孫彬 劉敏 趙世振 王世本 黃宏麗

(1.聊城大學(xué)生物制藥研究院，聊城 252000；2.沈陽藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院，沈陽 110016)

·論著·

白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶三維結(jié)構(gòu)的同源建模及其與FR-900403的分子對接研究

孫彬1劉敏1趙世振2王世本1黃宏麗1

(1.聊城大學(xué)生物制藥研究院，聊城 252000；2.沈陽藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院，沈陽 110016)

目的 探究白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征。方法 通過采用同源建模的方法首次構(gòu)建白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶的三維結(jié)構(gòu)模型，模型的可靠性經(jīng)Ramachandran和Profile-3D圖進(jìn)行驗(yàn)證。采用InsightⅡ-Binding site方法準(zhǔn)確定位幾丁質(zhì)合成酶的活性位點(diǎn)，并研究了幾丁質(zhì)合成酶的重要功能殘基在活性位點(diǎn)的立體分布。結(jié)果 通過柔性分子對接方法首次闡明幾丁質(zhì)合成酶抑制劑FR-900403與靶酶活性位點(diǎn)的相互作用模式，明確幾丁質(zhì)合成酶與該類抑制劑結(jié)合時(shí)起重要作用的氨基酸殘基。結(jié)論 本研究為基于幾丁質(zhì)合成酶三維結(jié)構(gòu)的藥物靶點(diǎn)設(shè)計(jì)提供重要的參考信息，同時(shí)也為抗真菌藥的發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

真菌感染；幾丁質(zhì)合成酶；同源建模；分子對接

近年來,隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑的廣泛和長期使用以及艾滋病和癌癥放療化療患者的日漸增多等因素,侵入性真菌感染發(fā)病率逐年攀升[1]。研究發(fā)現(xiàn)引起侵入性真菌感染的最常見致病菌包括念珠菌屬 (約占侵入性真菌感染病例的70%～90%)和曲霉菌,這些致病真菌在這些免疫系統(tǒng)受損的患者中會(huì)引起很高的死亡率,目前此類感染已成為重要的健康問題[2-4]。當(dāng)前,臨床上應(yīng)用的抗真菌藥物主要包括:作用于真菌細(xì)胞膜,損害細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的多烯類如兩性霉素B;作用于真菌細(xì)胞P450的唑類化合物；作用于角鯊烯環(huán)氧化酶的丙烯胺類以及干擾真菌核酸合成的嘧啶類化合物等,但這些抗真菌藥物均有較為明顯的毒副作用,并且隨著臨床上預(yù)防以及治療上的大量使用,已出現(xiàn)越來越多的耐藥菌[5-6]。真菌細(xì)胞壁是真菌細(xì)胞所獨(dú)有的結(jié)構(gòu),不存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,其作用是控制細(xì)胞內(nèi)壓力以維持菌體的完整性；幾丁質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞壁的重要成分之一,一旦幾丁質(zhì)的合成出現(xiàn)問題,則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁的缺失破損,從而引起真菌細(xì)胞的膨脹破裂死亡[7-8]。幾丁質(zhì)合成酶抑制劑能夠以幾丁質(zhì)酶為靶點(diǎn),通過發(fā)生特異性的結(jié)合來抑制幾丁質(zhì)合成酶的生物活性,阻斷其真菌增殖的過程,從而起到抗真菌的作用。因此研究幾丁質(zhì)酶的活性位點(diǎn)以及與幾丁質(zhì)酶抑制劑的相互作用方式對致病真菌的治療具有重要意義。

本文中選取了一種代表性的致病真菌——念珠菌種屬中的白念珠菌 (Candidaalbicans)作為研究對象,探究其幾丁質(zhì)合成酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及與幾丁質(zhì)合成酶抑制劑的相互作用方式。但是其三維結(jié)構(gòu)至今尚未被解析出來,阻礙了對該酶的功能、催化機(jī)理以及基于靶點(diǎn)的幾丁質(zhì)合成酶抑制劑的進(jìn)一步研究。同源建模和分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法能很好地應(yīng)用于生物大分子的理論模擬,并指導(dǎo)和解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。本文采用這兩種方法構(gòu)建白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶的三維結(jié)構(gòu)模型,并通過分子對接和量子化學(xué)計(jì)算方法考察幾丁質(zhì)合成酶抑制劑FR-900403[9]與白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶的結(jié)合模式,以期為基于念珠菌屬幾丁質(zhì)合成酶的三維結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計(jì)提供重要的參考信息。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

所有同源建模、模型優(yōu)化及分子對接計(jì)算均在Dell Precision工作站上完成,所用程序?yàn)镾YBYL-Modeller[10],Discovery Studio Visualizer client,CHARMm,Simulation protocols和AutoDock[11-12],計(jì)算中選用的各項(xiàng)參數(shù)除特別說明外均使用缺省值。

1.2 同源建模

在瑞士生物信息研究所的“蛋白專家分析系統(tǒng)”(www.expasy.org)中用“Chitin synthase”作關(guān)鍵詞搜索Swiss-Prot/TrEMBL數(shù)據(jù)庫得到白念珠菌的幾丁質(zhì)合成酶一級結(jié)構(gòu) (序列號：P23316)[13],它是一個(gè)包含776個(gè)氨基酸的蛋白,其序列見圖1。

以白念珠菌的幾丁質(zhì)合成酶 (Chitin synthase)一級序列 (來源于UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫,編號P23316)為探針,在UniProt數(shù)據(jù)庫中利用BLAST-P程序搜索Protein Date Bank (PDB)蛋白晶體數(shù)據(jù)庫中的同源性的模板蛋白的三維結(jié)構(gòu)。整個(gè)模型的構(gòu)建分為以下兩個(gè)步驟。首先利用Clustal X2程序進(jìn)行序列比對,確定模板與序列之間的殘基匹配。再進(jìn)行模型的建立：根據(jù)序列比對的結(jié)果,采用Modeler自動(dòng)建模程序搭建白念珠菌合成酶的三維結(jié)構(gòu)并進(jìn)行側(cè)鏈異構(gòu)化,對所得模型在pH為8.0條件下進(jìn)行加氫、補(bǔ)鍵等化學(xué)修飾,然后把模板蛋白中的配體化合物賦到建模所得結(jié)構(gòu)的相應(yīng)位置,得到目標(biāo)蛋白的初始結(jié)構(gòu)模型。

1.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬和能量優(yōu)化

利用Modeler的方法構(gòu)建完幾丁質(zhì)合成酶模型后,對其進(jìn)行了分子力學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)的優(yōu)化。首先在Macromolecules的模塊下的Prepare Protein操作界面上的優(yōu)化殘基側(cè)鏈,并在指定的pH值下質(zhì)子化結(jié)構(gòu)。隨后利用Simulation/Dynamics文件夾下的Solvation流程,對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行溶劑化。Add Counterion選項(xiàng)選擇Salt溶液類型。Salt Concentration采用缺省值0.145,陽離子類型設(shè)置為Sodium,即Na+,陰離子類型 (Anion Type)設(shè)置為Chloride,即Cl-。以上操作表示為復(fù)合物添加的溶劑環(huán)境為生理鹽水。并對蛋白-配體復(fù)合物體系進(jìn)行束縛,最后進(jìn)行的Standard Dynamics Cascade流程通過優(yōu)化I (Minimization)、優(yōu)化II (Minimization2)、升溫 (Heating)、平衡 (Equilibration)、模擬采樣 (Production),這5個(gè)階段的方法進(jìn)行計(jì)算。

1.4 分子對接

采用SYBYL分子片段庫中片段構(gòu)建FR-900403分子結(jié)構(gòu)。SYBYL/MINIMIZE,Tripos標(biāo)準(zhǔn)分子力場,Gasteiger-Hückel電荷。Powll能量優(yōu)化方法,能量收斂標(biāo)準(zhǔn)為0.042 kJ·mol-1·nm-1。首先對化合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬退火,參數(shù)設(shè)置：升溫到1 000 K,平臺處理時(shí)間為1.0 ps,退火至250 K,退火時(shí)間為1.5 ps,指數(shù)型退火函數(shù)。Tripos標(biāo)準(zhǔn)分子力場,Gasteiger-Hückel電荷,每次循環(huán),得50個(gè)構(gòu)象并能量優(yōu)化,找到能量最低的構(gòu)象作為下一步的起始構(gòu)象。反復(fù)操作,以重復(fù)出現(xiàn)5次以上的最低能量構(gòu)象作為該分子的最低能量構(gòu)象,用于下一步的柔性對接。

柔性對接采用AutoDock程序,它能夠自動(dòng)完成配體和受體的對接,對給定的由配體分子和受體分子組成的體系,能自動(dòng)優(yōu)化小分子化合物的取向及構(gòu)象,建立靶標(biāo)的優(yōu)化模型,尋找小分子與靶標(biāo)大分子作用的結(jié)合位點(diǎn)和最佳結(jié)合構(gòu)象,計(jì)算其與生物大分子的相互作用能來選擇最優(yōu)匹配模式。

2 結(jié) 果

2.1 序列比對結(jié)果

當(dāng)我們構(gòu)建蛋白序列為白念珠菌的幾丁質(zhì)合成酶3D模型時(shí),首先需要挑選一個(gè)或多個(gè)合適的同源模板 (templates)。根據(jù)幾丁質(zhì)合成酶的一級結(jié)構(gòu),采用序列相似性搜索程序BLAST從己知的蛋白結(jié)構(gòu)中識別出同源性較高的一個(gè)或多個(gè)模板蛋白。進(jìn)行BLAST搜索時(shí),使用蛋白數(shù)據(jù)庫 (Protein Data Bank,PDB)來尋找模板蛋白,之后得到打分較高的模板蛋白,如表1所示。

一個(gè)理想的模板蛋白首先需要具有較高的序列同源性 (Sequence identity),并且V-value要足夠小 (<1×10-5)。通過對幾丁質(zhì)合成酶結(jié)構(gòu)域序列比對結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),此類結(jié)構(gòu)顯示出高度序列同源性,說明該家族具有相似的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu) (見圖1)。來自同絲水霉的Chitin synthase 1 (SAPMO,PDB code:2MPK)和酵母菌的Chitin synthase 3 (YEAST,PDB code:4WJW)在BLAST比對結(jié)果顯示出具有32.7%和31.9%的一致性序列同源性 (Sequence identity),且打分最高,E-value均相對合適。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),來自同絲水霉的Chitin synthase 1的蛋白晶體結(jié)構(gòu)2MPK僅解析了其中A鏈的74個(gè)氨基酸殘基,相對較少。而來自酵母真菌幾丁質(zhì)合成酶3的蛋白晶體結(jié)構(gòu)4WJW同源性同樣大于30%,氨基酸殘基較為接近，并且分辨率較高。因此,最終選擇酵母真菌的Chitin synthase 3作為Chitin synthase的同源模板序列。采用Align Sequence to Templates工具將這這個(gè)模板序列和白念珠菌-幾丁質(zhì)合成酶的序列進(jìn)行了多重序列比對,參數(shù)設(shè)置選擇默認(rèn)值。多重序列比對結(jié)果見圖2。

表1 白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶的一級結(jié)構(gòu)比對結(jié)果

比對完全相同的氨基酸殘基用藍(lán)色進(jìn)行了標(biāo)注,深藍(lán)色代表保守區(qū)域,淺藍(lán)色代表半保守區(qū)域。通過對白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶的序列比對結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：在幾丁質(zhì)合成酶的一級結(jié)構(gòu)序列67PDTFSAEGFTL77、104ARTMHGVMKN113、147AVVDGFDFD155、157SVLELLTAT165、198ARTMHGVMKNSIDENLKFKGDEK206、218SVLELLTATKESNQKKINSH228、467SVLELLTATKESNQKKINSHLFSFFSLSNFYLT479和499VSYKSLVSYKSLG505上分別對應(yīng)著活性位點(diǎn)上的關(guān)鍵氨基酸殘基,并且這些關(guān)鍵氨基酸殘基與YEAST-Chitin synthase 3具有這些較高的序列同源性。由此可知,這兩類蛋白酶的活性位點(diǎn)區(qū)域高度保守,很可能具有相近的空間構(gòu)型,從而為白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶同源模型的構(gòu)建奠定了理論基礎(chǔ)。

2.2 同源建模結(jié)果

由自動(dòng)建模程序Modeler構(gòu)建的初始模型,經(jīng)過能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)模擬后,得到了白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶三維結(jié)構(gòu)的合理模型,如圖3所示,Chitin synthase的三維結(jié)構(gòu)中含有22個(gè)α螺旋、11個(gè)β折疊和12個(gè)γ轉(zhuǎn)角。在分子動(dòng)力學(xué)的模擬過程中,蛋白質(zhì)體系在12 ns之后達(dá)到收斂,RMSD值也在最后達(dá)到了平衡,所以選擇10 ns到12 ns的結(jié)構(gòu)作為最終結(jié)構(gòu)模型。并通過在線結(jié)構(gòu)評估軟件 (http://nihserver.mbi.ucla.edu)進(jìn)行評估,在評價(jià)結(jié)果中主要考察所有氨基酸殘基骨架的二面角分布,并通過程序生成的拉氏圖 (Ramachandran)來表示 (見圖4a)[14]。建模的幾丁質(zhì)合成酶模型有95.5%的殘基落入最佳區(qū)域 (The most favoured region),3.4% 的殘基落入其他許可區(qū) (Additional allowed regions),0.5%的殘基落入勉強(qiáng)許可區(qū) (Generously allowed regions),0.6%的殘基落入不允許區(qū) (Disallowed regions)。上述結(jié)果說明,建模所得幾丁質(zhì)合成酶模型的氨基酸二面角結(jié)構(gòu)是比較合理的,同源模型中的氨基酸殘基Cys14、Glu210、Ser346、Val376、Phe468和Asn518雖處于不可接受區(qū),但是這些氨基酸殘基大多都處于模型的表面,遠(yuǎn)離活性位點(diǎn),對下一步的活性位點(diǎn)的對接研究沒有太大的影響。之后采用Profile-3D (見圖4b)檢測建模蛋白氨基酸序列與其三維結(jié)構(gòu)的兼容性，發(fā)現(xiàn)所有殘基的分值均在0.10以上，無不兼容殘基。以上檢測結(jié)果表明,建模所得的幾丁質(zhì)合成酶三維結(jié)構(gòu)是合理可信的。

2.3 抑制劑FR-900403與白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶活性位點(diǎn)的相互作用模式

圖1 白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶的氨基酸序列 圖2 白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶的氨基酸序列與酵母真菌Chitin synthase 3序列 (4WJW)進(jìn)行同源性比對 (深藍(lán).保守序列,淺藍(lán).半保守序列) 圖3 通過同源建模構(gòu)建的白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶3D結(jié)構(gòu) 圖4 a.利用Ramachandran plot評估幾丁質(zhì)合成酶模型結(jié)構(gòu),b.利用Profile-3D plot評估幾丁質(zhì)合成酶模型結(jié)構(gòu)

Fig.1 The amino acid sequence ofCandidaalbicanschitin synthase Fig.2 Sequence alignments ofCandidaalbicanschitin synthase and YEAST-Chitin synthase 3 (4WJW) with conserved (constitution,deep blue;semiconserved constitution,blue) Fig.3 3D models ofCandidaalbicanschitin synthase generated by Modeler Fig.4 a.Ramachandran plot of Chitin synthase 3D-structure modeling,b.Profile-3D plots of the Chitin synthase 3D-structure modeling

從Kemiasp.中分離出含有嘌呤和四氫呋喃環(huán)的天然產(chǎn)物FR-900403是白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶的有效抑制劑 (見圖5),它在體外的MIC為0.4 μg/mL,并且具有一定的體內(nèi)活性。研究FR-900403與白念珠菌活性位點(diǎn)的相互作用模式有助于闡明FR-900403這類幾丁質(zhì)合成酶酶抑制劑的分子作用機(jī)理,為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化指明方向,也可以為開展全新藥物設(shè)計(jì)提供思路。

在同源建模所得幾丁質(zhì)合成酶的三維結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,利用Binding-site程序自動(dòng)生成幾丁質(zhì)合成酶最可能的活性位點(diǎn),主要由Lys243、Pro244、Asp245、Asn246、Val285、Ala286、Ser287、Gln288、Asn289、Phe464、Tyr465、Leu535等氨基酸殘基組成,并且這些關(guān)鍵氨基酸殘基大多處在序列比對的保守區(qū)域中,因此選擇該活性位點(diǎn)作為下一步分子對接研究的基礎(chǔ)。

幾丁質(zhì)合成酶抑制劑FR-900403與白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶的對接結(jié)果見圖6,Csore的綜合評分為4.95分,表明此次對接結(jié)果較為可信。從圖6的對接結(jié)果可以看出,FR-900403與建模蛋白幾丁質(zhì)合成酶的主要作用是由2個(gè)區(qū)域組成：一是由Phe464和Tyr 465構(gòu)成的疏水性結(jié)合腔,而FR-900403上的嘌呤環(huán)基團(tuán)主要結(jié)合在由Phe464和Tyr465構(gòu)成的疏水性結(jié)合活性腔這一部位,并與其中的關(guān)鍵氨基酸Tyr 465形成π-π共軛疏水相互作用,這表明嘌呤環(huán)基團(tuán)是幾丁質(zhì)合成酶抑制劑FR-900403的必需基團(tuán),將該基團(tuán)用其他基團(tuán)替代后會(huì)大大降低的抑制活性；二是幾丁質(zhì)合成酶活性腔中的酸性氨基酸Asp245、極性氨基酸Asn246和Asn289可以形成親水結(jié)合腔,而抑制劑FR-900403上的四氫呋喃環(huán)以及支鏈部分則可以與該區(qū)域形成4對氫鍵相互作用；由于氫鍵相互作用是抑制劑與靶酶蛋白結(jié)合的基本作用力,這可能是該類化合物產(chǎn)生高抑制活性的重要分子基礎(chǔ)。

圖5 FR-900403的分子結(jié)構(gòu) 圖6 抑制劑FR-900403與白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶的對接結(jié)果

3 討 論

本研究以來自酵母菌幾丁質(zhì)合成酶的晶體結(jié)構(gòu)為模板,采用同源建模和分子動(dòng)力學(xué)方法首次建模了白念珠菌幾丁質(zhì)合成酶的三維結(jié)構(gòu),建模結(jié)構(gòu)的精度經(jīng)Ramachandran圖和Profile-3D圖進(jìn)行了驗(yàn)證,其結(jié)果都表明幾丁質(zhì)同源模型的合理性。接著，對幾丁質(zhì)合成酶活性腔進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該部分主要由Lys243、Pro244、Asp245、Asn246、Val285、Ala286、Ser287、Gln288、Asn289、Phe464、Tyr465、Leu535等關(guān)鍵氨基酸殘基組成，這些氨基酸構(gòu)成了活性腔的空間結(jié)構(gòu)特征。利用已發(fā)現(xiàn)的幾丁質(zhì)合成酶抑制劑FR-900403與靶酶進(jìn)行分子對接，從對接結(jié)果中可以看出幾丁質(zhì)合成酶活性腔中的酸性氨基酸殘基Asp245和極性氨基酸殘基Asn246、Asn289均可以與FR-900403結(jié)構(gòu)中的四氫呋喃環(huán)以及支鏈部分形成氫鍵作用；同時(shí)Tyr465可以與FR-900403結(jié)構(gòu)中嘌呤環(huán)部分形成π-π共軛作用，這些弱力相互作用增強(qiáng)了抑制劑與靶酶的結(jié)合能力。本次對接的結(jié)果在分子水平上揭示了幾丁質(zhì)合成酶抑制劑FR-900403與靶酶受體的結(jié)合方式。該項(xiàng)研究工作對于下一步針對抗真菌幾丁質(zhì)合成酶抑制劑結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化指明了方向,同時(shí)也為抗真菌新藥的發(fā)現(xiàn)打下了基礎(chǔ)。

致謝:感謝抗體藥物協(xié)同創(chuàng)新中心及納米藥物與釋藥系統(tǒng)工程中心提供的幫助。

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[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

Homology modeling ofCandidaalbicanschitin synthase and its molecular docking study with FR-900403

SUN Bin1,LIU Min1,ZHAO Shi-zhen2,WANG Shi-ben1,HUANG Hong-li1

(1.InstituteofBioPharmceuticalResearch,LiaochengUniversity,Liaocheng252000,China；2.SchoolofPharmaceuticalEngineering,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China)

Objective In order to further explore the structural features of the active site ofCandidaalbicanschitin synthase.Methods Homologous 3D model ofCandidaalbicanschitin synthase was built on the basis of the crystal coordinates of Yeast Chitin synthase,while the reliability of the model was assessed by Ramachandran plot and Profile-3D analysis.The active site ofCandidaalbicanschitin synthase was searched by Insight II-binding site analysis and important functional residues were located at the active site.To explore the binding mode of the Chitin synthase inhibitors FR-900403 with the active site ofCandidaalbicanschitin synthase,FR-900403 was docked into the active site.Results The binding pattern predicted by the affinity module revealed that important residues interacted with the inhibitors FR-900403.Conclusion The study provided further refinement of the chitin synthase inhibitor binding interaction that may be used as a basis for new structure-based design efforts and discovery of antifungal agents.

fungal infections；chitin synthase；homology modeling；molecular docking

193-197]

國家自然科學(xué)基金 (81703357)，山東省自然科學(xué)基金 (ZR201702060112)

孫彬，男 (漢族)，博士，講師.E-mail:goengoy@163.com

R 379.4

A

1673-3827(2017)12-0193-05

2016-11-17