史得君

嚴 歡2

崔清美2

齊 欣2

黃 敏3

崔承弼1,2

(1. 長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；3. 四川省原子能研究院，四川 成都 610101)

人參莖葉提取物對I型糖尿病小鼠模型的影響

史得君1,2

嚴 歡2

崔清美2

齊 欣2

黃 敏3

崔承弼1,2

(1. 長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；3. 四川省原子能研究院，四川 成都 610101)

為研究人參莖葉提取物對I型糖尿病的影響，選取40只清潔級雄性昆明小鼠以劑量120 mg/kg·體重腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立I型糖尿病小鼠模型，試驗期間定時檢測小鼠體重及空腹血糖值，試驗20 d后眼球取血處理得血清，測定小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量并進行分析。結(jié)果顯示，一定劑量的人參莖葉提取物懸濁液有助于改善I型糖尿病小鼠的抗氧化能力，降低血清血脂水平，對緩解糖尿病并發(fā)癥有重要意義。

人參；糖尿?。谎?；總膽固醇；甘油三酯

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)作為一種慢性代謝疾病，其發(fā)生發(fā)展常常伴隨著多種與血液相關(guān)的并發(fā)癥,以及一定程度的神經(jīng)病變。目前為止,世界上尚未有迅速或徹底的治療手段，西醫(yī)常用的治療手段包括：① 外源增補胰島素或其類似物，以調(diào)節(jié)體內(nèi)胰島素穩(wěn)態(tài)，提高其有效性以緩解I型糖尿病胰島素絕對缺乏的狀況；② 口服雙胍類藥物(如鹽酸二甲雙胍等)以提高Ⅱ型糖尿病病患的血糖耐受性，減少肝糖原的糖異生，同時降低腸道對葡萄糖的吸收等。但眾所周知，西藥的應用均有較強的依賴性和副作用，所以亟需更天然的治療藥物，如人參等天然藥材。

人參(PanaxginsengC. A. Mey)為喜陰涼的多年生草本植物，其藥用部位主要為人參根和人參須，但伴隨現(xiàn)代科學醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)人參其他生長部位(即莖、葉、花、果等)也含有豐富的生理活性成分[1-4]，例如莖葉中含有多達60余種的皂苷類化合物和多種黃酮、有機酸及多糖等活性物質(zhì)[5-6]，張黎黎等[7]研究還發(fā)現(xiàn)人參莖葉皂苷的含量更豐富。且大量研究表明，人參莖葉皂苷還有降低血清脂質(zhì)含量[8]、抑制血清MDA升高的效用[9-10]以及很好的抗氧化作用[11-13]，Peter Giovannini等[14-16]發(fā)現(xiàn)人參對糖尿病有一定療效，人參皂苷在治療糖尿病方面具有顯著的作用。所以人參皂苷提取物越來越受到重視，且鑒于人參皂苷對人體血液平衡的優(yōu)良調(diào)節(jié)功效，其對糖尿病及其血液類并發(fā)癥的有效防治作用，關(guān)于人參皂苷的研究報道越來越多見于食品、醫(yī)學等研究領(lǐng)域，但與此同時，對于人參莖葉的皂苷提取物成分對糖尿病影響的研究卻少見報道，而已有的一些研究卻多數(shù)集中在對肥胖型II型糖尿病的影響上。

由于人參根部生長周期長，而其莖葉生長周期相對較短，且成本較低，故人參莖葉無疑是一種優(yōu)秀的皂苷等活性物質(zhì)資源。宋齊等[17-18]發(fā)現(xiàn)人參對糖尿病有一定療效，且人參皂苷作為人參的關(guān)鍵藥用活性成分之一，人參單體皂苷Rg3[10]、Rh4[19]、CK[20]等在糖尿病治療或其引起的與血液相關(guān)的(如動脈粥樣硬化等)并發(fā)癥方面都具有顯著的作用。為將人參莖葉皂苷提取物應用于降血糖方面提供了新的思路和理論基礎。

因此，本研究選用不同劑量的人參莖葉提取物對STZ干預下的Ⅰ型糖尿病小鼠模型進行灌胃試驗，研究其對于糖尿病小鼠血糖、血脂及抗氧化能力的改善能力及效果，有助于對人參莖葉的藥用價值有更多地認識，為人參莖葉皂苷提取物的利用、開發(fā)抗氧化及預防糖尿病的藥物與保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)條件

昆明種小鼠：CL級，雄性，40只，體重20～30 g。飼養(yǎng)條件：每小時6次定時換氣、定時照明(7:00～19:00)、溫度(24±2) ℃、相對濕度45%～65%；飼養(yǎng)地址：延邊大學吉林省朝鮮族公共食品研發(fā)中心動物實驗室。適應7 d后進行后續(xù)試驗。

飼養(yǎng)期間小鼠自由攝食、飲水，多籠飼養(yǎng)，每天更換墊料以保證飼養(yǎng)環(huán)境干燥清潔；小鼠飼料配料表見表1。

表1 小鼠飼料配料表?

? 能量16 857 kJ/kg。

1.2 材料及主要儀器

1.2.1 材料與試劑

人參莖葉提取物(總皂苷含量前期試驗測定為80%，采用70%乙醇提取)：吉林省華惠生物科技有限公司2016年產(chǎn)；

鏈脲佐菌素：75%，美國Sigma公司；

鹽酸二甲雙胍：純度以C4H22N5·HCl計0.5 g/片，河北山姆士藥業(yè)有限公司；

檸檬酸、檸檬酸鈉：AR級，天津市華東試劑廠；

總膽固醇(T-CHO)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、血清丙二醛(MDA)試劑盒：南京建成生物工程研究所；

醫(yī)用酒精：95%，上海金和實業(yè)有限公司。

1.2.2 主要設備儀器

分光光度計：U-3900型，日立儀器有限公司；

高速離心機：8O-2型，上海手術(shù)器械廠；

離心機：TG16A-WS型，上海盧湘儀器有限公司；

分析天平：FA2004型，上海上平儀器有限公司；

立式鼓風干燥箱：DHG-9620A型，上海百典儀器設備有限公司；

血糖儀：CareSens POP型，韓國i-SENS,Lnc.；

多功能熒光酶標儀：SP-Max3500FL型，上海閃譜生物科技有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9082型，上海精宏實驗設備有限公司；

電子天平：Scout SE-SE202FZH型，奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血糖含量的測定 小鼠禁食12 h后，進行尾部采血，用血糖儀檢測血糖值，并記錄。

1.3.2 糖尿病小鼠建模

(1) 選擇大小、體重且健康狀態(tài)相似的雄性昆明小鼠，適應性喂養(yǎng)7 d后，從中隨機選取5只作為空白實驗組，其他小鼠經(jīng)過12 h禁食，不禁水。

(2) 將檸檬酸—檸檬酸鈉溶解配置成緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 4.6)，以其溶解STZ配置成12 mg/mL注射液，測量并記錄體重及空腹血糖值后，對小鼠進行腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立I型糖尿病模型。

(3) STZ注射劑量為120 mg/kg，根據(jù)其體重進行腹腔注射建模。

(4) 造模后第7天小鼠禁食后稱量體重，尾部采血測空腹血糖值，以建模7 d后空腹血糖值高于11.1 mmol/L(200 mg/dL)為建模成功，所得小鼠為Ⅰ型糖尿病小鼠，剔除建模失敗小鼠。

1.3.3 受試物劑量設計 將建模成功小鼠隨機分為5組作為試驗組(每組5只) ，將人參莖葉提取物以三蒸水按如下劑量配置成懸濁液，其中人參莖葉提取物劑量根據(jù)預試驗提取物劑量梯度試驗結(jié)果設置，該試驗條件下最小有效劑量為2.0 g/kg·BW高于3.8 g/kg·BW無顯著差異，故分組和劑量設置見表2。

試驗期間小鼠延續(xù)使用原有飼料，處理組每日上午 9:00左右灌胃各藥物 1 次，給藥劑量按小鼠體重變化進行調(diào)整，連續(xù)給藥20 d；ⅱ、ⅰ組給予相同體積的蒸餾水取代，末次灌胃后摘除眼球取血。1.3.4 小鼠血清TC、TG、MDA、SOD的測定 試驗組最后一次灌胃后，眼球取血處死并收集血漿，37 ℃孵育1 h，4 ℃靜置3 h，3 500 r/min離心10 min，取血清，放入4 ℃冷藏，然后分別按照相應試劑盒使用方法，使用酶標儀或紫外分光光度計檢測吸光值，然后根據(jù)式(1)～(4)分別對應計算TC、TG、MDA、SOD含量或活力。

表2 分組及劑量設置

(1)

(2)

(3)

(4)

式中：

cTC——血清膽固醇含量，mmol/L；

cTG——血清甘油三酯含量，mmol/L；

cMDA——血清丙二醛含量，nmol/L；

c0——血清TC校準品濃度，5.17 mmol/L；

c1——血清TG校準品濃度，2.26 mmol/L；

c2——血清MDA校準品濃度，10.0 nmol/L；

A0——空白OD值；

As——校準OD值；

At——測定OD值。

USOD——SOD活力，U/mL；

Ac——對照OD值；

Ac0——對照空白OD值；

At——測定OD值；

At0——測定空白OD值；

12——反應體系稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參莖葉提取物懸濁液對小鼠身體狀態(tài)及飲食的影響

建模后，對各試驗組小鼠進行20 d觀察發(fā)現(xiàn)，給藥組小鼠隨著給藥時間的延長精力越來越旺盛，毛發(fā)狀態(tài)由建模后的枯黃干燥重新變得濃密順滑；空白組小鼠飲食量無異常變化。各組糖尿病小鼠飲食量隨著灌胃時間延長有減少的趨勢，其中與ⅱ組相比，人參莖葉提取物懸濁液λ、ⅲ組飲食量明顯減少，墊料維持干燥時間延長。

2.2 人參莖葉提取物懸濁液對各試驗組小鼠體重及血糖的影響

由表3可知，與ⅰ組相比，各試驗組小鼠建模后體重均有極顯著差異，出現(xiàn)不增長甚至負增長現(xiàn)象，符合糖尿病模型體重變化狀況。試驗期間，ⅰ組昆明小鼠體重趨于增長趨勢，ⅱ組體重略微下降，ⅲ組體重表現(xiàn)出建模后下降，試驗后期升高的趨勢，α組小鼠體重基本維持不變，β、λ與ⅲ組有相同趨向。第10天時，其余各組均極顯著低于ⅰ組；ⅲ、λ組顯著低于ⅱ組；除α組小鼠體重顯著低于ⅲ組外，其他兩劑量組無顯著差異。說明二甲雙胍與高劑量人參莖葉提取物懸濁液有助于恢復糖尿病小鼠體重的增長。第20天時，其余各組均極顯著低于ⅰ組；ⅲ、β、λ組極顯著高于ⅱ組，且ⅲ與ⅰ組更為接近；除β、λ組外其余各組均與ⅲ組存在極顯著性差異。說明隨著試驗時間的延長，灌胃人參莖葉提取物懸濁液β、λ組小鼠體重恢復情況更接近于ⅲ組，證明人參莖葉提取物懸濁液中、高劑量組在一定程度上改善了糖尿病小鼠體重變化。

由表4可知，建模后小鼠血糖值明顯升高，空腹血糖值皆高于11.1 mmol/L。試驗期間，ⅰ組血糖維持基本穩(wěn)定，ⅱ組呈輕微上升趨勢，ⅲ組隨時間推移呈下降趨勢，人參莖葉提取物α、β、λ、ⅲ組趨勢相同。第10天時，其余各組均極顯著高于ⅰ組；ⅲ、β、λ組均極顯著低于ⅱ組，α組顯著低于ⅱ組，但血糖值除正常組外仍均高于11.1 mmol/L；除α組顯著高于ⅲ組外，其他兩劑量組小鼠與ⅲ組均無顯著差異。說明二甲雙胍與β、λ組人參莖葉提取物懸濁液有助于緩解糖尿病小鼠的血糖上升。第20天時，ⅱ、α、β組均極顯著高于ⅰ組；其余各組均極顯著低于ⅱ組，其中ⅲ、λ組更接近ⅰ組；ⅱ組極顯著高于ⅲ組，同時試驗劑量組與ⅲ組無顯著差異，但從空腹血糖值來看λ組更接近ⅲ組。說明隨著試驗時間的延長，高劑量組在人參莖葉提取物干預下小鼠血糖恢復狀況更接近藥物治療，證明其有助于恢復糖尿病小鼠的血糖水平，改善血糖平衡。

體重與血糖值變化是糖尿病患者的基礎數(shù)據(jù)，表現(xiàn)為體重的不增長及負增長和高血糖等，實時監(jiān)測血糖及體重變化,同時評估體內(nèi)抗氧化水平可以判斷糖尿病病人臨床用藥的有效性[21-22]。本研究表明人參莖葉提取物有助于控制糖尿病病情，灌胃人參莖葉提取物20 d后中、高劑量組小鼠體重極顯著(P<0.01)高于陰性對照組，其中高劑量組體重恢復最為明顯；人參莖葉提取物3個劑量組血糖值極顯著(P<0.01)低于陰性對照組，其中高劑量組與陽性對照組接近，表明高劑量人參莖葉提取物能夠改善糖尿病小鼠的體重情況，對其血糖平衡有顯著的調(diào)節(jié)作用，且存在一定劑量依賴關(guān)系。

表3 人參莖葉提取物懸濁液對各試驗組小鼠體重的影響?

? 與ⅰ組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與ⅱ組相比，△表示P<0.05，△△表示P<0.01；與ⅲ組相比，◇表示P<0.05，◇◇表示P<0.01。

表4 糖尿病小鼠造模前后小鼠血糖變化?

? 與ⅰ組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與ⅱ組相比，△表示P<0.05，△△表示P<0.01；與ⅲ組相比，◇表示P<0.05，◇◇表示P<0.01。

2.3 人參莖葉提取物懸濁液對小鼠血清相關(guān)指標的影響

由表5可知，從血清TC含量來看，ⅱ組顯著高于ⅰ組，其余各組均無顯著性差異；β組顯著低于ⅱ組，λ、ⅲ組極顯著低于ⅱ組；β、λ組與ⅲ組相比均無顯著性差異。說明二甲雙胍與人參莖葉提取物懸濁液中、高劑量組能夠一定程度降低糖尿病小鼠血清中總膽固醇含量。對血清TG含量而言，ⅱ、α、β組極顯著高于ⅰ組，ⅲ、λ組與ⅰ組相比無顯著差異；ⅲ、λ組極顯著低于ⅱ組，α、β組與ⅱ組相比無顯著差異；ⅱ、α、β組極顯著高于ⅲ組，而λ組與ⅲ組相比無顯著差異。表明高劑量人參莖葉提取物能夠一定程度地降低小鼠血清甘油三酯含量。

總膽固醇(TC)及甘油三酯(TG)是反映糖尿病病情的兩個重要血液指標，中劑量組血清膽固醇顯著低于陰性對照組(P<0.05)，而高劑量組則極顯著低于陰性對照組(P<0.01)，表明了人參莖葉提取物具有效控制糖尿病小鼠血液血脂的能力，與Evelyn Saba[8]的研究結(jié)果相似，其研究表明人參皂苷Rg3可以降低LDL運載受體敲除模型鼠體內(nèi)總膽固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白膽固醇的水平，從而提升機體預防動脈粥樣硬化的能力，證明了人參皂苷提取物具有延緩和防治動脈粥樣硬化產(chǎn)生的潛力；而動脈粥樣硬化又與機體血栓的產(chǎn)生息息相關(guān)，更是腦血栓發(fā)生發(fā)展的基礎，研究[9-10]也發(fā)現(xiàn)粗皂苷尤其是其中的Rg3成分能夠顯著抑制膠原誘導的機體血小板聚集，從而大大降低血栓發(fā)生的幾率，證明了人參皂苷提取物成分對糖尿病、動脈硬化以及血栓等血液疾病具有預防和治療的潛力。

關(guān)于血清MDA含量，ⅱ組極顯著高于ⅰ組，ⅲ組與ⅰ組無顯著差異，其余各組均顯著高于ⅰ組，其中ⅱ組小鼠血清MDA含量幾乎是正常組小鼠的兩倍；ⅲ、β、λ組均顯著低于ⅱ組，更接近ⅰ組；ⅱ組顯著高于ⅲ組，其余各組與ⅲ組均無顯著差異，而λ組血清MDA值更接近ⅲ組。說明二甲雙胍與中、高劑量組人參莖葉提取物對清除糖尿病小鼠血清MDA有效，緩解其體內(nèi)脂質(zhì)過氧化。血清SOD方面，ⅱ組顯著低于ⅰ組，α組極顯著低于ⅰ組；ⅲ與β組顯著高于ⅱ組，λ組極顯著高于ⅱ組；而β、λ組與ⅲ組相比無顯著差異。說明二甲雙胍和人參莖葉提取物中、高劑量組對糖尿病小鼠血清SOD有一定調(diào)控作用，能夠在一定程度上提高糖尿病小鼠血清SOD活力。

MDA是機體內(nèi)多不飽和脂肪酸氧化作用下的次級代謝物，一定程度反應了機體脂質(zhì)過氧化水平和細胞受損程度，而人體內(nèi)胰島β細胞負責分泌胰島素調(diào)節(jié)體內(nèi)葡萄糖代謝體系，但氧化應激反應會通過損害β細胞導致胰島素分泌不足，是糖尿病血液相關(guān)并發(fā)癥的機理之一[13]；而SOD活力體現(xiàn)機體內(nèi)的基礎抗氧化能力，主要參與氧自由基清除，同時其活性高低代表著機體消除自由基能力的強弱，呈正相關(guān)[14]。本研究顯示人參莖葉提取物高劑量組血清MDA顯著低于陰性對照組(P<0.05)，同時高劑量組SOD活性極顯著高于陰性對照組(P<0.01)，表明人參莖葉提取物可以增強機體內(nèi)SOD的活力，提高機體清除自由基的能力，從而提升機體抗氧化能力，同時提升機體清除血清MDA的能力，緩解機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，降低細胞毒性，達到改善糖尿病小鼠抗氧化能力和緩解其血液相關(guān)并發(fā)癥的能力，相似的臨床試驗[15]指出，對健康個體和絕經(jīng)后婦女進行參類膠囊治療試驗后，結(jié)果顯示所有試驗參與者機體SOD水平均顯著上升，同時絕經(jīng)后婦女機體MDA含量顯著下降。

表5 人參莖葉提取物懸濁液對血清TC、TG、MDA、SOD的影響?

? 與ⅰ組相比,*表示P<0.05，**表示P<0.01；與ⅱ組相比,△表示P<0.05，△△表示P<0.01；與ⅲ組相比,◇表示P<0.05，◇◇表示P<0.01。

綜合而言，高劑量人參莖葉提取物能夠顯著改善糖尿病小鼠以上4個血液指標，提升小鼠機體的抗氧化應激能力，降低糖尿病小鼠血清TC及TG量，從而平衡血脂，實現(xiàn)緩解糖尿病病情的目的。

3 結(jié)論

近年來，糖尿病的發(fā)病率逐年升高，而針對糖尿病的藥物卻一直局限在副作用明顯的西藥，忽略了很多天然的植物提取物。本研究結(jié)果證明人參莖葉皂苷提取物能夠起到較好的治療I型糖尿病的作用，具體表現(xiàn)為增強機體內(nèi)SOD活力，降低血清MDA含量，清除體內(nèi)過量TC、TG，恢復機體體重增長及促進血糖值恢復正常水平。從其清除機體MDA及提高SOD活力來看，人參莖葉皂苷提取物能夠通過修復受損的胰島組織及胰島β細胞，從而一定程度上恢復胰島功能，提升機體胰島素含量，增強胰島素敏感性，從而發(fā)揮降低高血糖癥狀的能力；而其降低血清TC和TG的能力，最可能是通過提高機體高密度脂蛋白轉(zhuǎn)移機體膽固醇的能力，以及降低攜帶膽固醇的低密度脂蛋白被氧化的比例，從而降低血清膽固醇，但其具體的作用機制還需要進一步的研究證實。研究選用提取物皂苷含量豐富(含量為80%)，但其單體皂苷構(gòu)成及含量有待進一步明確，且人參莖葉作為一種比較容易獲取的原料，其研究利用以及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)有助于擴展人參加工副產(chǎn)品種類，為人參莖葉在功能性食品上的應用提供參考依據(jù)。

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Effects of extracts of ginseng stems and leaves on type I diabetic mice model

SHIDe-jun1,2

YANHuan2

CUIQing-mei2

QIXin2

HUANGMin3

CUICheng-bi1,2

(1.KeyLaboratoryofNaturalResourceofChangbaiMountainandFunctionalMolecular,MinistryofEducation,Yanji,Jilin133002,China; 2.CollegeofAgriculture,YanbianUniversity,Yanji,Jilin133002,China; 3.SichuanInstituteofAtomicEnergy,Chengdu,Sichuan610101,China)

In order to study the function effects ofPanaxginsengstems and leaves extract on type I diabetic, 40 male CL grade Kunming mice were injected with STZ at 120 mg/kg body weight to induce type I diabetes mice model, and body weight and blood glucose were measured during the experiment. After 20 days’ test, blood serum was obtained by eye’s blood of mice and the total cholesterol(TC), triglyceride(TG), superoxide dismutase(SOD) and malondialdehyde(MDA) were all measured by kits. The results showed that the extract of ginseng stems and leaves at a certain dose can improve the antioxidant capacity of type I diabetic mice and reduce the serum lipid which to alleviates the complications of diabetes mellitus.

Ginseng stem and leaf extract; diabetes; serum; total cholesterol; triglyceride

輻照保藏四川省重點實驗室開放課題項目(編號：SCFZBC2017003)

史得君，男，延邊大學在讀碩士研究生。

黃敏(1973—)，女，四川省原子能研究院生物技術(shù)研究所所長，博士。E-mail: hm1219@gmail.com 崔承弼(1968—)，男，延邊大學教授，博士。 E-mail: cuichengbi@ybu.edu.cn

2017—03—09

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.036