劉 億, 趙海梅, 岳海洋,劉雪珂, 劉端勇,黃小英,鹿秀云

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江西 南昌 330004； 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004； 3.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院，江西 南昌 330004； 4.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004)

·實(shí)驗(yàn)研究·

黃芪多糖對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜IL-12 p40、IL-12 p70、IL-15和IL-21表達(dá)的影響*

劉 億1, 趙海梅2, 岳海洋1,劉雪珂1, 劉端勇3,黃小英4,鹿秀云3

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江西 南昌 330004； 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004； 3.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院，江西 南昌 330004； 4.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004)

目的：探討黃芪多糖對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜白介素(interleukin, IL)-12p40 (IL-12p40)、IL-12p70、IL-21和IL-15表達(dá)的影響。方法：將40只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、黃芪多糖組和美沙拉嗪組4組，每組10只。采用三硝基苯磺酸/乙醇法復(fù)制結(jié)腸炎小鼠模型。黃芪多糖組予以200 μg/g APS混懸液灌胃，美沙拉嗪組給予150 μg/g美沙拉嗪混懸液灌胃，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組給予等容積的生理鹽水灌胃，1 d 1次，連續(xù)給藥7 d。第8天，處死小鼠，分離結(jié)腸。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)結(jié)腸組織勻漿中IL-12p40、IL-12p70、IL-21和IL-15的表達(dá)水平。結(jié)果:與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜IL-12p40、IL-12p70、IL-15和IL-21表達(dá)水平均升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，黃芪多糖組小鼠結(jié)腸黏膜IL-12p40、IL-12p70、IL-15和IL-21表達(dá)水平均下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論:黃芪多糖可有效抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜IL-12p40、IL-12p70、IL-15和IL-21的表達(dá)。

結(jié)腸炎；黃芪多糖/藥效學(xué)； IL-12； IL-21； IL-15；動(dòng)物；小鼠

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是被WHO認(rèn)定的世界性難治病之一，是以結(jié)腸黏膜及黏膜下層炎癥為特征的慢性腸道疾患。UC的發(fā)病機(jī)制并不清楚，免疫狀態(tài)紊亂在其發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，這些免疫性因素主要包括炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子及免疫調(diào)節(jié)等，其中以白介素(interleukin, IL)為主體的細(xì)胞因子失衡起了關(guān)鍵性作用。IL-12、IL-15和IL-21等在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性并相互作用扮演了重要角色[1-2]。黃芪多糖(astragalus polysaccharides, APS)是黃芪的主要活性成分之一,可作為免疫促進(jìn)劑和調(diào)節(jié)劑，可有效治療實(shí)驗(yàn)性小鼠UC[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定APS對(duì)UC小鼠結(jié)腸黏膜中IL-12p40、IL-12p70、IL-21和IL-15表達(dá)的影響探究其治療實(shí)驗(yàn)性小鼠UC可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

清潔級(jí)健康 C57BL/6小鼠40只，雄性，體質(zhì)量(20 ± 2) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)SCXK(京)2007- 0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

APS，純度 98%，陜西森弗生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)HQ090312；美沙拉嗪，佳木斯鹿靈制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)130407；TNBS，Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào) 2508- 19。IL-12 p40 ELISA試劑盒，Pierce公司產(chǎn)品，批號(hào)EMIL12P40；IL-12 p70 ELISA試劑盒(批號(hào)BMS6004)、IL-21 ELISA試劑盒(批號(hào)BMS6021)、IL-15 ELISA試劑盒(批號(hào)BMS6023)，均為eBioscience公司產(chǎn)品。5424R型低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；MR-96T型Anthos 2010型酶標(biāo)儀，上海博賽斯科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組

將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、黃芪多糖組和美沙拉嗪組4組，每組10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.4 模型的建立

參照文獻(xiàn)[5]，采用三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS) /乙醇法復(fù)制UC小鼠模型。造模前禁食12 h，除正常對(duì)照組外，其余小鼠以10 g/L戊巴比妥鈉溶液(5 μL/g)肌肉注射麻醉；將100 μg/g體質(zhì)量TNBS溶入0.15 mL體積分?jǐn)?shù)為500 mL/L的乙醇溶液中，配制成TNBS/乙醇復(fù)合溶液；用塑料軟管(直徑約1 mm )將TNBS/乙醇復(fù)合液注入小鼠腸管距肛門(mén)約4 cm處，倒置小鼠5 min，使藥液完全被送入結(jié)腸部位。小鼠自然蘇醒后，將其放入鼠籠，給予水和食料。

1.5 給藥方法

自TNBS灌腸后第2天開(kāi)始，按體質(zhì)量換算，黃芪多糖組予以200 μg/g APS混懸液灌胃，美沙拉嗪組給予150 μg/g美沙拉嗪混懸液灌胃，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組給予等容積的生理鹽水灌胃。1 d 1次，連續(xù)給藥7 d。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

第8天，頸椎脫臼處死小鼠，解剖并分離結(jié)腸，沿縱軸剖開(kāi)，以PBS沖洗結(jié)腸內(nèi)容物，取部分結(jié)腸，加適量10倍PBS制備組織勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清-80 ℃保存用于檢測(cè)。檢測(cè)嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行，并采用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm檢測(cè)各自吸光值，計(jì)算小鼠結(jié)腸組織勻漿中IL-12p40、IL-12p70、IL-21和IL-15水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜IL-12p40、IL-12p70、IL-21和IL-15表達(dá)水平升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，黃芪多糖組小鼠結(jié)腸黏膜IL-12p40、IL-12p70、IL-21和IL-15表達(dá)水平下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠結(jié)腸黏膜IL-12 p40、IL-12 p70、IL-21和IL-15對(duì)比

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，**P<0.01；與模型對(duì)照組對(duì)比，，##P<0.01。

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎是典型的腸道非特異性炎性疾病，以大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)和持續(xù)活化為主要特征。促炎因子和抑炎因子失衡在UC病理?yè)p傷過(guò)程扮演了重要角色，IL-12、IL-15和IL-21是比較突出的細(xì)胞因子。作為一種促炎因子，IL-12和IFN-γ相互作用，參與UC的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸，主要有p40亞基和p35亞基，二者均通過(guò)二硫鍵互相連接形成p70，才具有相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)和促炎等生物活性。IL-12活化后能促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞活化，分化，產(chǎn)生細(xì)胞因子，并作為趨化因子趨化上述細(xì)胞至患病局部;同時(shí)產(chǎn)生過(guò)量的基質(zhì)降解酶，從而破壞結(jié)腸黏膜的完整性，最終導(dǎo)致結(jié)腸黏膜的炎性損傷；而中和或降低IL-12表達(dá)則可明顯減輕UC[6-8]。IL-21和IL-15具有高度同源性，同屬于I型細(xì)胞因子超家族，由活化的Th2細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞及(DC)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌。IL-21與其受體結(jié)合，通過(guò)活化JAKs-STATs 信號(hào)通路，升高STAT3在結(jié)腸胞膜上的表達(dá)，在刺激T細(xì)胞等增殖分化(如分化成Th17細(xì)胞)的同時(shí)，促進(jìn)IL-17分泌，或刺激NK細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ，進(jìn)而造成腸道炎性損傷；且基因多態(tài)性分析也表明IL-21和炎癥性腸病的發(fā)展相關(guān)[9-11]。大量的研究[12-13]證明：IL-15是一種具有多效性的重要促炎因子，在促進(jìn)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)和NK細(xì)胞的增生和活化的同時(shí)，提升IFN-γ、TNF-α 表達(dá)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)；同時(shí)可通過(guò)活化JAKs-STATs 信號(hào)通路激活樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞，抑制Th2細(xì)胞增殖分化，造成免疫功能紊亂，從而介導(dǎo)免疫損傷。在本實(shí)驗(yàn)中，UC模型小鼠結(jié)腸黏膜中IL-12、IL-15和IL-21的水平均明顯升高，提示：在TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎發(fā)生過(guò)程中，此3者表達(dá)水平升高是其發(fā)病的重要特征之一；IL-12P40不僅總量升高，還聚合成IL-12P70而產(chǎn)生促進(jìn)免疫細(xì)胞活化及分泌細(xì)胞因子等生物活性。同時(shí)，IL-15和IL-21水平升高，可能通過(guò)JAK/STAT信號(hào)進(jìn)一步誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化，導(dǎo)致免疫反應(yīng)過(guò)度興奮，促炎因子大量產(chǎn)生，促發(fā)炎性免疫損傷的形成。本實(shí)驗(yàn)中，黃芪多糖連續(xù)給藥7 d后，IL-12P40、IL-12P70、IL-15和IL-21的表達(dá)水平明顯被抑制，結(jié)合筆者前期實(shí)驗(yàn)[14]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖有效治療TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Treg/Th17間平衡及其相關(guān)細(xì)胞因子水平實(shí)現(xiàn)的。因此得出：黃芪多糖有效治療TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎可能與其抑制IL-12 P40、IL-12 P70、IL-15和IL-21的表達(dá)相關(guān)，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的免疫狀態(tài)，恢復(fù)免疫平衡。分析中筆者發(fā)現(xiàn)：這幾個(gè)細(xì)胞因子均與JAK/STAT信號(hào)直接或間接相關(guān)，但黃芪多糖能否通過(guò)抑制這些細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)控JAK/STAT信號(hào)的活化程度不得而知，今后的工作可以以黃芪多糖能否調(diào)控JAK/STAT信號(hào)干預(yù)相關(guān)免疫細(xì)胞的活化水平從而治療UC為研究目標(biāo)展開(kāi)，此對(duì)于明確從調(diào)控免疫狀態(tài)的信號(hào)通路和作用靶點(diǎn)的角度揭示黃芪多糖治療UC的作用機(jī)制具有重要而現(xiàn)實(shí)的意義。

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1001-6910(2017)09-0058-03

R574.62

:B

2017-06-13；

2017-07-26

(編輯 陶 珠)

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.09.25

鹿秀云，講師、主治醫(yī)師，luxiuyun139@163.com

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(GJJ151562)、江西省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016B010)、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81460679)、江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃(2012A017)