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阿格列汀對糖尿病大鼠腎臟病理改變的影響

2017-09-27 11:43劉玉勝張光昊張行謙鹿慶華
中國老年學(xué)雜志 2017年18期
關(guān)鍵詞:阿格列汀沖洗

鄭 杰 劉玉勝 張光昊 張行謙 高 敏 鹿慶華

(山東大學(xué)第二醫(yī)院,山東 濟南 250033)

阿格列汀對糖尿病大鼠腎臟病理改變的影響

鄭 杰 劉玉勝 張光昊 張行謙 高 敏 鹿慶華

(山東大學(xué)第二醫(yī)院,山東 濟南 250033)

目的探討糖尿病(DM)大鼠腎病中腎臟病理改變、細(xì)胞凋亡的機制及阿格列汀對細(xì)胞凋亡的影響。方法8周齡雄性Wistar大鼠50只,隨機分為對照組(n=10),DM組(n=20),阿格列汀組(n=20)。各組正常飲食,腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素構(gòu)建糖尿病模型。模型穩(wěn)定后,給予對照組、糖尿病組生理鹽水灌胃,阿格列汀組以一定劑量阿格列汀研缽磨碎后生理鹽水稀釋灌胃。于21 w末監(jiān)測血糖、血肌酐、尿素氮等生化指標(biāo),21 w末處死大鼠后蘇木素-伊紅(HE)染色、PAS染色、Masson染色等病理檢測腎功能及損傷情況;免疫組化、Western印跡檢測腎組織受體相互作用蛋白(RIP)3、Caspase-3、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)的表達情況。結(jié)果與對照組相比,糖尿病組系膜細(xì)胞基底膜增厚,細(xì)胞外基質(zhì)堆積,RIP3、Caspase-3、PARP表達增多,阿格列汀組腎臟病理損傷較輕,相應(yīng)表達減少,但比對照組稍多,Western印跡結(jié)果阿格列汀組相對對照組變化不大。結(jié)論阿格列汀可能通過改善細(xì)胞凋亡通路中的死亡受體通路中的RIP3的表達改善腎臟細(xì)胞的凋亡程度,延緩腎臟病理損傷的進展。

阿格列?。惶悄虿∧I?。患?xì)胞凋亡;受體相互作用蛋白3;聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶

在糖尿病(DM)血管病變并發(fā)癥中,腎病導(dǎo)致心腦血管病變的發(fā)生、發(fā)展是引起終末期腎衰竭的主要原因之一〔1〕。糖尿病腎病(DN)的發(fā)生、發(fā)展是一個慢性而又復(fù)雜的過程。已有研究證實高糖誘導(dǎo)引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞凋亡〔2〕。目前認(rèn)為有3條通路參與凋亡的發(fā)生:線粒體通路,死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路〔3〕。其中,受體相互作用蛋白(RIP)3具有自磷酸化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和(或)壞死及激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的作用,是參與腫瘤壞死因子(TNF)-α介導(dǎo)的死亡受體凋亡通路的信號分子〔4〕。本實驗探討RIP3是否在腎臟細(xì)胞凋亡通路中起作用及阿格列汀能否改善DN腎臟病理損傷及細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1動物及分組 8周齡清潔級雄性Wistar大鼠50只,體重200 g,購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,隨機選10只作為對照組,DM組和阿格列汀組各20只,腹腔注射檸檬酸緩沖液溶解的鏈脲佐菌素(STZ,濃度2%)65 mg/kg構(gòu)建DM模型。第3天測血糖(測血糖前需禁食12 h),1 w后再測,隨機血糖>16.7 mmol/L視為造模成功,實驗過程中DM各組不符合標(biāo)準(zhǔn)者予以剔除。待模型穩(wěn)定后,給予對照組、DM組生理鹽水灌胃,阿格列汀組以一定劑量阿格列汀研缽磨碎后生理鹽水稀釋灌胃,21 w末稱重,處死動物取材。

1.2標(biāo)本收集與處理 各組大鼠于21 w末于尾靜脈取血測血糖、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。血糖由血糖測量儀、血糖試紙檢測。各組大鼠于第21周末處死提前1 d以代謝籠收取24 h尿液標(biāo)本,加入甲苯防腐,記錄尿量,同時離心后取上清液置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?,用于測定尿微量白蛋白。血、尿生化指標(biāo)均由全自動生化分析儀測定。

1.3腎臟病理學(xué)觀察 各組大鼠于21 w末腹腔注射水合氯醛(3 ml/kg)麻醉,取出雙腎,剝?nèi)ツI包膜,稱取腎臟重量,并記錄,計算腎臟肥大指數(shù)(腎重/體重),同時一部分腎臟放入4%多聚甲醛中以備制作石蠟切片,一部分投入液氮中12 h,然后置于-80℃冰箱中,以備Western印跡實驗。將標(biāo)本從多聚甲醛中取出,流水沖洗3~4 h后脫水,石蠟包埋,用石蠟切片機切成4 μm的切片。

1.3.1HE染色 石蠟切片烤片30 min左右→脫蠟至水(二甲苯Ⅰ、Ⅱ,梯度酒精浸泡)→蘇木素染色2~3 min→蒸餾水沖洗一下→鹽酸酒精分化5 s→流水沖洗5 min→伊紅染色2~3 min→流水沖洗5 min→脫水透明→中性樹膠封片,顯微鏡觀察。

1.3.2PAS染色 石蠟切片烤片30 min左右→脫蠟至水→0.5%過碘酸溶液氧化10 min→蒸餾水充分洗滌5 min,3次→Schiff試劑染色40 min左右→亞硫酸沖洗液處理切片3次,每次2 min→流水沖洗10 min→蘇木素染核2~3 min→蒸餾水沖洗一下后鹽酸酒精分化5 s→流水沖洗5 min→脫水透明→中性樹膠封片。

1.3.3Masson染色 石蠟切片烤片約30 min→脫蠟至水→Masson復(fù)合染色液染色5 min→0.2%醋酸溶液清洗2次,每次1 min→5%磷鎢酸3 min→0.2%醋酸溶液清洗2次,每次1 min→亮綠染色30 s,0.2%醋酸水洗2次→脫水透明→中性樹膠封片。

1.3.4天狼星紅染色 石蠟切片烤片30 min左右→脫蠟至水→天狼星紅飽和苦味酸液染1 h左右→流水沖洗10 min→脫水透明→中性樹膠封片,偏振光顯微鏡觀察。

1.4免疫組化法檢測腎組織受體相互作用蛋白(RIP)3、Caspase-3及聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶蛋白(PARP)表達 烤片30 min左右→脫蠟至水→EDTA抗原修復(fù),高火2 min 40 s,低火15 min→自然冷卻約1 h→磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,每次3 min→3%H2O2室溫孵育15 min→PBS洗3次,各3 min→5%牛血清白蛋白(BSA)封閉,20 min→滴加適當(dāng)稀釋的一抗,4℃過夜(12~16 h)→37℃復(fù)溫,45 min→PBS洗3次,各3 min→滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG,37℃40 min→PBS洗3次,各3 min→DAB顯色,鏡下控制顯色時間,直至出現(xiàn)棕黃色顆粒→流水沖洗→蘇木素復(fù)染核2~3 min,沖洗之后鹽酸酒精分化5 s,流水沖洗10 min→脫水透明→中性樹膠封片,顯微鏡觀察。

1.5Western印跡檢測腎組織RIP3、Caspase-3、PARP表達 取-80℃凍存的腎臟組織剪碎、研磨提取蛋白→BCA法測蛋白濃度→配膠、上樣→電泳80 mV 2 h左右→切膠、轉(zhuǎn)膜200 mV 2 h左右→牛奶封閉1 h→1×TBST洗膜3次,每次5 min→敷一抗(1∶1 000),4℃過夜(16 h)→1×TBST洗膜3次,每次15 min→敷生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG 2 h→1×TBST洗膜3次,每次15 min→ECL顯色,ImageJ軟件對條帶進行分析,計算灰度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件行方差分析及t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 注射STZ后,DM組血糖明顯升高,開始出現(xiàn)多飲、多食、多尿的癥狀,體重明顯減輕,精神狀態(tài)較差,阿格列汀組較DM組情況有所改善。

2.2各組大鼠腎臟組織病理改變 DM組腎臟肥大指數(shù)較對照組明顯增大(P<0.01),阿格列汀組較DM組明顯改善(P<0.01)。DM組HE染色與PAS染色同對照組相比,基底膜增厚,系膜基質(zhì)增多,細(xì)胞外基質(zhì)沉積,腎小球體積增大,血管壁玻璃樣變性、腎小管細(xì)胞空泡樣變性、紋理變亂等?;啄ひ约跋的さ母淖冊赑AS染色中較為明顯。阿格列汀組病理損傷較DM組輕。Masson染色以及天狼星紅染色與對照組相比,Ⅰ型膠原(紅色)、Ⅳ膠原(淡黃色)表達量增多,膠原纖維排列紊亂、分布不均,主要集中在腎小球系膜區(qū),腎小管基底膜,阿格列汀組與DM組相比膠原表達量下降。見圖1。

2.3各組大鼠生化指標(biāo)檢測 與對照組相比,DM組造模成功后血糖持續(xù)在11.1 mmol/L以上,有顯著差異(P<0.01),Scr、BUN隨著飼養(yǎng)時間的延長,與對照組相比逐漸增加(P<0.01),尿白蛋白排泄率(UAER)于12 w末與對照組相比含量明顯增高(P<0.01),阿格列汀組與DM組相比各指標(biāo)明顯改善(P<0.01),見表1。

圖1 各組大鼠腎臟病理學(xué)改變(×200)

組別體重(g)腎重(g)肥大指數(shù)(‰)血糖(mmol/L)BUN(mmol/L)Scr(μmol/L)UAER(μg/min)對照組363.64±8.391.37±0.024.33±0.105.54±0.146.65±0.1855.8±1.393.76±0.07DM組204.94±7.681)1.64±0.011)8.00±0.301)24.79±1.441)15.89±1.051)88.38±0.951)22.99±1.301)阿格列汀組243.27±6.361)2)1.54±0.021)2)6.37±0.191)2)20.66±0.421)2)12.21±0.841)2)73.93±0.871)2)15.31±0.751)2)

與對照組比較:1)P<0.01;與DM組比較:2)P<0.01

2.4免疫組化檢測各組腎組織RIP3、Caspase-3、PARP表達 RIP3主要在胞質(zhì)中表達,DM組表達量較對照組明顯增多,主要集中在腎小管,阿格列汀組表達量下降(P<0.05),Caspase-3在胞質(zhì)、胞核中均有表達,DM組表達量較對照組明顯增加,主要集中在腎小管,腎小球中也可見部分棕黃色顆粒,阿格列汀組表達量相對DM組表達量顯著減少(P<0.05)。PARP主要在胞核中表達,DM組較對照組增多,在腎小管、腎小球均有表達,腎小管周圍頗多,阿格列汀組明顯下降(P<0.05),見圖2,表2。

圖2 免疫組化檢測各組大鼠腎組織RIP3、Caspase-3、PARP表達(DAB,×200)

組別RIP3Caspase-3PARP對照組285.57±7.083256.30±61.56861.99±72.60DM組8892.59±387.031)9873.69±133.741)8626.17±273.561)阿格列汀組4125.23±320.442)4853.77±131.662)2805.53±157.442)

與對照組比較:1)P<0.05;與DM組比較:2)P<0.05,下表同

2.5Western印跡檢測各組大鼠腎組織RIP3、Caspase-3、PARP表達 與對照組相比,DM組RIP3、Caspase-3、PARP表達量明顯升高,而阿格列汀組較DM組表達量減少(P<0.05),但與對照組相比無明顯改變(P>0.05)。見圖3,表3。

1~3:對照組、DM組、阿格列汀組圖3 Western印跡檢測各組大鼠腎組織RIP3、Caspase-3、PARP表達

組別RIP3/β-actinCaspase3/β-actinPARP/β-actin對照組1.40±0.102.22±0.111.12±0.07DM組1.80±0.071)2.67±0.161)1.73±0.071)阿格列汀組1.61±0.092)2.32±0.112)1.29±0.112)

3 討 論

DN的發(fā)病是慢性且復(fù)雜的過程,最終引起腎小球肥大,腎小球基底膜增厚,膠原沉積,隨著腎臟功能的逐漸失調(diào),腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化加重〔5,6〕。細(xì)胞凋亡在DN的發(fā)展過程中起著重要作用,高糖狀態(tài)下,促使細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因素如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等使得凋亡的強度大于細(xì)胞增生的速率,導(dǎo)致組織細(xì)胞數(shù)量減少,系統(tǒng)功能失調(diào)〔7,8〕。RIP3作為一類重要調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡或存活的信號分子,廣泛表達于胚胎和大量成熟組織〔9〕,在TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中,TNF-α受體(TNFR)1與TNF-α受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域TRADD募集,經(jīng)過一系列反應(yīng),RIP3被募集到TNFR1復(fù)合物1〔10〕,表現(xiàn)出促凋亡的活性。過量表達RIP3會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,也會引發(fā)TNF-α誘導(dǎo)的Caspase依賴的細(xì)胞凋亡〔11〕,可能會引發(fā)腎小管上皮細(xì)胞過度凋亡。Caspase-3作為執(zhí)行細(xì)胞凋亡的終末剪切酶,將底物多聚聚合酶PARP剪切成31 kD和85 kD兩個片段,引起DNA損傷,DNA修復(fù)功能喪失,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔12〕。本實驗通過免疫組化、Western印跡檢測RIP3、Caspase-3、PARP三個指標(biāo)的表達情況,從細(xì)胞凋亡的水平發(fā)現(xiàn)DM組這三個指標(biāo)表達均增加,與細(xì)胞凋亡通路分子水平變化相一致。DPP-Ⅳ抑制劑比如西格列汀、阿格列汀等,作為治療糖尿病的新型藥物,在不引起低血糖的狀態(tài)下可以減緩腸促胰島素效應(yīng)降低的速率〔13〕。一些研究報告指出阿格列汀,作為DPP-Ⅳ抑制劑,對一些組織具有保護作用,比如心臟、腎臟、胰腺、視網(wǎng)膜等〔14〕。阿格列汀通過抑制二肽基肽酶-Ⅳ的活性延長胰高血糖素樣肽(GLP)-1的降解時間,可以糾正糖代謝紊亂,防止腎臟損傷〔15〕。由于GLP-1在血液中易被DPP-Ⅳ在數(shù)分鐘內(nèi)降解,DPP-Ⅳ抑制劑如阿格列汀可以延緩二肽基肽酶Ⅳ降解的時間,增強GLP-1生物學(xué)活性,降低血糖〔16〕。已有研究證明在膽管細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞,GLP-1通過改善Bcl-2家族蛋白水平的表達水平減輕細(xì)胞凋亡率〔17〕,但是并沒有確切的證據(jù)表明阿格列汀是否能夠從細(xì)胞凋亡的水平改善腎臟損傷。本實驗通過研究發(fā)現(xiàn),藥物干預(yù)后的老鼠血糖水平降低,通過觀察病理改變腎臟組織病理損傷也相應(yīng)減輕,系膜區(qū)膠原沉積減少,細(xì)胞外基質(zhì)堆積減少等,與文獻研究報道相一致〔18〕,通過阿格列汀的藥物干預(yù),腎臟細(xì)胞凋亡的程度有所減輕,改善腎臟損害的進行性損傷。

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〔2016-04-03修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R589

A

1005-9202(2017)18-4437-04;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.004

山東省科技發(fā)展計劃項目(No.2013G0021813);山東省中醫(yī)藥管理局(No.2011-029);濟南市高校自主創(chuàng)新計劃(No.201401218);中國心血管醫(yī)師研究基金(2014)

鄭 杰(1989-),女,碩士,醫(yī)師,主要從事心血管疾病基礎(chǔ)及臨床研究。

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