30，133.

8朱飛奇，錢采韻.神經(jīng)炎癥與阿爾茨海默病的迷茫與前景〔J〕.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2009；35(1)：50-2.

9官 杰，李 浩，劉劍剛，等.炎癥反應(yīng)及抗炎藥物與阿爾茨海默病的研究進(jìn)展〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2012；11(12)：1282-5.

10Krabbe G，Halle A，Matyash V，etal.Functional impairment of microglia coincides with Beta-amyloid deposition in mice with Alzheimer-like pathology〔J〕.PLoS One，2013；8(4)：e60921.

11Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease：progress and problems on the road to therapeutics〔J〕.Science，2002；297(5580)：353-6.

12Pan YF，Chen XR，Wu MN，etal.Arginine vasopressin prevents against amyloid beta(25-35) induced impairment of spatial learning and memory in rats〔J〕.Horm Behav，2010；57(4/5)：448-54.

13汪保華，袁 華，呂志華，等.靈芝多糖對模擬AD學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠海馬白細(xì)胞介素-6表達(dá)的影響〔J〕.卒中與神經(jīng)疾病，2007；14(4)：206-13.

14宋春未，戴雪伶，姜招峰，等.阿爾茨海默病實驗動物模型研究進(jìn)展〔J〕.生物學(xué)雜志，2013；30(5)：85-8.

15Lee CY，Tse W，Smith JD.Apolipoprotein E promotes Aβ trafficking and degradation by modulating microglial cholesterol levels〔J〕.J Biol Chem，2012；287(3)：2032-44.

16Kauppinen TM，Suh SW，Higashi Y，etal.Poly(ADP-ribose) polymerase-1 modulates microglial responses to amyloid beta〔J〕.J Neuroinflammation，2011；8(1)：152.

17朱飛奇，何國厚，梁志堅.小檗堿對阿爾茨海默病大鼠模型小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2009；8(9)：902-6.

18李 瑋，索愛琴，張杰文，等.β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性上清液對神經(jīng)元凋亡的影響〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2011；91(3)：203-6.

19黃 月，任秀花，張善峰，等.不同劑量移植小膠質(zhì)細(xì)胞對阿爾茨海默病大鼠腦內(nèi)β淀粉樣蛋白的作用〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2011；91(33)：2353-7.

〔2016-09-09修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R363.2

A

1005-9202(2017)18-4446-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.007

河北省教育廳重點資助課題(No.ZD20131051)；河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室建設(shè)項目(No.20142803)；河北省高校重點學(xué)科資助項目(No.20130337)

1 承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院

王瑞婷(1969-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事阿爾茨海默病發(fā)病機制及中藥抗癡呆作用研究。

狄婷婷(1981-)，女，碩士，副教授，主要從事阿爾茨海默病發(fā)病機制研究。