宋忠興，趙鵬，唐志書，白宏博，李鉑，嚴邑萍

(1.陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司，陜西 銅川 727031；2.陜西省中藥資源產業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；3.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；4.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712046)

·中藥工業(yè)·

4種中藥微細粉體顯微特征及細胞破壁率的測定△

宋忠興1，2*，趙鵬1，唐志書2，3，白宏博2，3，李鉑2，3，嚴邑萍4

(1.陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司，陜西 銅川 727031；2.陜西省中藥資源產業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；3.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；4.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712046)

目的：測定丹參、黃芩、苦參和秦艽4種常用中藥微細粉體的細胞破壁率，比較其與常規(guī)細粉的顯微特征差異。方法：采用細胞計數法，以木栓細胞、薄壁細胞作為計數指標，考察微細粉體技術對4種中藥細胞破壁率的影響；同時采用顯微觀察法比較常規(guī)細粉與微粉體的細胞結構及后含物形態(tài)變化。結果：4種中藥微細粉體的細胞破壁均在95%以上，且細胞多已破碎，偶見完整細胞和導管等碎片。結論：微細粉體技術對丹參、黃芩、苦參、秦艽4種中藥具有良好的細胞破壁效果。

中藥；破壁微粉；細胞破壁率

中藥材以植物藥為主，約占85%以上。對于具有完整細胞結構的植物藥而言，有效成分布于細胞內，細胞壁是其溶出的主要屏障[1]。而中藥破壁飲片是指在遵循中醫(yī)藥用藥理論的前提下，將傳統(tǒng)中藥飲片采用微細粉體破壁技術進行細胞級粉碎，制成具有較小粒徑的微細粉體(D90<45 μm，破壁率>95%)，再經現代制劑技術制成干燥顆粒狀的一種新型中藥飲片[2]。其核心就是采用以生物細胞破壁為目的的微細粉體技術破壞中藥飲片組織的細胞壁，可以解決傳統(tǒng)中藥飲片物質基礎因其部位、組織、細胞的不同而帶來的不均勻性問題。其可大幅提高中藥飲片有效成分的利用率，降低資源消耗，改變中藥飲片煎煮的服用方式，保留傳統(tǒng)中藥飲片的基本特征[3-5]。在破壁飲片制備過程中，藥材微細粉體是其中間產品或終端產品的主要形式，對其進行破壁率測定，從微觀、理化特性表征等方面建立綜合評價技術體系，方可形成科學、穩(wěn)定的破壁飲片制備工藝和質量控制方法[6-7]。作者通過觀察比較丹參、黃芩、苦參和秦艽4種中藥的常規(guī)細粉和微細粉體的顯微特征，利用細胞計數法分別測定其超微粉的細胞破壁率，考察超微粉碎技術對中藥細胞破壁率的影響。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

丹參、黃芩、苦參和秦艽購自陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司，符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部相關規(guī)定；水合氯醛及甘油均為分析純(上海山浦化工有限公司)。

1.2 儀器

XDW-2.1型振動式細胞級超微粉碎機(濟南達微機械有限公司)；FW-1000D型高速萬能粉碎機(天津鑫博得儀器有限公司)；KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BX53型正置熒光生物顯微鏡(Olympus，Japan，包含DP73型CCD圖像采集和計算機圖像分析系統(tǒng))。

1.3 樣品制備

細粉制備：取丹參、黃芩、苦參和秦艽4種飲片，均干燥至水分約為6%，分別粉碎成細粉(100目)，即得常規(guī)細粉，備用。

微細粉制備：將上述4種常規(guī)細粉分別采用細胞級超微粉碎機粉碎約20 min，收集過300目的微細粉，備用。

2 方法與結果

2.1 藥材細粉顯微特征、細胞計數及標準曲線繪制

參照郭旭東等[5]的方法并略作修改，按表1精密稱取不同質量的細粉(80目)，分別置于10 mL容量瓶中，加水合氯醛5 mL，超聲處理5 min，使藥材粉末分散均勻，定容至刻度。用微量移液器吸取30 μL藥液，裝片，以混懸液布滿載玻片且無氣泡為宜，并分別置于BX53型生物顯微鏡下觀察(400×)。

從不同藥材常規(guī)細粉顯微特征圖中可見完整木栓細胞、薄壁細胞，各種類型導管、纖維及細胞后含物等。丹參細粉木栓細胞壁厚，含棕色物質；石細胞呈類長方形或不規(guī)則形，內含棕黃色物；具緣紋孔導管和螺紋導管多見，見圖1。黃芩粉末中木栓細胞壁厚，含棕黃色物質；石細胞呈不規(guī)則多角形，韌皮纖維壁厚，多呈梭形且具孔溝，見圖2。苦參細粉木栓細胞壁厚，呈不規(guī)則多邊形；另有螺紋導管和環(huán)紋導管，偶見草酸鈣方晶，見圖3。秦艽細粉中薄壁細胞多見，呈類長方形至不規(guī)則形，多含草酸鈣針晶；另有環(huán)紋導管和螺紋導管等，偶見內皮層細胞，見圖4。

根據顯微特征觀察結果，分別以丹參、黃芩、苦參細粉中完整木栓細胞和秦艽細粉中薄壁細胞為計數指標，以顯微鏡下一個視野為一個計數單位，每個濃度藥液取8個計數單位，計數結果見表1。以完整細胞個數的平均值為縱坐標，以藥材細粉稱樣量為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，不同藥材在所取濃度范圍內表現出較好的線性關系，可用作顯微特征計數，故取曲線中部藥液濃度為最適濃度進行計數，見表2。

注：A.木栓細胞(細粉)；B.導管(細粉)；C.韌皮纖維(細粉)；D.超微粉。圖2 黃芩粉末顯微特征圖

注：A.木栓細胞(細粉)；B.導管(細粉)；C.草酸鈣方晶(細粉)；D.木栓細胞(超微粉)。圖3 苦參粉末顯微特征圖

注：A.薄壁細胞(細粉)；B.薄壁細胞(細粉)；C.導管(細粉)；D.薄壁細胞(超微粉)。圖4 秦艽粉末顯微特征圖

藥材名稱稱樣量及細胞個數丹參W/g0.06410.12250.18320.24620.3012N6.3757.59.2511.2512.5黃芩W/g0.03760.06920.12560.1820.2496N12.7513.62516.12516.520苦參W/g0.12420.1840.2450.30770.365N7.12510.37511.87514.87516.625秦艽W/g0.12460.18530.2470.30540.3594N3.1256.6256.59.12510.125

注：W.藥材細粉稱樣量；N.完整細胞個數。

表2 不同細粉標準曲線和最適濃度

2.2 微細粉體顯微特征及細胞破壁率的測定

顯微觀察結果表明，丹參、黃芩微細粉體中未見完整木栓細胞，偶見導管及纖維等殘片。苦參、秦艽微細粉體中偶見完整木栓細胞和薄壁細胞。根據2.1的結果，分別以最適濃度精密稱取不同藥材細粉和微細粉，置于10 mL容量瓶中，裝片方法同2.1；分別置于顯微鏡下觀察25個視野，根據不同藥材兩種粉末中完整細胞個數、樣品質量、混懸液體積等指標計算顯微特征個數[8]：

粉末顯微特征個數=(XV)/(V′W)

其中，X為蓋玻片下粉末中完整細胞的特征數，V為粉末混懸液總體積(mL)，V′為蓋玻片下粉末混懸液體積(mL)，W為粉末重量(mg)。

依照以下公式計算微細粉體細胞破壁率[9]：Y=(A-B)/A×100%。上式中，Y為細胞破壁率，A為常規(guī)細粉顯微特征個數，B為超微粉顯微特征個數。由表3各參數分別計算4種細粉和微細粉的顯微特征個數，最終得到各微細粉的細胞破壁率。計算結果表明，丹參、黃芩微細粉的細胞破壁率可達100%；苦參、秦艽微細粉的細胞破壁率分別為97.51%和95.41%。

表3 不同粉體顯微特征個數計算相關參數(n=25)

注：FP.fine powder，常規(guī)細粉；UFP.ultra-fine powder，微細粉。

3 討論

本文研究結果表明，微細粉體技術對丹參、黃芩、苦參、秦艽4種中藥具有良好的細胞破壁效果。丹參、黃芩微細粉體的細胞破壁率均達到100%，顯微特征僅見細胞和導管等碎片，說明這兩種藥材的超微粉可達細胞級粉碎水平，大部分細胞的細胞壁完全被打破，有利于有效成分的溶出和藥效的發(fā)揮，可為制劑工藝研究和臨床用藥提供理論依據?？鄥ⅰ⑶剀次⒓毞垠w細胞破壁率亦可達95%以上，說明超微粉碎技術對不同中藥破壁率的影響有所差異，取決于中藥的種類、物理特性等。本文通過觀察比較丹參、黃芩、苦參和秦艽4種藥細粉及微細粉體的顯微特征，并以木栓細胞和薄壁細胞作為計數指標，考察超微粉碎對細胞破壁率的影響，不同中藥細胞破壁率在95.41%～100%，該方法穩(wěn)定、方便可行。

中藥的有效成分是動植物生命過程中產生的次生代謝產物，大多分布在細胞內。不同的藥用部位、組織、細胞其成分的種類、數量有所差異，部位不同甚至表現出不同的功能。中藥采用傳統(tǒng)的煎煮方法，因為致密的組織結構，有效成分從細胞壁內浸出利用率只有10～30%。研究表明，丹參超微粉中丹酚酸B的溶出速率明顯高于其細粉[10]。同時發(fā)現，三七粉粒度大小對主要成分含量影響明顯，與普通粉碎相比，三七經超微粉碎2 h后，其超微粉中三七總皂苷含量達8.3%，高于普通粉碎藥材[11]。吳小明等[12]研究發(fā)現，三七經超微粉碎后，3種皂苷的溶出速度快于常規(guī)細粉，8 min內可達總溶出量的90%。因此，本研究后續(xù)將對不同藥材常規(guī)細粉和微細粉體中有效成分含量、溶出速率、體內吸收等差異作進一步研究，為制劑過程中超微粉的應用提供參考。

[1] 化瑋，劉洋，艾國，等.3種中藥最細粉的制備及理化性質考察[J].中草藥.2013，44(23)：3296-3302.

[2] 鄧雯，謝果，楊澤銳，等.中藥破壁飲片安全性研究進展及思考[J].中國現代中藥，2015，17(12)：1340-1344.

[3] 成金樂，賴智填，彭麗華.中藥破壁飲片研究[J].世界科學技術—中醫(yī)藥現代化，2014，16(2)：254-261.

[4] 賈巖.破壁飲片或實現顛覆性創(chuàng)新[N].醫(yī)藥經濟報，2015-12-07(7).

[5] 郭旭東，郭宇廷，刁其玉，等.超微粉碎技術在中草藥上的應用[J].中國現代中藥，2011，13(9)：41-44.

[6] 吳娜，楊詩龍，嚴丹，等.粉末中藥鑒別方法的研究進展與思考實踐[J].中草藥，2015，46(10)：1413-1419.

[7] 李德成，劉慶燕.超微粉碎技術在中藥制劑中廣泛應用的優(yōu)越性[J].世界中醫(yī)藥，2011，6(45)：454-455.

[8] 姜清華，翟延君，王榮祥.羚羊清肺丸中羚羊角的顯微定量研究[J].中藥材，2004,21(2)：90-91.

[9] 蔡萍，匡建軍，蔡光先，等.白術微粉細胞破壁率的測定[J].湖南中醫(yī)雜志，2010,26(5)：120-121.

[10]張海英，聶繼紅.丹參超微粉和細粉中丹酚酸B的溶出度研究[J].安徽農業(yè)科學，2013,41(9)：4054-4056.

[11]王艷萍，劉宇靈，楊立新，等.超微粉碎技術對三七藥材粉碎效果及有效成分含量的影響[J].中國中藥雜志，2014,34(8)：1430-1434.

[12]吳小明，梁少瑜，程文勝，等.三七普通細粉與超微粉中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1及人參皂苷Rg1體外溶出行為的比較研究[J].中草藥，2013,44(24)：3489-3492.

StudyonMicroscopicFeatureandWall-brokenRateofFourKindsofTraditionalChineseMedicineMicro-finePowders

SONGZhongxing1，2*，ZHAOPeng1，TANGZhishu2，3，BAIHongbo2，3，LIBo2，3，YANYiping4

(1.ShaanxiXingshengdePharmaceuticalCo.Ltd.，Tongchuan727031，China； 2.ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，Xianyang712083，China； 3.ShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712046，China； 4.TheAffiliatedHospitalofShaanxiTCMUniversity，Xianyang712046，China)

Objective：To determine the wall-broken rates of four kinds of traditional Chinese medicine (TCM) micro-fine powders，including Radix Salviae Miltiorrhizae，Radix Seutellariae，Radix Sophorae Flavescentis and Radix Gentianae Macrophyllae.Moreover，the microscopic feature differences between micro-fine powders and conventional powders were compared.Methods: The cell counting method was applied to evaluate the effect of micro-fine grinding technology on the wall-broken rate with the number of intact cork cell and parenchyma cell as the index.Meanwhile，the cell structure and ergastic substances were compared between micro-fine powders and conventional powders by microscopic observation method.Results: The wall-broken rates of four kinds of TCM micro-fine powders were over 95%.The cell wall was almost broken and the intact cell and vessel fragment were occasional.Conclusion: Micro-fine grinding technology has a good effect on the wall-broken rates of four kinds of TCM micro-fine powders，including Radix Salviae Miltiorrhizae，Radix Seutellariae，Radix Sophorae Flavescentis and Radix Gentianae Macrophyllae.

Traditional Chinese medicine；micro-fine powder；wall-broken rate

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新計劃項目(2015KTZDSF02-05-02)；陜西省科技資源開放共亨項目(2015FWPT-01)；陜西省重點科技創(chuàng)新團隊(2012KTC-20)

] 宋忠興，副主任藥師，總工程師，研究方向：新藥研究與產業(yè)化開發(fā)；E-mail：szx74816@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.018

2016-03-25)

*[