徐 佳，劉朵朵，馬向東，陳必良

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710032)

子癇前期患者胎盤(pán)組織p-p38與caspase-3、8的表達(dá)及臨床意義

徐 佳，劉朵朵，馬向東，陳必良

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710032)

目的 研究p-p38、caspase-3、caspase-8在子癇前期患者胎盤(pán)中的表達(dá)及臨床意義。方法 選擇2016年 6月至2017年 2月在西京醫(yī)院婦產(chǎn)科住院分娩的孕婦80例，分為子癇前期組40例，正常妊娠組40例，采用免疫組化法及蛋白印跡法檢測(cè)子癇前期患者和正常妊娠婦女胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞中p-p38、caspase-3、caspase-8的表達(dá)。結(jié)果 p-p38、caspase3、caspase8在子癇前期胎盤(pán)和正常妊娠胎盤(pán)中均有表達(dá)；在子癇前期患者胎盤(pán)中p-p38、caspase-3、caspase-8表達(dá)與正常胎盤(pán)相比顯著升高(2.08±0.04vs 1.44±0.04、1.72±0.03 vs 1.12±0.06、1.59±0.04 vs 1.18±0.01，t值分別為71、60、61，均P<0.01)。結(jié)論 胎盤(pán)組織中p-p38、caspase-3、caspase-8的異常表達(dá)可能促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加，推進(jìn)子癇前期的發(fā)生發(fā)展。

p-p38;caspase-3;caspase-8；子癇前期；滋養(yǎng)細(xì)胞

子癇前期(preeclampsia,PE)是產(chǎn)科常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病死率升高的主要原因[1]。研究表明子癇前期胎盤(pán)中滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過(guò)多，導(dǎo)致其浸潤(rùn)功能下降、浸潤(rùn)過(guò)淺即胎盤(pán)淺著床，最終引起胎盤(pán)灌注不足、缺血缺氧，因此子癇前期的發(fā)生及進(jìn)展與滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，但調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚[2]。研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK通過(guò)多種途徑在炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，凋亡蛋白caspase-3、caspase-8是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白酶，均參與細(xì)胞凋亡凋控[3]。本研究探討子癇前期患者胎盤(pán)組織中p-p38及凋亡蛋白caspase-3、caspase-8的表達(dá)，為子癇前期的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2016年6月至2017年2月第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)的子癇前期患者40例，平均孕周為(33.4±3.1)周，平均年齡為(26.8±3.8)歲；選擇同期行擇期剖宮產(chǎn)的正常足月單胎妊娠孕婦40例為對(duì)照，平均孕周為(39.1±0.7)周，平均年齡(27.6±3.2)歲。子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照謝幸主編的第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》。兩組孕婦排除標(biāo)準(zhǔn)：多胎妊娠、原發(fā)性高血壓、妊娠期糖尿病、肝腎疾病、感染、妊娠合并免疫系統(tǒng)疾病史等。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集及處理

全部組織標(biāo)本均在剖宮產(chǎn)手術(shù)中收集，待胎盤(pán)娩出后，立即從胎盤(pán)母體面中央處取材，取胎盤(pán)組織約1cm×1cm×1cm大小,快速在冷生理鹽水中清洗3次，放入EP管中，置于液氮罐內(nèi)；另取0.5cm×0.5cm組織，以PBS緩沖液清洗3次后放入10%中性福爾馬林液固定，按常規(guī)制備成石蠟塊，4℃冰箱保存。整個(gè)操作過(guò)程的時(shí)間在15min以?xún)?nèi)完成。

1.2.2免疫組化檢測(cè)胎盤(pán)組織中p-p38、caspase-3、caspase-8的定位表達(dá)

采用免疫組化SP法。p-p38、caspase-3、caspase-8免疫組化試劑盒、DAB染色試劑盒由北京中山生物技術(shù)有限公司提供。胎盤(pán)組織固定8h后常規(guī)逐級(jí)脫水，二甲苯透明，浸蠟過(guò)夜，包埋后制成6μm切片。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水合，于枸櫞酸鹽(EDTA)緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，用1%H2O2、0.5%牛血清蛋白(BSA)處理后，加入兔抗人ADAMI9抗體(1：200)，4℃孵育過(guò)夜后，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育30min，DBA(二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水封片。陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本組織細(xì)胞中有(棕)黃色顆粒沉著。根據(jù)棕色反應(yīng)的陽(yáng)性面積比判斷結(jié)果。

1.2.3Western blot法檢測(cè)胎盤(pán)組織中p-p38 及caspase-3、caspase-8

取胎盤(pán)組織 100mg置入裂解液中,冰浴勻漿,裂解液含 5%N P-40,10mmol/L Tris HCl pH7.4,150mmol/LNaCl,1mmol/L EDTA,1mmol/L Na3VO4pH10.0,1μg/mL aprotinin,100μg/mL PMSF。用Bradford 法檢測(cè)蛋白濃度。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，上樣量每孔30μg，濃縮膠電泳電壓100V，分離膠電泳電壓120V。半干轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜上，70mA ,35min。TBS T洗脫2次，每次10min，10%脫脂奶粉室溫封閉 3h ,加入 2.5%BSA稀釋的p-p38以及caspase-3、caspase-8、兔抗人多克隆抗體(1：400),4 ℃孵育過(guò)夜 , TBST 漂洗3 次每次10min后 ,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG(1：3 000),37孵育1h ,TBST洗3次，每次10min。 按照ECL檢測(cè)試劑盒(Pierce公司)說(shuō)明進(jìn)行顯色、曝光、X光片沖洗，將X光片透視掃描后，印跡的灰度值經(jīng)Gel-Pro Analyzer軟件分析 (United Bio公司)，并以actin的灰度值作為內(nèi)參進(jìn)行結(jié)果的均一。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。p-p38、caspase-3、caspase-8表達(dá)水平組間比較，用ANOVA方差分析和t檢驗(yàn),以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1兩組孕婦胎盤(pán)中p-p38、caspase-3、caspase-8的免疫組化染色

鏡下，p-p38和caspase-3、caspase-8在子癇前期組細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞中可見(jiàn)大量棕黃色顆粒的陽(yáng)性表達(dá)，而正常妊娠組內(nèi)僅可見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)。通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，p-p38、caspase-3、caspase-8定位于胎盤(pán)組織中細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，在絨毛間質(zhì)細(xì)胞中也可見(jiàn)少量表達(dá)，陽(yáng)性定位在細(xì)胞漿，見(jiàn)圖1。采用Mias圖象分析系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行定量分析,在子癇前期組和對(duì)照組之間，p-p38、caspase-3、caspase-8的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.08±0.01 vs 0.02±0.004，0.07±0.01 vs 0.01±0.002，0.09±0.02 vs 0.02±0.003，t值分別為37.5、40.0、23.0，均P<0.01)。

注：圖A、C、E正常組胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞p-p38、caspase-3、caspase-8的表達(dá)(×40，SAB法染色)； 圖B、D、F子癇前期組胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞p-p38、caspase-3、caspase-8的表達(dá)顯著增強(qiáng)(×40，SAB法染色)；G 陰性對(duì)照。

表1 p-p38、caspase-3、caspase-8在兩組胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞中陽(yáng)性面積表達(dá)比值

注：*與正常組比較P<0.01，有顯著性意義。

2.2Western blot檢測(cè)胎盤(pán)組織中p-p38、caspase-3、caspase-8的表達(dá)

子癇前期胎盤(pán)組織p-p38蛋白水平較正常妊娠組增高，顯著高于其在正常妊娠組的表達(dá)(2.18±0.04 vs 1.21±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。子癇前期組胎盤(pán)組織中caspase-3、caspase-8蛋白表達(dá)水平顯著高于正常妊娠組(1.72±0.03 vs 0.96±0.06、1.59±0.04 vs 0.98±0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 兩組孕婦胎盤(pán)組織中p-p38的蛋白表達(dá)水平

圖3 兩組孕婦胎盤(pán)組織中caspase-3的蛋白表達(dá)水平

圖4 兩組孕婦胎盤(pán)組織中caspase-8的蛋白表達(dá)水平

表2 p-p38 、caspase-3、caspase-8在胎盤(pán)組織中的表達(dá)

注：*與正常組比較P<0.01，有顯著性意義。

3 討論

3.1子癇前期的研究背景

子癇前期是產(chǎn)科常見(jiàn)的妊娠期特有疾病，嚴(yán)重威脅母嬰健康，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒病率和死亡的重要原因之一。在妊娠過(guò)程中，胎盤(pán)的功能是通過(guò)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等實(shí)現(xiàn)的。由胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加引起各種病理妊娠多有報(bào)道，研究認(rèn)為當(dāng)患者胎盤(pán)組織中多種因素引起胎盤(pán)灌流不足，胎盤(pán)缺血缺氧，促使滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度凋亡，引起胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力下降，導(dǎo)致胎盤(pán)淺著床[4]，進(jìn)一步使胎盤(pán)血流減少，滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡急劇增加，導(dǎo)致病理妊娠如子癇前期、胎兒生長(zhǎng)受限等。因此，子癇前期的發(fā)病與滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡機(jī)制密切相關(guān)。p38MAPK是重要的細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)通路，內(nèi)外源性刺激可激活p38磷酸化，參與細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞基因表達(dá)以及促進(jìn)細(xì)胞增殖及分化等，研究證實(shí)激活p38MAPK磷酸化能夠調(diào)節(jié)凋亡前期信號(hào)，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂、凋亡壞死[5-6]。Caspase家族是一組在細(xì)胞凋亡機(jī)制中發(fā)揮重要作用的蛋白酶，又稱(chēng)為“天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶”。因此，對(duì)子癇前期胎盤(pán)組織中凋亡機(jī)制的研究，可以為子癇前期的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)。

3.2 p-p38和caspase-3、casepase-8與子癇前期發(fā)病關(guān)系研究

本研究通過(guò)免疫組化分析p-p38和caspase-3、caspse-8在胎盤(pán)組織中表達(dá)，在子癇前期組細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞中均可見(jiàn)大量棕黃色顆粒的陽(yáng)性細(xì)胞。通過(guò)對(duì)其陽(yáng)性面積分析可得，p-p38和caspase-3、caspse-8在子癇前期中的表達(dá)且顯著高于正常孕婦對(duì)照組。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)方法同樣證實(shí)p-p38和caspase-3、caspse-8在子癇前期患者胎盤(pán)組織中高表達(dá)，且顯著高于對(duì)照組。本研究中子癇前期胎盤(pán)組織中caspase-3、caspse-8增高提示，在子癇前期中滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)了子癇前期發(fā)病機(jī)制中滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加的假說(shuō)，與國(guó)外學(xué)者所類(lèi)似研究得到的結(jié)果相一致[7]。研究結(jié)果表明，在子癇前期患者胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過(guò)程中，p38磷酸化后通過(guò)，激活caspase家族活性，激活啟動(dòng)caspase 8，促使效應(yīng)caspase 3激活，誘導(dǎo)Bax/Bcl-2增加、Cox-2上調(diào)，使細(xì)胞DNA修復(fù)功能喪失，失去正常增殖分化能力形成凋亡[8]。

本研究中子癇前期胎盤(pán)組織中p-p38顯著增加，提示子癇前期胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞缺血缺氧引起病理?yè)p傷，可激活p38磷酸化，進(jìn)而啟動(dòng)跨核被膜調(diào)控，可刺激機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多炎性因子如TNF-α、IL-6、IL-4等，同時(shí)調(diào)節(jié)鈣離子泵，使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損和功能障礙，通過(guò)增強(qiáng)c-myc、c-jun和c-fos基因表達(dá)、磷酸化p53，參與Fas/FasL的表達(dá)，誘導(dǎo)caspase家族的啟動(dòng)，參與和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[9]。

由此我們可以推測(cè)，子癇前期胎盤(pán)血流灌注不足，滋養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)缺血缺氧，激活p-p38磷酸化，進(jìn)而激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)者caspase-8的表達(dá)增加，通過(guò)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活細(xì)胞凋亡途徑，引起執(zhí)行者caspase-3隨之增加，從而引起滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加。這種改變一方面既可以解釋為子癇前期的病因，目前已有研究發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦在臨床癥狀出現(xiàn)以前，胎盤(pán)絨毛中已有缺氧、凋亡增加；而另一方面，在誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)多凋亡，加重胎盤(pán)功能障礙，促進(jìn)子癇前期的發(fā)展[10]。

綜上所述，p-p38、caspase-3、caspase-8在胎盤(pán)組織的異常表達(dá)與滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡可能是子癇前期發(fā)病因素之一，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步探討p-p38、caspase-3、caspase-8在子癇前期動(dòng)物模型中的表達(dá)，為預(yù)防和治療子癇前期提供新的理論依據(jù)。

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[專(zhuān)業(yè)責(zé)任編輯：楊文方]

Expressions and significance of p-p38, caspase-3 and caspase-8 in placenta of patients with preeclampsia

XU Jia, LIU Duo-duo, MA Xiang-dong, CHEN bi-liang

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China)

Objective To investigate the expressions and significance of p-p38, caspase-3 and caspase-8 in placenta of patients with preeclampsia (PE). Methods Totally 80 pregnant women delivering in department of gynecology and obstetrics in Xijing Hospital during June 2016 to February 2017 were enrolled in study, and they were divided into PE group (40 cases) and control group (40 cases). P-p38, caspase-3 and caspase-8 in placenta of cases in two groups were detected with immunohistochemistry and western blot. Results P-p38, caspase-3 and caspase-8 were all expressed in placenta of cases in two groups. The levels of p-p38, caspase-3 and caspase-8 in cases in PE group were significantly higher than those in control group (2.18±0.04 vs 1.44±0.04, 1.72±0.03 vs 1.12±0.06, 1.59±0.04 vs 1.18±0.01) (tvalue was 71, 60 and 61, respectively, allP<0.01). Conclusion The abnormal expressions of p-p38, caspase-3 and caspase-8 in placenta are related to the increase of trophoblast apoptosis, and they may participate the pathogenesis of PE.

p-p38; caspase-3; caspase-8; preeclampsia (PE); trophoblast

2017-03-06

徐 佳(1984—)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)與婦科腫瘤的研究。

陳必良，教授/博導(dǎo)。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.08.024

R714.2

A

1673-5293(2017)08-0961-04