陳夢(mèng)娟

周紅麗2

蔣立文2

鄧青青1

朱韻奕1

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

一株產(chǎn)乙醇細(xì)菌的分離篩選與鑒定

陳夢(mèng)娟1

周紅麗2

蔣立文2

鄧青青1

朱韻奕1

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

以湖南省盛產(chǎn)的4種刺葡萄為原料，經(jīng)過(guò)分離篩選與鑒定，從米刺葡萄表面獲得編號(hào)為MUY3的一株產(chǎn)乙醇的細(xì)菌。MUY3在28 ℃發(fā)酵48 h后，其發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)可達(dá)到10.67%。通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)、同化試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、耐高滲透壓試驗(yàn)等對(duì)其生理生化特征進(jìn)行研究。同時(shí)采用16S rDNA序列鑒定及進(jìn)化樹(shù)分析對(duì)該細(xì)菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，MUY3與Enterobacterxiangfangensis strain 10-17最為接近，相似度達(dá)100%，所以該菌種為Enterobacterxiangfangensis strain 10-17。

刺葡萄；乙醇；16S rDNA；Enterobacterxiangfangensis strain 10-17；生理生化特征

隨著中國(guó)人均GDP的不斷增長(zhǎng)以及中西方文化的深入交流，葡萄酒文化越來(lái)越受到國(guó)人的重視，中國(guó)的葡萄酒產(chǎn)業(yè)取得了長(zhǎng)足發(fā)展[1]，葡萄酒的年均消費(fèi)量也在不斷的增加[2]。近幾十年，許多葡萄酒生產(chǎn)商采用國(guó)外進(jìn)口酵母進(jìn)行純種發(fā)酵，以提高生產(chǎn)效率并且使釀造過(guò)程便于控制，保證安全高效生產(chǎn)[3]，但這也導(dǎo)致葡萄酒生產(chǎn)出現(xiàn)較為嚴(yán)重的“同質(zhì)化”現(xiàn)象[4]，對(duì)中國(guó)的葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來(lái)沖擊。因此，為了釀造出風(fēng)格獨(dú)特又具有典型性[5]的葡萄酒已經(jīng)成為了一個(gè)世界性的課題。

刺葡萄在湖南鳳凰、吉首等地已有較大的種植基地，果實(shí)產(chǎn)量較高，品質(zhì)優(yōu)良并含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[6-7]，是釀造葡萄酒的優(yōu)質(zhì)原料。用刺葡萄釀制的葡萄酒，顏色深紅艷麗，并且風(fēng)味品質(zhì)極佳[8]。目前，刺葡萄酒的釀造中多采用已有活性干酵母[9]進(jìn)行純種發(fā)酵，雖然提高了產(chǎn)品的穩(wěn)定性和可預(yù)測(cè)性[10]，但產(chǎn)品缺乏特色。本研究擬從成熟葡萄果實(shí)的果皮和果肉[11]、葡萄酒的自然發(fā)酵醪[12]、葡萄種植園的土壤[13-14]等相關(guān)環(huán)境中篩選適合本土葡萄釀造的葡萄酒釀造菌種，為刺葡萄酒釀造做好菌種儲(chǔ)備。目前已有學(xué)者[15]從上述環(huán)境中分離得到酵母菌并應(yīng)用于葡萄酒的釀造中，然而從葡萄果皮上篩選具有優(yōu)良發(fā)酵性能的細(xì)菌菌種則暫未有報(bào)道。

本研究從湖南懷化刺葡萄的表面分離得到的一株產(chǎn)乙醇能力較強(qiáng)的細(xì)菌，通過(guò)對(duì)該細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定及碳源同化、氮源同化、耐高滲透壓試驗(yàn)[16]等生理生化研究，以期將其運(yùn)用于葡萄酒釀造領(lǐng)域中。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

刺葡萄：米刺葡萄，湖南省懷化市；

氯化鈉、無(wú)水乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1) TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)上層培養(yǎng)基：胰蛋白胨17.0 g，大豆胨3.0 g，葡萄糖6.0 g，氯化鈉2.5 g，硫代硫酸鈉0.5 g，瓊脂15 g，L-鹽酸胱氨酸0.25 g，維生素K 1 g，亞硫酸鈉0.1 g，TTC 0.5 g，蒸餾水1 000 mL。

(2) TTC底層培養(yǎng)基(即PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯浸出粉300 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 000 mL，最終pH為(6.0±0.2)。

(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

(4) 12.5%豆芽汁培養(yǎng)基：稱(chēng)取125 g黃豆芽放入1 L水中，煮沸0.5 h后過(guò)濾，并補(bǔ)充蒸餾水至1 L，即成12.5%豆芽汁培養(yǎng)基，在121 ℃滅菌20 min。

(5) 無(wú)氮培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀0.2 g，七水合硫酸鎂0.2 g，二水合硫酸鈣0.2 g，瓊脂20 g，碳酸鈣0.2 g，蒸餾水1 000 mL。

(6) 緩沖葡萄糖蛋白水：磷酸二氫鉀5 g，多胨7 g，葡萄糖5 g，蒸餾水1 000 mL，矯正pH為7.0。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

分光光度計(jì)：722N型，上海菁華科技儀器有限公司；

電子天平：TP-620A型，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；

智能生化培養(yǎng)箱：LRH-250型，上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

低溫高速離心機(jī)：Centrifuge 5424R型，德國(guó)Eppendorf公司；

數(shù)顯三用恒溫水箱：HH-420型，上海浦東物理光學(xué)儀器廠(chǎng)；

PCR儀：T100型，美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 菌種分離與篩選

1.2.1 分離培養(yǎng) 取25 g新鮮成熟的米刺葡萄果實(shí)放入225 mL的已滅菌生理鹽水中，在24 ℃ 40 KHz的超聲清洗器中超聲2 min制成混濁液。經(jīng)過(guò)梯度稀釋后，選取適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)取100 μL均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，于(28±1) ℃倒置培養(yǎng)2～3 d。挑取具有典型特征的菌落進(jìn)行染色鏡檢，并進(jìn)行平板反復(fù)劃線(xiàn)純化后，將其接到斜面培養(yǎng)基上于4 ℃保藏備用。

1.2.2 TTC平板初篩 TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)是一種顯色劑，當(dāng)TTC接受細(xì)菌脫氫酶作用而釋放出游離氫后會(huì)產(chǎn)生顯色反應(yīng)使菌落顯出紅色，此過(guò)程中釋放的氫越多，紅色越深，反之，則紅色越淺[17-18]。

將斜面培養(yǎng)基上保藏的菌株接入TTC底層培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)48 h，待菌落充分長(zhǎng)成后，倒入一層較薄的TTC上層培養(yǎng)基將底層培養(yǎng)基完全覆蓋，然后在(28±1) ℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取顏色較深的菌落將其保藏備用。

1.2.3 搖瓶復(fù)篩 將TTC平板初篩得到的菌株分別接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，在(28±1) ℃條件下發(fā)酵48 h后，測(cè)定發(fā)酵液中是否有乙醇產(chǎn)生，及發(fā)酵液中乙醇的含量，挑選出乙醇產(chǎn)量高的菌株做進(jìn)一步的鑒定。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.3 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制

首先將低溫保藏的菌種接入100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，(28±1) ℃恒溫培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化。然后按照5%的接種量接入到裝有300 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于(28±1) ℃培養(yǎng)，每2 h取一次樣，用可見(jiàn)光光度計(jì)測(cè)定OD600值，根據(jù)測(cè)定得到的光密度值繪制該菌種的生長(zhǎng)曲線(xiàn)[19]。

1.4 菌種的鑒定

使用TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取待測(cè)菌株的DNA，對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rDNA，通用引物為(27-F: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492-R: TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。PCR反應(yīng)體系為50 μL(DNA模板2 μL、上下游引物各為1 μL、緩沖液5 μL、dNTPs 4 μL、Tap酶0.25 μL、MgCl24 μL、ddH2O 32.75 μL)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序得到的基因序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，從中選取同源性高的菌株，再使用MEGA 7.0軟件，NJ方法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 生理生化鑒定

1.5.1 碳源同化試驗(yàn) 采用的碳源有：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、鼠李糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、檸檬酸、可溶性淀粉、甘露醇、纖維二糖、山梨醇、棉子糖。將12.5%的豆芽汁培養(yǎng)基進(jìn)行分裝，每只試管中裝入10 mL培養(yǎng)基，并于121 ℃滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃時(shí)，加入10%的無(wú)菌糖溶液625 μL。然后將待測(cè)試菌種進(jìn)行活化后，按照5%的接種量接入到已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中，(28±1) ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察是否出現(xiàn)渾濁，如果培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁則為陽(yáng)性，反之則為陰性。以不含糖的試管為陰性對(duì)照管，每種碳源試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.5.2 氮源同化試驗(yàn) 采用的氮源有：L-賴(lài)氨酸、硝酸鉀、亞硝酸鈉、硝酸銨、天門(mén)冬素。在無(wú)氮培養(yǎng)基上分別加入以上氮源作為培養(yǎng)基的唯一氮源，加入量為0.078%，并于115 ℃滅菌20 min。按5%的接種量將已活化的菌種接入制備好的培養(yǎng)基中，于(28±1) ℃培養(yǎng)48 h。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，以不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。根據(jù)菌種在不同氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況，判斷氮源是否能夠被菌株同化。

1.5.3 甲基紅試驗(yàn) 挑取少量新鮮的待測(cè)試培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水中，于(28±1) ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，48 h后每24 h取培養(yǎng)液加入甲基紅試劑1～2滴，立即觀察現(xiàn)象。直至發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性或第5天仍為陰性即可判定結(jié)果。滴入指示劑，呈鮮紅色或橘紅色為陽(yáng)性；橘黃色或黃色為陰性。

1.5.4 耐乙醇試驗(yàn) 向帶有杜氏小管且已滅菌的培養(yǎng)基中添加乙醇，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，混勻后接入已活化好的菌種，(28±1) ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌體生長(zhǎng)情況和產(chǎn)氣情況。通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果縮小耐受限值范圍，并再進(jìn)行試驗(yàn)確定。

1.5.5 耐高滲透壓試驗(yàn) 將經(jīng)過(guò)隔夜活化的菌種劃線(xiàn)接種于葡萄糖濃度為25%，30%，35%，40%，45%的PDA培養(yǎng)基上，放置于(28±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周，進(jìn)行檢查。試驗(yàn)過(guò)程中需采取蠟紙封口等措施預(yù)防培養(yǎng)基干燥。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選

從米刺葡萄表面篩選出一株產(chǎn)乙醇能力較強(qiáng)的細(xì)菌，編號(hào)為MUY3，在(28±1) ℃的恒溫條件下靜置發(fā)酵48 h后，其發(fā)酵液中的乙醇濃度可達(dá)到10.67%。

2.2 MUY3的形態(tài)特征

MUY3在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，菌落呈規(guī)則的圓形，白色，表面光滑且凸起，直徑達(dá)1.5～2.0 mm，見(jiàn)圖1。經(jīng)過(guò)革蘭氏染色后在油鏡下觀察，細(xì)胞為直桿狀、無(wú)芽孢的革蘭氏陰性細(xì)菌，見(jiàn)圖2。圖3為MUY3在TTC平板上生長(zhǎng)48 h的菌落特征。

圖1 菌落形態(tài)

圖2 革蘭氏染色結(jié)果(1 000×)

圖3 TTC平板結(jié)果

2.3 MUY3的鑒定

采用細(xì)菌通用引物對(duì)MUY3的高度保守序列區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了大約1 500 bp的擴(kuò)增片段，其擴(kuò)增產(chǎn)物較純，見(jiàn)圖4。在NCBI上對(duì)比后選擇同源性較高的菌株并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖5。從進(jìn)化樹(shù)可知MUY3與Enterobacterxiangfangensis strain 10-17 的親緣關(guān)系最近，同源性可信度為100%。因此，MUY3可以初步判定為Enterobacterxiangfangensis strain 10-17。

圖4 MUY3 16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖5 菌株MUY3的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

由圖6可知，當(dāng)菌種接種入培養(yǎng)基8 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。如果在試驗(yàn)或生產(chǎn)中為獲得生理特性穩(wěn)定、代謝旺盛[20]的細(xì)菌則可活化10～18 h。

圖6 MUY3的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.5 生理生化試驗(yàn)

2.5.1 同化試驗(yàn) MUY3可以利用的碳源、氮源范圍較廣，并且該菌種利用葡萄糖和蔗糖作為碳源時(shí)，其發(fā)酵液中渾濁度和產(chǎn)氣量明顯高于其他碳源，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 碳源同化試驗(yàn)?

? “+”表示培養(yǎng)基中出現(xiàn)渾濁；“-”表示培養(yǎng)基中無(wú)渾濁。

表2 氮源同化試驗(yàn)?

? “+”表示培養(yǎng)基上有菌落長(zhǎng)成；“-”表示培養(yǎng)基上無(wú)菌落長(zhǎng)成。

2.5.2 甲基紅試驗(yàn) 培養(yǎng)48 h后，每24 h取培養(yǎng)液滴入少量甲基紅試劑觀察培養(yǎng)液顏色的變化。結(jié)果顯示，培養(yǎng)48，72，96 h時(shí)培養(yǎng)液為淡黃色，培養(yǎng)120 h時(shí)(即第5天)培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，記為MR試驗(yàn)為“-”，表明MUY3產(chǎn)酸能力較弱，見(jiàn)圖7。

圖7 甲基紅試驗(yàn)

2.5.3 耐乙醇試驗(yàn) 一般葡萄酒含乙醇的體積分?jǐn)?shù)在10%～15%[21]。由表3可知，MUY3對(duì)乙醇有較高的耐受性，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為10%～15%時(shí)，對(duì)該菌種的發(fā)酵無(wú)明顯影響，并且其最大耐受限度范圍為30%～35%。因此，使發(fā)酵液中的乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到30%，31%，32%，33%，34%，35%，以同樣的方法再進(jìn)行試驗(yàn)，得到結(jié)果見(jiàn)表4。所以得出菌種MUY3對(duì)乙醇的最大耐受限度為30%(體積分?jǐn)?shù))。

2.5.4 耐高滲透壓試驗(yàn) 本試驗(yàn)采用葡萄糖進(jìn)行培養(yǎng)基中糖濃度的調(diào)節(jié)，見(jiàn)表5，其耐滲透壓的極限值為40%，且在該濃度下MUY3存活率偏低。

3 結(jié)論

本研究從湖南懷化米刺葡萄表面篩選出一株能產(chǎn)乙醇的細(xì)菌，編號(hào)為MUY3，被初步鑒定為Enterobacterxiang-fangensis strain 10-17，并對(duì)其部分發(fā)酵特性進(jìn)行了研究。菌株MUY3能耐高滲透壓，具有較強(qiáng)的發(fā)酵性能，在28 ℃恒溫培養(yǎng)條件下發(fā)酵48 h后，其發(fā)酵液中產(chǎn)乙醇量為10.67%，而耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)可達(dá)到30%，并且該菌種能利用多種碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、鼠李糖、D-木糖、甘露醇、山梨醇、棉子糖)和氮源(L-賴(lài)氨酸、硝酸銨、天門(mén)冬素)。

表3 MUY3在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中的產(chǎn)氣情況?

? “-”表示不產(chǎn)氣；“+”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的1/5；“++”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的2/5；“+++”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的3/5；“++++”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的4/5；“+++++”表示氣體量充滿(mǎn)杜氏小管。

表4 MUY3的乙醇耐受限度?

? “-”表示不產(chǎn)氣；“+”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的1/5。

表5 高滲透壓試驗(yàn)?

? “-”表示無(wú)菌落長(zhǎng)成；“+”表示有菌落長(zhǎng)成。

目前菌種Enterobacterxiangfangensis strain 10-17的相關(guān)研究較少，暫時(shí)無(wú)法取代酵母菌在葡萄酒釀造中的應(yīng)用，主要的原因是無(wú)法確定發(fā)酵過(guò)程中有哪些副產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時(shí)也無(wú)法確定副產(chǎn)物對(duì)葡萄酒品質(zhì)是否有影響。為解決上述問(wèn)題，對(duì)Enterobacterxiangfangensis strain 10-17進(jìn)行菌種改良及發(fā)酵副產(chǎn)物的研究將成為今后科研工作者的研究方向。

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Isolation, screening and identification of an ethanol-producing bacterium

CHENMeng-juan1

ZHOUHong-li2

JIANGLi-wen2

DENGQing-qing1

ZHUYun-yi1

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China; 2.HunanKeyLaboratoryofFoodBiotechnology,Changsha,Hunan410128,China)

From four kinds ofVitisdavidii, widely planted in Hunan Province, an ethanol-producing bacterium named MUY3 was obtained from the surface of the rice grape by separation screening and identification. Its physiological and biochemical characteristics were investigated, including the cultivation of growth curve, assimilation test, methyl red test and high osmotic pressure test. Moreover, its 16S rDNA sequence was analyzed, and the phylogenetic tree analysis were used to identify this bacterium. The results showed that MUY3 was close toEnterobacterxiangfangensis and the similarity was 100%. Therefore, the strain was identified asEnterobacterxiangfangensis 10-17.

Vitisdavidii; ethanol; 16S rDNA;Enterobacterxiangfangensis strain 10-17; Physiological and biochemical characteristics

湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：14A072)

陳夢(mèng)娟，女，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

周紅麗(1972—)，女，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院教授，博士，碩士生導(dǎo)師。E-mail: xuanxuan310@126.com

2017—01—28

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.007