戰(zhàn)新梅，管世銘，張玉喜

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

牡丹PsSPL3基因的克隆和表達(dá)特性分析

戰(zhàn)新梅，管世銘，張玉喜

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)轉(zhuǎn)錄因子在植物多個(gè)生理過程中發(fā)揮重要的生理功能，為了研究其在牡丹花芽休眠進(jìn)程中的作用機(jī)理，采用RACE方法，從牡丹花芽中克隆得到了一個(gè)SPL基因。該基因全長cDNA 1 057 bp，完整開放閱讀框?yàn)?49 bp，編碼182個(gè)氨基酸，Blast分析表明，編碼的氨基酸序列中具有SBP-box基因家族所特有的SBP-box保守結(jié)構(gòu)域。與擬南芥已知SPLs蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹結(jié)果表明，牡丹SPL蛋白與AtSPL3聚為一支，該基因被命名為PsSPL3。生物軟件預(yù)測PsSPL3蛋白分子量為20.349 4 kDa，理論等電點(diǎn)為9.62。同源性分析了牡丹PsSPL3與其他已知植物的SPL3，相似性為47.98%～69.46%，其中與白樺的SPL3蛋白相似性最高，為69.46%。實(shí)時(shí)定量PCR分析PsSPL3基因在初花期牡丹不同組織中和花芽休眠過程中的表達(dá)水平，結(jié)果表明，PsSPL3基因在不同組織中表達(dá)差異較大，其中在根中轉(zhuǎn)錄水平最高，在莖和花瓣中次之；PsSPL3基因在休眠進(jìn)程中的轉(zhuǎn)錄水平呈先上升后下降趨勢(shì)，其中低溫處理14 d時(shí)，PsSPL3基因的表達(dá)量達(dá)到最高。低溫7 d結(jié)合外源施加GA3的牡丹花芽中PsSPL3基因的表達(dá)量顯著增加，推測PsSPL3基因的轉(zhuǎn)錄受GA3誘導(dǎo)來促進(jìn)牡丹花芽內(nèi)休眠解除的進(jìn)程。

牡丹；PsSPL3；RACE；實(shí)時(shí)定量PCR；表達(dá)模式

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是綠色植物中非常特殊的一類轉(zhuǎn)錄因子，最早由Huijser等[1]從金魚草(Antirrhinummajus)的花序cDNA文庫中篩選到，在SPL蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，存在著一個(gè)大約由80個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域，稱為SBP結(jié)構(gòu)域。Cardon等[2]在擬南芥中克隆了許多個(gè)能夠編碼SBP蛋白的相關(guān)基因，其中擬南芥SPL3基因與金魚草的SBP1基因有非常高的同源性特征，這些SPL基因均可以與APETALA1(AP1) 基因的啟動(dòng)子區(qū)域通過SBP結(jié)構(gòu)域發(fā)生特異性的相互結(jié)合。SPL基因家族成員廣泛存在于許多植物中，如玉米[3]、水稻[4]、番茄[5]、草莓[6]、陸地棉[7]、葡萄[8-9]、枳[10]、樺樹[11-12]等。SPL轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物胚胎發(fā)育、葉片發(fā)育[13]、發(fā)育階段轉(zhuǎn)變、花和果實(shí)發(fā)育[13-14]、育性、頂端優(yōu)勢(shì)、花青素積累、赤霉素響應(yīng)[15]、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及體內(nèi)銅離子穩(wěn)態(tài)平衡等方面均發(fā)揮重要作用[16]。SPL基因主要通過調(diào)控花分生組織特征基因LEAFY(LFY)影響花序的形態(tài)建成[17]。

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)牡丹生物學(xué)課題組在牡丹(Paeoniasuffruticosa)休眠方面，做了大量的研究工作[18-22]。Gai等[20]研究了與牡丹休眠解除有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，篩選到了包括類SPL基因片段的176個(gè)轉(zhuǎn)錄因子[21]。本試驗(yàn)研究了牡丹中的SPL家族成員，通過RACE擴(kuò)增得到了PsSPL3基因的全長cDNA，研究了PsSPL3基因在牡丹不同組織的表達(dá)模式，及休眠進(jìn)程中牡丹花芽中PsSPL3基因的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步解析SBP-box基因家族在牡丹休眠中的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

供試材料為牡丹品種魯菏紅(由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理研究室提供)。第1組處理：取4月初處于初花期的牡丹根、莖、葉、萼片、花瓣和雄蕊共6種組織材料，液氮冷凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?。?組處理：11月中下旬，此時(shí)日最低氣溫可達(dá)10 ℃，此時(shí)處理定為0 d，作為對(duì)照，此后選取一定數(shù)量的植株轉(zhuǎn)移冷庫中(4 ℃)，之后每隔7 d將其轉(zhuǎn)入溫室(25 ℃)并取樣，一共5個(gè)低溫處理時(shí)間(0，7，14，21，28 d)，剝?nèi)[片后，液氮速凍，-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。?組處理：低溫處理7 d移入溫室后外施500 mg/L GA3處理，20%乙醇作為對(duì)照。分別于處理后0，1，3，5 d后，隨機(jī)選取頂芽若干個(gè)，處理同上。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

總RNA提取與cDNA合成參照張璐等[18]方法進(jìn)行。

1.3 RACE擴(kuò)增和實(shí)時(shí)定量PCR

RACE擴(kuò)增按照張璐等[18]方法進(jìn)行(引物序列見表1)。實(shí)時(shí)定量25 μL的 PCR反應(yīng)體系根據(jù)SYBR?Premix DimerEraserTM(TaKaRa)試劑盒配制[19]，牡丹ACTIN基因?yàn)閮?nèi)參，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法[23]。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of the specific primers used in this study

1.4 生物信息學(xué)分析

用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接，ORF finder和Interproscan等工具分別預(yù)測功能域和編碼框，用ProtParam程序進(jìn)行等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)分子量等性質(zhì)的預(yù)測。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast和ClustalW進(jìn)行同源性分析，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Bootstrap=1 000)。

2 結(jié)果與分析

2.1PsSPL3基因全長cDNA序列和氨基酸序列的獲得

由于已知EST的5′端編碼區(qū)完整，因此只需設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增3′端。經(jīng)3′RACE PCR擴(kuò)增，3′ RACE PCR產(chǎn)物大約370 bp(圖1)。SPL基因cDNA全長1 057 bp(圖2)，5′非編碼區(qū)(UTR)長度為135 bp，3′ UTR為373 bp。549 bp的完整的開放閱讀框編碼182個(gè)氨基酸(GenBank accession No.KP314264)，其預(yù)測的PsSPL3蛋白分子式為C860H1430N280O261S15，其分子量為20.349 4 kDa，理論等電點(diǎn)pI為9.62。在NCBI上分析保守結(jié)構(gòu)域，其具有SBP-Box保守結(jié)構(gòu)域，即第58～136個(gè)氨基酸，該結(jié)果符合典型的SBP-box基因家族的結(jié)構(gòu)特征，說明該基因?qū)儆谄渲幸粏T。利用ClustalW軟件將編碼蛋白與擬南芥的SPL氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)(圖3)，其與AtSPL3聚為一組，推測牡丹SPL蛋白和擬南芥AtSPL3在結(jié)構(gòu)和功能上可能有著一定的相似性，該基因被命名為PsSPL3。

M.DL2000 Marker；1.PsSPL3基因的3′-RACE PCR產(chǎn)物。M.DL2000 Marker；1.3′-RACE PCR product.

斜體并加粗表示起始密碼子ATG和終止密碼子TAA；波浪線表示polyA尾；陰影部分為SBP結(jié)構(gòu)域；方框部分為鋅指結(jié)構(gòu)域；單下劃線部分為核定位信號(hào)。Initiation codon is ATG and terminate codon is TAA，italic and bold； polyA tail is marked with wavy line；Conservative regions is shaded area;Part of the box for structure is zinc finger domains;Nuclear localizationsignal is marked by single under line.

圖3 牡丹PsSPL3與擬南芥AtSPLs的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of PsSPL3 and AtSPLs of Arabidopsis thaliana

2.2 PsSPL3蛋白序列的同源性分析與進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用在線軟件ClustalW分析PsSPL3與其他已知植物的SPL3氨基酸序列的同源性(圖4)，結(jié)果表明，PsSPL3與其他已知植物的SPL3相似性為47.98%～69.46%，其中最高的是與白樺的SPL3蛋白相似性，為69.46%，與楊樹的相似性次之，為65.71%，與煙草的SPL3蛋白最低，為47.98%。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，PsSPL3與白樺SPL3先聚到一個(gè)分支，再與楊樹和可可等木本植物形成分支，最后與煙草聚到一起，結(jié)果符合進(jìn)化關(guān)系，與同源性比對(duì)結(jié)果一致。

圖4 牡丹PsSPL3與其他物種SPL3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of PsSPL3 and the known SPL3 proteins in the other plants species

2.3 牡丹PsSPL3基因的表達(dá)模式分析

利用實(shí)時(shí)定量PCR分析PsSPL3基因在牡丹初花期不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果表明，PsSPL3基因在牡丹的不同組織中呈現(xiàn)差異表達(dá)，其中在根中表達(dá)水平最高，在莖和花瓣中次之，在雄蕊和萼片中表達(dá)水平最低(圖5)。

圖5 PsSPL3在牡丹初花期不同組織中的表達(dá)模式Fig.5 The relative expression level of PsSPL3 in different tissues at the early flowering stage of tree peony

分別采用人工低溫0，7，14，21，28 d處理牡丹，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測PsSPL3基因在人工4 ℃低溫解除牡丹花芽休眠過程中的表達(dá)特性(圖6)。結(jié)果顯示，PsSPL3基因的表達(dá)量在休眠進(jìn)程中呈先上升后下降趨勢(shì)，其中低溫處理14 d時(shí)，PsSPL3基因的表達(dá)量達(dá)到最高；低溫處理21 d時(shí)，PsSPL3基因的表達(dá)量雖有下降但仍然維持在比較高的水平；低溫28 d時(shí)，此時(shí)牡丹花芽進(jìn)入了生態(tài)休眠階段[20]，PsSPL3基因的表達(dá)量迅速下降。

圖6 PsSPL3在低溫處理不同時(shí)間的牡丹花芽中的表達(dá)模式Fig.6 The relative expression level of PsSPL3 in tree peony bud after different chilling treatments

在低溫處理7 d后移入溫室，外施GA30，1，3，5 d后取材，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測PsSPL3基因的表達(dá)水平(圖7)。結(jié)果表明，PsSPL3基因在外施GA3的牡丹花芽中的表達(dá)量要顯著高于對(duì)照，推測PsSPL3基因的表達(dá)受GA3誘導(dǎo)來促進(jìn)牡丹花芽內(nèi)休眠解除的進(jìn)程。

*.P<0.05。

3 討論

本研究通過RACE技術(shù)擴(kuò)增得到了PsSPL3基因1 057 bp的全長cDNA序列，Blast分析證明它具有SBP-box基因家族所特有的SBP-box保守結(jié)構(gòu)域。該域含有保守的半胱氨酸和組氨酸組成的2個(gè)鋅指蛋白域及一段核定位信號(hào)。SBP蛋白可以通過該信號(hào)肽序列引導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，從而調(diào)控下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，這是SBP基因家族的典型特征[24]。

SPL基因在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，它會(huì)影響植物的早期胚胎發(fā)育過程[25]、葉片發(fā)育[13]、花器官的發(fā)育[2]、果實(shí)發(fā)育和成熟[13-14]。筆者研究了牡丹PsSPL3基因在不同器官的時(shí)空表達(dá)特征，PsSPL3在營養(yǎng)器官和花器官中均有表達(dá)，其中在根中表達(dá)水平最高，在莖和花瓣中次之，可推測PsSPL3參與牡丹營養(yǎng)器官與花器官的發(fā)育。而朱富勇[26]發(fā)現(xiàn)紫牡丹中PdSPL9在芽中表達(dá)量最高，認(rèn)為PdSPL9可能調(diào)控紫牡丹幼年期向成年期的轉(zhuǎn)變。GhSPL3在棉花的花中表達(dá)量最高[7]，而宋長年等[10]卻發(fā)現(xiàn)Pt-SPL9和Pt-SPL13對(duì)枳的莖和果實(shí)的發(fā)育起著重要作用。葡萄VvSPL9 和VvSPL10可能參與葡萄營養(yǎng)器官與生殖器官的發(fā)育，尤其與葡萄果實(shí)的生長發(fā)育關(guān)系密切[9]。21 d的(4 ℃)低溫積累量是解除牡丹花芽休眠所必需的[20]。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)蜏胤e累14 d時(shí)，PsSPL的表達(dá)量達(dá)到最大值，當(dāng)?shù)蜏?1 d及以后，牡丹花芽內(nèi)休眠得以完全地解除并進(jìn)入了生態(tài)休眠階段，其表達(dá)量減少，說明低溫誘導(dǎo)了PsSPL3基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而促進(jìn)了牡丹花芽內(nèi)休眠的解除。張文娟等[27]認(rèn)為赤霉素可以部分的代替低溫來解除牡丹花芽的休眠，SPL可能與生長素、赤霉素和乙烯等多種激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)[15]。本研究中，PsSPL3在低溫7 d后外施GA3處理的牡丹花芽中的表達(dá)結(jié)果表明，PsSPL3基因?qū)Τ嗝顾赜许憫?yīng)，低溫結(jié)合外施赤霉素可以解除花芽內(nèi)休眠，進(jìn)一步說明PsSPL3基因在牡丹花芽內(nèi)休眠解除過程中起著很重要的作用。

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Cloning and Expression Pattern Analysis ofPsSPL3 in Tree Peony

ZHAN Xinmei，GUAN Shiming，ZHANG Yuxi

(College of Life Sciences，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province，Qingdao 266109，China)

Transcription factor of SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like) plays very important role among many physiological processes of plants.In order to study the mechanism of action，a 1 057 bp full-length cDNA ofPsSPL3 gene was isolated fromPaeoniasuffruticosausing RACE method.Bioinformatic analysis showed that the ORF length ofPsSPL3 was 549 bp which encodes 182 amino acid residues with relative molecular mass of 20.349 4 kDa and the isoelectric point of 9.62.Blast analysis showed that PsSPL3 contained a typical SBP-box structure domain.Evolutionary tree analysis revealed that the putative SPL protein of tree peony and AtSPL3 were clustered in same group，so theSPLgene of tree peony was namedPsSPL3.The homology of amino acid compared with PsSPL3 and other known SPL3 was 47.98%-69.46%，and the homology with BpSPL3 was highest with 69.46%.The expression pattern ofPsSPL3 in different tissues at the early stage of flowering was analyzed by quantitative Real-time PCR(qPCR)，and the results showed that the transcript ofPsSPL3 in the root was the highest，and the lower were in stem and petal.The expression pattern ofPsSPL3 during dormancy release of tree pony showed that the expression ofPsSPL3 gene was first increased and then decreased.When the tree peony flower bud were exposed 14 d chilling，the expression level ofPsSPL3 gene was the highest.The expression ofPsSPL3 gene in the flower buds after 7 d chilling with exogenous application of GA3was significantly higher than that in the control，suggested that the expression ofPsSPL3 gene was induced by GA3to promote the process of dormancy release in tree peony flower bud.

Paeoniasuffruticosa；PsSPL3； RACE； Real-time PCR； Expression pattern

2017-04-23

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31471908； 31372104；31672194)

戰(zhàn)新梅(1976-)，女，山東萊陽人，講師，博士，主要從事牡丹分子生物學(xué)研究。

張玉喜(1977-)，女，山東聊城人，副教授，博士，主要從事牡丹分子生物學(xué)研究。

Q78；S685.03

A

1000-7091(2017)04-0013-06

10.7668/hbnxb.2017.04.003