丁美玉 亓 超 姜相君*大連醫(yī)科大學附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)二科(660) 普外科

胃癌組織中Nupr1的表達及其臨床意義

丁美玉1亓 超2姜相君1*
大連醫(yī)科大學附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)二科1(266011) 普外科2

背景：胃癌的發(fā)病率和死亡率在全球居高不下，因此亟需探索胃癌診斷和治療的新靶點。核蛋白1(Nupr1)具有多種生物學功能，尤其是在惡性腫瘤發(fā)生、進展過程中的作用突出。目的：探討Nupr1在胃癌中的表達情況及其臨床意義。方法：利用實時熒光定量PCR檢測72例胃癌組織及其配對癌旁組織中的Nupr1 mRNA表達，以蛋白質印跡法和免疫組化技術檢測Nupr1蛋白表達及其細胞定位，分析Nupr1表達與胃癌臨床病理特征的關系。結果：胃癌組織中Nupr1 mRNA和蛋白表達均顯著高于癌旁組織(P<0.05)，兩者表達變化趨勢相一致。Nupr1蛋白主要表達于細胞質，細胞核內(nèi)也可見少量表達。胃癌組織中的Nupr1 mRNA表達與腫瘤體積、分化程度、病理類型、Bormann分型、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期顯著相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤部位無明顯相關性(P>0.05)。結論：Nupr1在胃癌組織中高表達并可能與腫瘤侵襲、轉移、進展相關，可作為胃癌早期診斷和預后評估的新標記物，并可能成為胃癌治療的潛在靶點。

胃腫瘤； 疾病惡化； 核蛋白類； 實時聚合酶鏈反應； 印跡法，蛋白質； 免疫組織化學

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，位列全球惡性腫瘤發(fā)病率的第4位，在我國的發(fā)病率和死亡率分別居于第2位和第3位[1-2]。目前胃癌的有效治療手段有限，單純手術治療的總體生存率只有20%左右，放療和化療亦無明顯生存優(yōu)勢[3]。因此，亟需探索診斷和治療胃癌的新技術和新靶點。

核蛋白1(nuclear protein 1, Nupr1)又稱p8或com1(candidate of metastasis-1)，具有核定位信號序列(nuclear localization sequence, NLS)，是一種腫瘤相關應激分子，最先是從急性胰腺炎大鼠的胰腺腺泡細胞中被克隆證實并命名[4-6]。Nupr1具有轉錄活性，已被證實在多種惡性腫瘤的發(fā)生、進展和轉移過程中發(fā)揮重要作用[7]，但有關其在胃癌中的表達及其作用機制的研究鮮見。本研究旨在探討Nupr1在胃癌中的表達情況及其臨床意義，以期為胃癌的臨床診治提供新思路。

材料與方法

一、標本來源

收集2015年7月—2016年6月在大連醫(yī)科大學附屬青島市市立醫(yī)院普外科手術切除的胃癌組織標本(癌灶中央非壞死區(qū)域)72例及其配對癌旁組織標本(距癌組織邊緣5 cm以上)72例，標本取下后立即置于RNA保存液中，-80 ℃保存，用于后續(xù)實驗。所有癌組織標本均經(jīng)2名資深病理科醫(yī)師確診為原發(fā)性胃癌。標本來源病例中男性56例，女性16例，年齡43～89歲，平均年齡(61.11±10.16)歲，中位年齡60歲；術前未接受任何抗腫瘤治療，術中均行淋巴結清掃，臨床資料完整。研究方案經(jīng)青島醫(yī)學會倫理委員會批準，標本使用取得患者知情同意。

二、方法

1. 實時熒光定量PCR檢測Nupr1 mRNA表達：將胃癌和癌旁組織充分研磨后，以總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取總RNA，以逆轉錄試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]合成cDNA，以之為模板行實時熒光定量PCR。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，Nupr1引物序列：F 5’-GAC AGA CAA AGC GTT AGG AGA A-3’，R 5’-GGA GTC AGA GGT GAA GTG GG-3’；β-actin(內(nèi)參)引物序列：F 5’-CTT AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G-3’，R 5’-CTG TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3’。反應體系含cDNA模板1 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、SYBR GREEN Master Mix 10 μL(北京索萊寶科技有限公司)，以雙蒸水補足至20 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。每一樣本均設3個復孔。采用2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。

2. 蛋白質印跡法檢測Nupr1蛋白表達：以RIPA裂解液和PMSF裂解、抽提胃癌和癌旁組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度?？偟鞍咨蠘?，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉膜、封閉后，加入兔抗人Nupr1一抗(Abcam plc.，1∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加入HRP標記的二抗羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌后ECL化學發(fā)光試劑自顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以Gel-Pro Analyzer軟件分析目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶光密度值，計算目的蛋白相對表達量。

3. 免疫組化染色檢測Nupr1蛋白表達及其細胞定位：胃癌和癌旁組織病理蠟塊4 μm連續(xù)切片，使用SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)行免疫組化染色。病理切片常規(guī)脫蠟、水化，高壓抗原修復，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉，滴加Nupr1一抗(Proteintech Group，1∶150)，37 ℃孵育3 h，PBS洗滌后滴加生物素標記的二抗，37 ℃孵育15 min，PBS洗滌后滴加HRP標記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min，PBS洗滌后DAB染色，自來水沖洗終止染色，蘇木精復染，脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察。

結果判定：在細胞核或細胞質中觀察到淡黃色至黃褐色顆粒為陽性細胞。于200倍視野下隨機觀察至少5個視野，采用半定量積分法進行免疫組化評分，總分為染色強度評分與陽性細胞率評分之積。染色強度評分：未染色視為陰性，計0分；淡黃色計1分；黃色計2分；黃褐色計3分。陽性細胞率評分：<10% 視為陰性，計0分；10%～25%計1分；26%～50%計2分；>50%計3分?？偡?分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，>6 分為強陽性(+++)。由2名病理科主治醫(yī)師獨立閱片并進行判定，評分不一致時取均值。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、Nupr1 mRNA表達

實時熒光定量PCR繪制的熔解曲線表明目的片段特異性擴增，陰性對照無擴增曲線，可排除污染因素影響。胃癌組織Nupr1 mRNA相對表達量為2.10±0.60，明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=15.499，P=0.000)。

二、Nupr1蛋白表達

蛋白質印跡法結果顯示，胃癌組織Nupr1蛋白相對表達量為2.06±0.54，明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=16.531，P=0.000)(圖1)。胃癌組織中Nupr1蛋白表達與其mRNA表達的變化趨勢相一致，均顯著高于癌旁組織。

1 Da=0.992 1 u

三、免疫組化染色

免疫組化染色結果顯示，胃癌和癌旁組織中的Nupr1蛋白均主要表達于細胞質，細胞核內(nèi)也可見少量表達(圖2)。胃癌組織中Nupr1表達陰性、弱陽性、中等陽性和強陽性例數(shù)分別為8例、18例、20例和26例，陽性表達率為88.9%(64/72)；癌旁組織中Nupr1表達陰性、弱陽性、中等陽性和強陽性例數(shù)分別為57例、10例、5例和0例，陽性表達率為20.8%(15/72)。胃癌組織中的Nupr1表達明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=67.331，P=0.000)。

圖2 胃癌和癌旁組織Nupr1蛋白表達(免疫組化染色)

四、胃癌組織Nupr1表達與胃癌臨床病理特征的關系

統(tǒng)計學分析顯示，胃癌組織中的Nupr1 mRNA表達與腫瘤體積、分化程度、病理類型、Bormann分型、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期顯著相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤部位無明顯相關性(P>0.05)(表1)。

表1 胃癌組織Nupr1 mRNA表達與胃癌臨床病理特征的關系

臨床病理特征例數(shù)Nupr1mRNA相對表達量P值性別 男562．06±0．570．410 女162．21±0．71年齡 <60歲302．01±0．520．153 ≥60歲422．22±0．69腫瘤直徑 <5cm582．03±0．610．046 ≥5cm142．38±0．46腫瘤部位 胃底112．14±0．780．944 胃體262．07±0．60 胃竇352．10±0．55分化程度 高/中分化301．93±0．530．041 低分化422．22±0．62病理類型 管狀/乳頭狀腺癌561．98±0．570．020 印戒細胞癌/黏液腺癌162．49±0．53Bormann分型 息肉型/局限潰瘍型211．79±0．410．040 浸潤潰瘍型/彌漫浸潤型512．22±0．63T分期 T1+T2251．77±0．480．000 T3+T4472．27±0．59N分期 N0+N1491．94±0．560．010 N2+N3232．42±0．57遠處轉移 無672．05±0．580．027 有52．66±0．56TNM分期 Ⅰ+Ⅱ381．72±0．330．010 Ⅲ+Ⅳ342．52±0．54

討 論

胃癌因具有癌細胞增殖快、轉移能力強的特點，致使很多患者在確診時已處于疾病晚期，50歲以上的患者5年生存率不超過28%[8]。近年關于胃癌病因和治療方面的研究已取得較大進展，然而目前臨床治療仍無法達到腫瘤病變完全緩解的目標，因此需要探索新的治療靶點以指導胃癌的臨床治療。

機體對于微環(huán)境改變?nèi)缛毖?、損傷、血清饑餓等可產(chǎn)生相應的細胞應激反應，從而適應環(huán)境，保證細胞正常生長和功能。人類Nupr1基因定位于染色體16p11.2，其編碼蛋白是一個廣泛表達的應激相關分子，生化特征類似于高遷移率族蛋白(high mobility group, HMG)[9]。Nupr1具有廣泛的生物學功能，包括抗炎[10]、細胞周期調(diào)控[11]、自噬[12]、抑制細胞凋亡[13]等，其介導的細胞應激反應是腫瘤形成的重要因素[14]。越來越多的研究表明，Nupr1在多種惡性腫瘤組織中與正常組織相比存在差異表達，包括胰腺癌[15]、肝細胞癌[16-17]、乳腺癌[18]、結直腸癌[19]、非小細胞肺癌[20]、口腔鱗狀細胞癌[21]、前列腺癌[22-23]、甲狀腺乳頭狀癌[24]等，參與調(diào)控腫瘤發(fā)生和進展。Nupr1在腫瘤中的作用呈雙向性，既可表現(xiàn)為促進腫瘤生長、增強腫瘤侵襲、轉移能力，亦可能對腫瘤進展發(fā)揮抑制作用，如乳腺癌中Nupr1低表達與腫瘤轉移、復發(fā)相關[18]；進展期結直腸癌中的Nupr1表達水平較早期結直腸癌顯著降低[19]；前列腺癌中的Nupr1表達與腫瘤細胞生長及其侵襲性呈負相關，發(fā)揮抑癌作用[22-23]。此外，Nupr1還參與腫瘤耐藥性的產(chǎn)生，如胰腺導管腺癌對吉西他濱的多重耐藥與Nupr1參與的應激反應依賴性信號通路有關[25]。

鑒于Nupr1在不同組織以及同一組織不同細胞定位中的表達量不盡相同，本研究利用實時熒光定量PCR、蛋白質印跡法和免疫組化染色分別檢測了胃癌和癌旁組織中Nupr1在基因和蛋白水平的表達及其細胞定位，結果顯示胃癌組織中Nupr1 mRNA和蛋白表達均顯著高于癌旁組織，兩者的表達變化趨勢相一致，提示胃癌和癌旁組織中的Nupr1表達水平在基因轉錄階段已存在差異，在轉錄和翻譯過程中保持相對穩(wěn)定。以上研究結果表明，Nupr1可能參與了胃癌的發(fā)生、進展過程。

本研究進一步探討了Nupr1表達與胃癌臨床病理特征的關系，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的Nupr1 mRNA表達與腫瘤體積、分化程度、病理類型、Bormann分型、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期顯著相關，腫瘤體積大、低分化、浸潤深、存在淋巴結和遠處轉移、TNM分期較晚的患者，Nupr1表達顯著增高，與既往研究結果相似[26]?；谝陨辖Y果可初步推測，Nupr1高表達與胃癌進展相關，提示患者的不良預后。

盡管Nupr1蛋白含有一個典型的NLS序列，是一種小分子核蛋白，但其細胞定位可因組織類型和細胞生長狀態(tài)不同而發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)一些腫瘤組織如結直腸癌[19]、低分化甲狀腺乳頭狀癌[24]中的Nupr1蛋白可發(fā)生明顯的細胞質轉位，此種細胞 定位改變可能受Nupr1 NSL序列乙?；恼{(diào)節(jié)[27]。本研究免疫組化染色顯示胃癌和癌旁組織中的Nupr1蛋白均發(fā)生明顯的細胞質轉位，但細胞核內(nèi)也可見少量表達，該定位特點與邢軍等[26]的研究發(fā)現(xiàn)Nupr1蛋白在胃癌和癌旁組織中的表達均多在細胞核內(nèi)相反。Nupr1在胃癌細胞中的作用部位及其機制仍有待進一步研究。

綜上所述， Nupr1在胃癌組織中高表達并可能與腫瘤進展相關，可作為胃癌早期診斷和預后評估的新標記物。Lopez等[28]發(fā)現(xiàn)了Nupr1的同源蛋白Nupr1L，后者作為一種新的p53誘導基因，可在轉錄水平負向調(diào)控Nupr1表達。在胃癌的臨床治療過程中，如能有效抑制Nupr1表達，或許能延緩胃癌進展，改善患者預后，因此Nupr1有望成為胃癌的潛在治療靶點。Nupr1參與胃癌發(fā)生、進展、侵襲、轉移的作用機制有待進一步研究加以闡明。

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(2017-02-03收稿；2017-03-22修回)

Expression of Nupr1 in Gastric Cancer and its Clinical Significance

DINGMeiyu1,QIChao2,JIANGXiangjun1.
1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofGeneralSurgery,QingdaoMunicipalHospital,DalianMedicalUniversity,Qingdao,ShandongProvince(266011)

JIANG Xiangjun, Email: drjxj@163.com

Stomach Neoplasms; Disease Progression; Nucleoproteins; Real-Time Polymerase Chain Reaction; Blotting, Western; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.08.004

*本文通信作者，Email: drjxj@163.com

Background: The morbidity and mortality of gastric cancer remain high worldwide, and it is urgent to explore new targets for the diagnosis and treatment of gastric cancer. Nuclear protein 1 (Nupr1) has a variety of biological functions, especially in the tumorigenesis and development of the malignancies. Aims: To investigate the expression and clinical significance of Nupr1 in gastric cancer. Methods: Quantitative RT-PCR was used to determine the mRNA expression of Nupr1 in 72 cases of gastric cancerous tissue and the paired paracancerous tissue. Western blotting and immunohisto-chemistry were employed to detect the protein expression and cellular localization of Nupr1. The correlation of Nupr1 with the clinicopathological characteristics of gastric cancer was analyzed. Results: Expressions of Nupr1 mRNA and protein in gastric cancer were both significantly higher than those in paracancerous tissue (P<0.05), and their expressions were coincident. Nupr1 protein was expressed mainly in cytoplasm, and the nuclear expression was reduced. Expression of Nupr1 mRNA in gastric cancer was significantly correlated with tumor size, differentiation, pathological type, Bormann’s classification, depth of invasion, lymph node and distant metastases and TNM staging (P<0.05), and was not correlated with gender, age and site of tumor (P>0.05). Conclusions: Nupr1 is overexpressed and correlated with invasion, metastasis and progression of gastric cancer. It can be used as a novel biomarker for early diagnosis and prognosis evaluation, and as a potential target for treatment of gastric cancer.