譚靜文 何文婧 高志琴 楊虹 章楚光 梁豫琳 楊連娟

(1.上海市皮膚病醫(yī)院真菌病科，上海 200443；2.上海市皮膚病醫(yī)院病理科，上海 200443)

·論著·

IL-22對口腔白念珠菌感染的保護(hù)作用及機(jī)制研究

譚靜文1何文婧1高志琴1楊虹1章楚光2梁豫琳2楊連娟1

(1.上海市皮膚病醫(yī)院真菌病科，上海 200443；2.上海市皮膚病醫(yī)院病理科，上海 200443)

目的 明確IL-22在口腔白念珠菌感染中的作用及可能機(jī)制。方法 建立BALB/c小鼠口腔白念珠菌感染動物模型，使用IL-22特異性抗體阻斷小鼠IL-22分泌，觀察與IL-22正常分泌小鼠相比，舌體感染情況、局部菌載量，頰黏膜組織病理學(xué)改變以及局部細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化。結(jié)果 感染48 h后，阻斷IL-22分泌的小鼠舌體可見厚的假膜狀白斑，舌體菌載量1 700 CFU/mL；未阻斷者其舌體局部可見薄的白斑，菌載量為980 CFU/mL。頰黏膜PAS染色后可見，阻斷IL-22的小鼠黏膜表面附有較多菌絲并侵入上皮，伴有上皮細(xì)胞水腫及炎細(xì)胞浸潤；未阻斷者黏膜局部少量菌絲附著，未見明顯炎細(xì)胞浸潤。頰黏膜Realtime-PCR檢測表明，與正常野生型小鼠相比，阻斷IL-22分泌的小鼠局部TNF-α、CXCL-9、CXCL-10、CXCL-11表達(dá)量分別為升高18.1、0.8、1.2及0.9倍；未阻斷者分別升高34.5、1.2、6.1及1.7倍。結(jié)論 IL-22可能通過募集驅(qū)化因子在口腔白念珠菌感染中發(fā)揮保護(hù)作用。

口腔念珠菌?。话啄钪榫?；IL-22

白念珠菌 (Candidaalbicans)是一種廣泛存在的條件致病真菌，也是定植在人體皮膚、口腔及胃腸道黏膜處的正常菌群，由其引起的念珠菌病不但常見且危害極大，是臨床真菌病防治重點(diǎn)。研究表明，健康人口腔中念珠菌的陽性攜帶率高達(dá)80%，且以白念珠菌為主，當(dāng)口腔環(huán)境改變或機(jī)體防御下降時(shí)，菌株在口腔內(nèi)大量繁殖，由寄生轉(zhuǎn)為致病[1]。近年來，隨著糖尿病、HIV、移植患者、腫瘤患者等免疫受損人群的逐年增加，口腔念珠菌病的發(fā)病率在逐年上升。而長期慢性口腔念珠菌病不但有惡變可能，還可向下發(fā)展引起食道念珠菌病，甚至全身播散危害生命[2]。

目前對于該類疾病的治療手段主要依賴局部及全身抗真菌藥物的使用，盡管可以控制大多數(shù)的感染，但越來越多耐藥菌株的出現(xiàn)以及昂貴的治療成本和藥物毒副作用，使防治該病出現(xiàn)了新的挑戰(zhàn)。而了解該病的發(fā)病過程、宿主狀態(tài)，為我們尋找更有效的治療方法提供了重要依據(jù)和新的思路。

白念珠菌感染人體時(shí)，首先轉(zhuǎn)化成為致病的菌絲相以完成對角質(zhì)形成細(xì)胞的進(jìn)一步侵入[3]。在這個(gè)過程中，通過樹突狀細(xì)胞呈遞抗原，可激活局部黏膜免疫，促使角蛋白細(xì)胞分泌抗菌蛋白，在黏膜屏障遭受破壞的時(shí)候，募集中性粒細(xì)胞發(fā)揮殺傷病原菌作用[4]。黏膜免疫反應(yīng)在控制念珠菌起始感染時(shí)發(fā)揮重要作用。研究表明，IL-22是局部黏膜免疫的一個(gè)關(guān)鍵因素，其最基本的作用就是維持黏膜屏障，保護(hù)宿主免受微生物寄生[5]。在一項(xiàng)關(guān)于胰腺炎的研究中證明其可以上調(diào)生存基因如Reg Ⅲ，抗細(xì)胞凋亡及促進(jìn)組織修復(fù)[6]。此外，在一項(xiàng)對肺部肺炎克雷伯桿菌感染的研究表明，IL-22缺陷小鼠菌株的黏附和侵襲性增加，死亡率也更高[7]。而在IL-22敲除小鼠感染檸檬酸桿菌的模型研究表明，其結(jié)腸上皮細(xì)胞破壞更明顯，死亡率也更高[8]。但是IL-22在真菌感染的黏膜免疫是否具有保護(hù)作用尚未明確。

因此，我們擬構(gòu)建BALB/c小鼠口腔念珠菌病感染模型，并通過IL-22特異性抗體阻斷小鼠IL-22分泌，觀察小鼠口腔念珠菌感染情況以及相關(guān)炎癥因子如TNF-α等的分泌，以明確IL-22在口腔念珠菌感染中的作用以及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)菌株 本試驗(yàn)所用菌株為白念珠菌臨床菌株22059，菌種保藏于上海市皮膚病醫(yī)院真菌病科菌種庫。實(shí)驗(yàn)開始前菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (Potato Dextrose Agar，PDA，Difco Laboratories，Detroit，USA)培養(yǎng)基上35℃活化24 h。

實(shí)驗(yàn)動物 BABL/c雌性小鼠，6周齡,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司。食物為購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司的標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水，自然光照，飼養(yǎng)1～2周，小鼠活動情況和體征無異常后進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)研究過程遵循動物倫理學(xué)的相關(guān)要求，優(yōu)化操作以盡量減少小鼠不必要的痛苦。

1.2 菌株毒力恢復(fù)與菌懸液的制備

取上述活化后的菌株，用生理鹽水制備成菌懸液，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，調(diào)整孢子濃度為1×108CFU/mL。將計(jì)數(shù)后的菌懸液直接經(jīng)靜脈注射0.5 mL至小鼠體內(nèi)，接種后第4天取小鼠的腎臟，經(jīng)玻璃研磨器研磨后涂于PDA平板，35℃孵育48 h后，挑取單克隆菌落，轉(zhuǎn)種至PDA培養(yǎng)基，35℃孵育48 h后用生理鹽水制備成菌懸液，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度為1×108CFU/mL備用。

1.3 小鼠口腔念珠菌病模型建立

依照處理方法不同，對小鼠進(jìn)行分組，分別為A組[白念珠菌感染+Anti IL-22抗體 (eBioscience,San Diego,USA,貨號16-7222-85)接種]，B組 (白念珠菌感染)，C組 (空白對照)，D組[白念珠菌感染+對照抗體IgG2ακ (eBioscience,San Diego,USA,貨號16-4321-85)接種]，每組8只小鼠。接種前5 d給予各組小鼠含四環(huán)素 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海，中國，貨號39502370,濃度0.83 g/L)的飲水。接種前3 d對各組小鼠腹腔注射潑尼松龍 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海，中國，貨號40164562)100 mg/kg，接種前1 d對各組小鼠以該劑量再重復(fù)注射1次。接種當(dāng)日，先腹腔注射阿托品注射液 (蕪湖康奇制藥有限公司，蕪湖,安徽，產(chǎn)品批號“國藥準(zhǔn)字H34023134”)1 μg/只，20 min后再腹腔注射烏拉坦液 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海，中國，貨號30191272,濃度1 250 mg/kg)。待小鼠麻醉后用浸有100 μL菌液的棉團(tuán)置于小鼠口腔中，保持2 h。在該過程中需注意保持室溫大于20℃[9]。

1.4 小鼠口腔念珠菌感染臨床特征觀察

感染48 h后，對小鼠口腔感染程度進(jìn)行臨床癥狀評估打分。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分為正常；1分為少量薄的白斑，覆蓋舌表面積約為 20%；2分為薄的白斑,覆蓋舌表面積大約為20%～90%；3分為薄的白斑，覆蓋舌表面積>90%；4分為厚的假膜狀白斑，覆蓋舌表面積>90%。

1.5 念珠菌菌落培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

感染48 h后，每組取2只小鼠處死，無菌采集舌體，稱重，并在含無菌生理鹽水的滅菌管中用勻漿器單獨(dú)進(jìn)行勻漿。所得勻漿經(jīng)滅菌注射用水稀釋10倍后，分3份涂布到PDA培養(yǎng)基上，在35℃培養(yǎng)48 h后，統(tǒng)計(jì)真菌菌落數(shù)。組織感染真菌量以每克組織的CFU值表示。

1.6 組織病理學(xué)檢查

感染48 h后，每組取2只小鼠處死，取頰黏膜上皮組織予組織病理學(xué)觀察后常規(guī)石蠟包埋，4 μm石蠟切片，蘇木素-伊紅 (HE)和過碘酸-Schiff (PAS)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 Realtime-PCR檢測口腔念珠菌感染后局部黏膜中相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況

感染48 h后各組分別處死2只小鼠，取頰黏膜上皮組織、舌體組織，用Realtime-PCR方法檢測IL-22、TNF-α、CXCL-9、CXCL-10、CXCL-11的mRNA表達(dá)水平。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 小鼠舌體感染情況及局部菌載量

感染48 h后，觀察各組小鼠舌體情況發(fā)現(xiàn)，阻斷IL-22之后，小鼠舌體可見厚的假膜狀白斑，覆蓋舌表面積>90%，評分為4分 (見圖1A)；未阻斷IL-22的野生型小鼠，感染白念珠菌48 h后可見薄的白斑，覆蓋舌表面積>90%，評分為3分 (見圖1B)；而未感染白念珠菌的野生型小鼠，舌體正常，評分0分 (見圖1C)。對感染后小鼠舌體菌載量檢測顯示感染白念珠菌后小鼠舌體均可長出白念珠菌，但阻斷IL-22后，小鼠舌體菌載量明顯增多，為1 700 CFU/mL，而未阻斷IL-22小鼠感染白念珠菌后菌載量為980 CFU/mL。注射對照抗體IgG2ακ小鼠與野生型小鼠臨床癥狀及舌體菌載量無差異 (圖片文中未顯示)。

2.2 小鼠頰黏膜局部組織病理學(xué)改變

感染48 h后，觀察各組小鼠頰黏膜組織病理學(xué)變化可見，IL-22被阻斷的感染組小鼠黏膜表面附有較多菌絲并侵入上皮，伴有上皮細(xì)胞水腫及炎細(xì)胞浸潤 (見圖2A～C)；被感染的野生型小鼠頰黏膜表面亦可見到少量菌絲，但局部菌量少，頰黏膜炎癥反應(yīng)不明顯 (見圖2D～F)；未感染的野生型小鼠可見正常頰黏膜結(jié)構(gòu)，無炎細(xì)胞浸潤 (見圖2G～I(xiàn))。

2.3 小鼠頰黏膜局部細(xì)胞因子表達(dá)情況

感染48 h后，處死各組小鼠，取其頰黏膜行Realtime-PCR檢測發(fā)現(xiàn)：與正常野生型小鼠相比，感染白念珠菌且IL-22被阻斷小鼠的IL-22表達(dá)量升高6.2倍，感染白念珠菌的野生型小鼠IL-22表達(dá)量升高23.7倍。同時(shí)，與對正常野生型小鼠相比，感染白念珠菌且IL-22被阻斷小鼠的TNF-α、CXCL-9/-10/-11表達(dá)量分別為升高18.1、0.8、1.2及0.9倍；感染白念珠菌的野生型小鼠的TNF-α、CXCL-9/-10/-11表達(dá)量分別為升高34.5、1.2、6.1及1.7倍 (見圖3)。

3 討 論

IL-22為IL-10家族的細(xì)胞因子，1999年由Dumoutier等首先報(bào)道[10]。其受體IL-22R是由IL-22R1和IL-10R2組成的異源二聚體，主要分布于非造血干細(xì)胞表面[11-12]。在免疫反應(yīng)中，IL-22首先與IL-22R1結(jié)合，經(jīng)構(gòu)象變化后才能與IL-10R2結(jié)合，進(jìn)而活化JAK (Janus Kinase)和Tyk2 (Tyrosine Kinase 2)引起STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3)磷酸化，繼而引起下游的級聯(lián)反應(yīng)。除此之外，IL-22還可通過激活p38激酶，MEK/ERK (Extracellular Signal-Regulated Kinase)，JNK (Jun Amino-Terminal Kinases)引起下游免疫反應(yīng)[5,13]。

其中很重要的一步，就是募集驅(qū)化因子。趨化因子為一大類介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)相似的低分子量 (8～10 kDa)趨化蛋白，以具有白細(xì)胞趨化活性為特點(diǎn)，可以招募白細(xì)胞到炎癥和感染的部位[14]。如CXCL1、CXCL2、CXCL8可以募集中性粒白細(xì)胞，CCL2、CCL7、CCL13,CXCL9、CXCL10、CXCL11可以募集Th1細(xì)胞，CCL17和CCL22可以募集Th2細(xì)胞,CCL20可以募集Th17細(xì)胞，這些趨化因子募集相對應(yīng)的靶細(xì)胞到達(dá)創(chuàng)傷、缺血和感染部位[15-16]。由于它們在炎癥的條件下被誘導(dǎo)，因此被認(rèn)為在機(jī)體抵抗致病菌的第一線防御中行使其功能。研究證實(shí)，CXCL9、CXCL10、CXCL11對大腸桿菌、單核細(xì)胞增多性李氏菌具有明顯的抗微生物活性[17]。在扁桃體炎中，黏膜局部的CXCL9、CXCL10、CXCL11濃度明顯增高[18]。此外，其對隱球菌、白念珠菌也有抗菌的特性[19]。此外，IL-22 還可誘導(dǎo)抗菌肽如β-防御素2 (HBD2)和S100蛋白的產(chǎn)生[20]。

我們的研究表明，在白念珠菌感染的小鼠模型中，IL-22對口腔黏膜具有保護(hù)作用，IL-22被阻斷的小鼠黏膜破壞更嚴(yán)重，局部菌載量也更多。對頰黏膜細(xì)胞因子的Realtime檢測結(jié)果表明，未感染白念珠菌時(shí)，小鼠IL-22表達(dá)量極低，在局部受白念珠菌感染刺激后，IL-22表達(dá)量上升，但這一過程可被注射AntiIL-22抗體阻斷，小鼠頰黏膜局部的IL-22表達(dá)量依舊極低。與此相對應(yīng)的還有TNF-α的表達(dá)，其與IL-22表達(dá)量變化趨勢一致。而感染白念珠菌后小鼠口腔黏膜的CXCL-9/-10/-11有所上升，但I(xiàn)L-22被抗體阻斷后，CXCL-10的上升幅度有所減少，CXCL-9/-11甚至出現(xiàn)降低，提示IL-22可能通過募集趨化因子引起下游反應(yīng)達(dá)到保護(hù)局部黏膜的目的。

圖1 小鼠舌體感染情況：A.感染白念珠菌且IL-22被阻斷小鼠，B.感染白念珠菌的野生型小鼠，C.正常野生型小鼠 圖2 感染后各組小鼠頰黏膜組織病理改變：A.感染白念珠菌且IL-22被阻斷小鼠頰黏膜 (PAS×40),B.感染白念珠菌且IL-22被阻斷小鼠頰黏膜 (PAS×200),C.感染白念珠菌且IL-22被阻斷小鼠頰黏膜 (PAS×油鏡),D.感染白念珠菌的野生型小鼠頰黏膜 (PAS×40),E.感染白念珠菌的野生型小鼠頰黏膜 (PAS×200),F.感染白念珠菌的野生型小鼠頰黏膜 (PAS×油鏡),G.正常野生型小鼠頰黏膜 (PAS×40),H.正常野生型小鼠頰黏膜 (PAS×200),I.正常野生型小鼠頰黏膜 (PAS×油鏡)(B,E,H中右下角方框內(nèi)為放大顯示部分)

Fig.1 The manifestation of the tough afterC.albicansinfection:A.IL-22 blocked mice withC.albicansinfection,B.Wild type mice withC.albicansinfection,C.Wild type mice Fig.2 Histopathological changes of buccal mucosa:A.Infection of mice which IL-22 were blocked,PAS×40;B.Infection of mice which IL-22 were blocked,PAS×200;C.Infection of mice which IL-22 were blocked,PAS×oil immersion lens;D.Infection of wild type mice,PAS×40;E.Infection of wild type mice,PAS×200;F.Infection of wild type mice,PAS×oil immersion lens;G.Wild type mice,PAS×40;H.Wild type mice,PAS×200;I.Wild type mice,PAS×oil immersion lens (The picture in the bottom frame of B,E,H indicates the zoom in part)

圖3 各組細(xì)胞因子表達(dá)差異：A.感染白念珠菌且IL-22被阻斷小鼠，B.感染白念珠菌的野生型小鼠，C.正常野生型小鼠

Fig.3 The cytokine changes in each group:A.IL-22 blocked mice withC.albicansinfection,B.Wild type mice withC.albicansinfection,C.Wild type mice

本研究通過建立小鼠口腔白念珠菌感染模型，并采用抗體阻斷的方式研究IL-22在白念珠菌感染小鼠口腔中的作用及其可能機(jī)制，豐富了IL-22的功能范圍，也為其臨床應(yīng)用提供了新的依據(jù)。

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The role of IL-22 in oral candidiasis which caused byCandidaalbicans

TAN Jing-wen1,HE Wen-jing1,GAO Zhi-qin1,YANG Hong1,ZHANG Chu-guang2,LIANG Yu-lin2,YANG Lian-juan1

(1.Departmentofmedicalmycology,ShanghaiDermatologyHospital,Shanghai200443;2.Departmentofpathematology,ShanghaiDermatologyHospital,Shanghai200443)

Objective To evaluate the role of IL-22 in oral candidiasis which caused byCandidaalbicans.Methods We built the models of experimental oral candidiasis in BALB/c mice firstly.Then we used anti-IL-22 antibody to block the immune response.After that we estimate the manifestation of acute oral candidiasis and colonization ofC.albicansin the tongue.Histopathological study and the cytokine changes of buccal mucosa were detected either.Results Mice which IL-22 were blocked showed thick pseudomembranous substance on the tongue and the fungal burden reached 1 700 CFU/mL.The normal mice showed thin pseudomembranous substance and the fungal burden was 980 CFU/mL.Histopathological examinations showed hyphae existing on the mucosal surface and invading epithelium accompanied by destruction of epithelium and inflammatory infiltration in the IL-22 blocked mice.Meanwhile,in the normal mice,there were less hyphae existing and rare inflammation.The Real-time PCR showed that compare with wild mice,the fold change of TNF-α,CXCL-9,CXCL-10,CXCL-11 in IL-22 blocked one were 18.1,0.8,1.2 and 0.9 times.Which were 34.5,1.2,6.1and 1.7 times in IL-22 normal mice.Conclusions IL-22 can be protective through enhance the secretion of chemotactic factor in oral candidiasis which caused byC.albicans.

Oral candidiasis;Candidaalbicans;IL-22

207-211]

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會面上項(xiàng)目 (20140388)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 (81573063)

譚靜文，女 (漢族)，碩士，住院醫(yī)師.E-mail:cecilia_88903@163.com

楊連娟,E-mail:lianjuan_yang@aliyun.com

R 519.3

A

1673-3827(2017)12-0207-05

2016-12-18 [本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮