楊鵬，卿志星，左姿，余坤，曾建國，2*

(1.湖南中醫(yī)藥大學 藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南農(nóng)業(yè)大學 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128)

·基礎(chǔ)研究·

HPLC-Q-TOF/MS鑒定白屈菜中異喹啉類生物堿△

楊鵬1，卿志星1，左姿1，余坤1，曾建國1，2*

(1.湖南中醫(yī)藥大學 藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南農(nóng)業(yè)大學 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128)

目的：利用HPLC-Q-TOF/MS分析技術(shù)快速、系統(tǒng)地鑒定白屈菜中異喹啉類生物堿。方法：采用XAqua C8色譜柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫；體積流量為0.3 mL·min-1；ESI源正離子模式檢測。結(jié)合對照品的二級質(zhì)譜及相關(guān)文獻推測生物堿的結(jié)構(gòu)。結(jié)果：從白屈菜的甲醇提取物中鑒定了18個生物堿，其中木蘭箭毒堿(1)、北美黃連堿(4)、藥根堿(12)、非洲防己堿(14)為首次在白屈菜中報道。結(jié)論：HPLC-Q-TOF/MS方法能快捷、準確地鑒定白屈菜中的化學成分，為白屈菜化學成分的進一步提取分離和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供科學依據(jù)。

HPLC-Q-TOF/MS；白屈菜；異喹啉類生物堿

白屈菜ChelidoniummajusL.系罌粟科白屈菜屬植物，別名地黃連、土黃連、牛金花、斷腸草，分布于東北、華北等丘陵地帶[1]。作為我國傳統(tǒng)中藥，主要用于止咳平喘、鎮(zhèn)痛消炎、抗癌抑菌[2-4]。研究表明其主要有效成分是異喹啉類生物堿。目前發(fā)現(xiàn)的生物堿(如白屈菜堿、血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿、小檗堿、黃連堿、四氫黃連堿、白屈菜明堿等[5-8])主要屬于苯并菲啶類、原小檗堿類、普羅托品類、四氫原小檗堿類、二聚苯并菲啶類等，而異喹啉類生物堿生源合成途徑中的二氫苯并菲啶類、芐基異喹啉類卻少見報道。因此，有必要對白屈菜中的化學成分進行進一步的研究。HPLC-Q-TOF/MS技術(shù)由于其高分辨率、高靈敏度的分析特點，已廣泛運用到中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、中藥化學成分分析、代謝組學等研究領(lǐng)域中。本研究采用HPLC-Q-TOF/MS的方法對白屈菜中的生物堿進行鑒定，為其化學成分的進一步研究和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1290 HPLC串聯(lián)6530 Q-TOF/MS(美國Agilent公司)；ML 204/02型精密天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

乙腈、甲酸(色譜純，Merck)；甲醇(色譜純，安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司)；水為Milli-Q超純水；血根堿、小檗堿、北美黃連堿、別隱品堿對照品由本實驗室分離得到，白屈菜采自國家中藥材生產(chǎn)(湖南)技術(shù)中心基地。

2 方法

2.1 樣品的制備

取1.0 g白屈菜干燥粉末于150 mL錐形瓶中，加入50 mL甲醇超聲提取60 min，過濾，濾液過0.22 μm微孔濾膜，待用。

2.2 色譜條件

Agilent 1290液相色譜儀，色譜柱：XAquaC8柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流動相A為0.1%甲酸-水，流動相B為乙腈；洗脫條件：0～5 min，5%～30% B；5～18 min，30%～45% B；18～25 min，45%～90% B；流速0.3 mL·min-1；檢測波長：284 nm；進樣量：1 μL；柱溫：30 ℃。

2.3 質(zhì)譜條件

ESI離子源，采用正離子檢測模式，干燥器溫度：300 ℃，干燥氣體積流量：8 L·min-1，霧化器壓力：3.8×106Pa，脫溶劑溫度：350 ℃，脫溶劑氣體積流量：12 L·min-1，毛細管電壓：3500 V，錐孔電壓：100 V，掃描范圍m/z：120～1200，二級裂解電壓：15～35 eV。

3 結(jié)果與討論

本實驗運用HPLC-Q-TOF/MS對白屈菜甲醇提取物進行分析鑒定(總離子流圖見圖1)，選擇40余個峰進行二級質(zhì)譜分析，最終推斷出18個生物堿結(jié)構(gòu)，其特征性二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)如表1所示。

圖1 白屈菜甲醇提取物的總離子流圖

3.1 苯并菲啶類生物堿

苯并菲啶類生物堿結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，其母核一般不會發(fā)生裂解，二級質(zhì)譜中碎片離子峰都在m/z200以上，只有部分取代基(CH3、CH2O、CH4)從母核上丟失[9]，如對照品血根堿特征碎片離子峰m/z317、304、274、246均為取代基的丟失所形成(血根堿對照品二級質(zhì)譜見圖2)。據(jù)此推斷化合物13、16、17、18為苯并菲啶類。

化合物13，離子化分子量為m/z332.092 1(C20H14NO4+)，m/z317[M-CH3]+是分子離子失去氮甲基形成，m/z304[M-CO]+、274[M-CO-2H-CO]+和246[M-CO-2H-CO-CO]+推測分子中存在兩個亞甲二氧基，綜上所述，參考文獻[10]，推斷化合物13為血根堿?；衔?6，離子化分子量為m/z348.122 8(C21H18NO4+)，m/z333[M-CH3]+、332[M-CH4]+、318[M-2CH3]+、304[M-CH4-CO]+和290[M-2CH3-CO]+推測分子中存在相鄰的甲氧基，從離子峰m/z260[M-2CH3-CO-CO-2H]+推測分子中存在亞甲二氧基。綜上所述，參考文獻[11]，推斷化合物16為白屈菜紅堿?；衔?7，離子化分子量為m/z362.102 5(C21H16NO5)，m/z332[M-CH3-CH3]+丟失的兩個甲基一個為氮甲基，一個為12位甲氧基的甲基，因為該化合物的二級碎片中沒有M-16的碎片，所以不存在鄰二甲氧基，該化合物的其他裂解方式與血根堿相似，結(jié)合生源合成途徑[12]，參考文獻[13]，推斷化合物17為白屈菜如賓堿。化合物18，離子化分子量為m/z378.134 1(C22H20NO5+)，該化合物裂解方式與白屈菜紅堿裂解方式相同，每個特征碎片離子分子量相差30，結(jié)合這類化合物的生源合成途徑推測甲氧基位于12位，參考文獻[13]，推斷化合物18為白屈菜黃堿。生物堿13、16、17、18的質(zhì)譜裂解途徑見圖3。

圖2 血根堿質(zhì)譜圖

圖3 苯并菲啶類生物堿質(zhì)譜裂解途徑

3.2 原小檗堿類生物堿

原小檗堿類生物堿母核一般不會發(fā)生裂解，僅有小分子取代基的裂解與丟失，由于C-5、6位碳碳單鍵的存在，容易使母核失去2個氫形成更穩(wěn)定的大π共軛體系，小檗堿特征碎片離子峰m/z334、321、320、306、292、278為取代基的丟失所形成，小檗堿特征碎片離子峰m/z318、304、290、276均為失去5，6 位的氫而形成(小檗堿對照品二級質(zhì)譜見圖4)。據(jù)以上特征性的裂解規(guī)律推斷化合物9、10、12、14、15為原小檗堿類。

圖4 小檗堿質(zhì)譜圖

322[M-CH4]+、323[M-CH3]+和308[M- CH3-CH3]+說明2個化合物中都存在相鄰的甲氧基，化合物12中存在m/z320[M-H2O]+碎片離子，化合物14中不存在失去水的碎片離子，參考文獻[16]，推斷化合物12為藥根堿，推斷化合物14為非洲防己堿。化合物15，離子化分子量為m/z336.122 8(C20H18NO4+)，m/z334[M-2H]+、306[M-CO-2H]+和278[M-CO-2H-CO]+說明化合物中存在1個亞甲二氧基，m/z320[M-CH4]+、321[M-CH3]+和306[M-CH3-CH3]+說明該化合物中存在相鄰甲氧基，綜上所述，參考文獻[17]，推斷化合物15為小檗堿。原小檗堿類生物堿9、10、12、14、15的質(zhì)譜裂解途徑見圖5。

圖5 原小檗堿類生物堿質(zhì)譜裂解途徑

3.3 四氫原小檗堿類生物堿

四氫原小檗堿類生物堿有兩條裂解途徑，第一條途徑是RDA(Retro Diels-Alder reaction)裂解，發(fā)生在C環(huán)形成兩分子小片段，B環(huán)裂解同樣也可以形成兩分子小片段[18]。第二條途徑就是母核上丟失一些取代基，與原小檗堿類生物堿類似，四氫原小檗堿類生物堿對照品北美黃連堿特征碎片離子峰m/z176和m/z149為發(fā)生RDA裂解以及B環(huán)裂解所形成(北美黃連堿對照品二級質(zhì)譜見圖6)，據(jù)此推斷化合物4、8為四氫原小檗堿類生物堿。

化合物4和8，離子化分子量分別為m/z340.155 2(C20H22NO4+)和m/z324.115 2(C19H18NO4+)，第一條途徑m/z176是C環(huán)發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生的碎片離子，m/z149是發(fā)生B環(huán)裂解產(chǎn)生的碎片離子；第二條途徑，化合物4中存在m/z324[M- CH4]+和m/z310[M-CO-2H]+，說明化合物4中存在相鄰的甲氧基和一個亞甲二氧基，化合物8中只存在m/z294[M-CO-2H]+，說明化合物8中存在2個亞甲二氧基。綜上所述，參考文獻[19]，推斷化合物4為北美黃連堿，化合物8為四氫黃連堿。四氫原小檗堿類生物堿4和8質(zhì)譜裂解途徑見圖7。

圖6 北美黃連堿質(zhì)譜圖

圖7 四氫原小檗堿類生物堿質(zhì)譜裂解途徑

3.4 普羅托品類生物堿

普羅托品類生物堿中沒有大π共軛體系易發(fā)生RDA裂解和α裂解，裂解后的碎片會繼續(xù)失去一些小分子片段，普羅托品類生物堿另外一個特征性的質(zhì)譜裂解就是會出現(xiàn)[M-H2O]+的碎片離子。別隱品堿特征碎片離子峰m/z206、m/z188、m/z149為RDA裂解和α裂解所產(chǎn)生，碎片離子峰m/z352為失去一分子H2O所產(chǎn)生(別隱品堿標準品二級質(zhì)譜見圖8)。據(jù)此故推斷化合物5、6為普羅托品類。

圖8 別隱品堿質(zhì)譜圖

離子?；衔?、6發(fā)生α裂解后產(chǎn)生m/z190、181、165的碎片離子，接著繼續(xù)失去CO和2H形成m/z160的碎片離子?；衔?中存在m/z308[M-H2O-CO]+，化合物6中存在m/z336[M-H2O-CH4]+，說明化合物6中存在一個相鄰的甲氧基，綜上所述，參考文獻[20]，推斷化合物5為原阿片堿，化合物6推斷為別隱品堿。普羅托品類生物堿5和6質(zhì)譜裂解途徑見圖9。

圖9 普羅托品類生物堿質(zhì)譜裂解途徑

3.5 六氫苯并菲啶類生物堿

六氫苯并菲啶類生物堿由于11位接有羥基會失去H2O形成[M-H2O]+的碎片離子，由于存在氮甲基會發(fā)生α裂解失去CH3NH2形成[M-31]+的碎片離子?；衔?、7和11，其離子化分子量為m/z370.121 6(C20H20NO6+)、354.127 0(C20H20NO5+)和370.158 0(C21H24NO5+)，二級質(zhì)譜中都有失去H2O的碎片離子m/z352、336、352，都有失去CH3NH2的碎片離子m/z339、323、339?；衔?和7中存在m/z291[M-CO-2H]+，且化合物3比化合物7分子量大16，參考文獻[21-22]，化合物3的12位接有羥基?；衔?1中存在m/z305[M-CH4]+的碎片離子，說明該化合物有相鄰的甲氧基，綜上所述，推斷化合物3為白屈菜明堿，化合物7為白屈菜堿，化合物11為α-高白屈菜堿。六氫苯并菲啶類化合物3、7、11的質(zhì)譜圖裂解途徑見圖10。

圖10 六氫苯并菲啶類生物堿質(zhì)譜裂解途徑

3.6 芐基異喹啉類生物堿

化合物1，離子化分子量為m/z314.175 6(C16H24NO3+)，芐基異喹啉類生物堿易失去(CH3)2NH或者CH3NH2，從而形成[M-45]+、[M-31]+的碎片峰，m/z269是失去一分子(CH3)2NH形成的碎片離子，接著發(fā)生α裂解形成m/z175碎片離子；m/z269的碎片離子發(fā)生β裂解形成m/z107的碎片離子，綜上所述，推斷化合物1為木蘭箭毒堿，與文獻報道相符[23]。生物堿1質(zhì)譜裂解途徑見圖11。

3.7 阿樸芬類生物堿

化合物2，離子化分子量為m/z342.170 0(C20H24NO4+)，阿樸芬類生物堿易失去一分子(CH3)2NH形成較穩(wěn)定的[M-45]+碎片離子，主要是發(fā)生一些取代基的丟失。m/z310和282說明分子中存在相鄰的羥基和甲氧基，二級質(zhì)譜中m/z265是基峰失去一分子CO形成m/z237的碎片離子，綜上所述，化合物2為木蘭花堿，與文獻報道相符[24]。生物堿2質(zhì)譜裂解途徑見圖12。

圖11 芐基異喹啉類生物堿質(zhì)譜裂解途徑

圖12 阿樸芬類生物堿質(zhì)譜裂解途徑

峰序tR/min[M]+或[M+H]+(m/z)特征離子MS/MS(m/z)推斷化合物名稱14.828314.1756314,269,175,143,107木蘭箭毒堿25.406342.1700342,310,297,282,265,237,209木蘭花堿35.755370.1216370,352,339,321,291白屈菜明堿4*6.484340.1552340,324,310,192,176,165,149北美黃連堿57.452354.1336354,308,206,190,189,188,165,160,158,149原阿片堿6*8.201370.1649370,336,206,190,189,188,181,165,160,158別隱品堿78.652354.1270354,336,323,305,275白屈菜堿89.137324.1152324,294,176,149四氫黃連堿99.709322.1054322,320,292,264康松草堿1010.307320.0918320,318,290,262黃連堿1110.170370.1580370,352,339,321,305,290α-高白屈菜堿1211.221338.1396338,336,323,322,320,308藥根堿13*12.020332.0921332,317,304,274,272血根堿1412.733338.1386338,336,323,322,308非洲防己堿15*13.284336.1228336,334,321,320,306,278小檗堿1615.784348.1228348,333,332,318,302,290,260白屈菜紅堿1716.523362.1025362,347,334,332,274,272白屈菜如賓堿1817.487378.1341378,363,362,348,332,320,290白屈菜黃堿

注：*表示對照品化合物。

4 結(jié)論

本文運用HPLC-Q-TOF/MS對白屈菜中生物堿進行分析，通過對照品的裂解和文獻核對推斷了18個生物堿，其中化合物1、4、12、14為首次在白屈菜中報道。HPLC-Q-TOF/MS具有快速、準確、無需對照品等特點，可以對多種類型的化合物進行定性鑒別。研究發(fā)現(xiàn)白屈菜中還存在很多微量生物堿，運用HPLC-Q-TOF/MS對白屈菜中化學成分的分離具有指導作用，對研究以白屈菜為原料開發(fā)的產(chǎn)品具有重要意義。

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IdentificationofIsoquinolineAlkaloidsinChelidoniummajusbyHPLC-Q-TOF/MS

YANGPeng1，QINGZhixing1，ZUOZi1，YUKun1，ZENGJianguo1，2*

(1.CollegeofPharmacy，HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208，China； 2.NationalandProvincialUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China)

Objective：To systematically and rapidly identify isoquinoline alkaloids inChelidoniummajususing the HPLC-Q-TOF/MS.Methods：The separation was performed on a XAqua C8column(150 mm×2.1 mm，5 μm)with acetonitrile-0.1% formic acid in water by gradient elution.The flow rate was 0.3 mL·min-1.Electrospray ionization-(ESI)source was applied and operated in positive ion mode.The structure of alkaloids was speculated by MS/MS fragmentation behaviors of standards and related references.Results：18 alkaloids were elucidated from the methanolic extracts ofCh.majus.Compounds magnocurarine(1)，canadine(4)，jatrorrhizine(12)，columbamine(14)were reported firstly inCh.majus.Conclusion：HPLC-Q-TOF/MS is rapid and reliable method for identification of the alkaloids inCh.majus.The results would provide scientific evidence for further extraction and separation of components and study of pharmacodynamic material basis inCh.majus

Isoquinoline alkaloids；HPLC-Q-TOF/MS；ChelidoniummajusL.

長沙市科技計劃重點項目(K1308182-21)

] 曾建國，教授，研究方向：中藥資源與開發(fā)；Tel：(0731)84673824，E-mail：ginkgo@world-way.net

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.003

2016-05-10)

*[