劉 維，劉 浩，董雙玉，古豐瑋，陳志強，王加峰，王 慧

(華南農業(yè)大學，國家植物航天育種工程技術研究中心，廣東 廣州 510642)

利用CRISPR/Cas9 技術創(chuàng)建OsCOL9水稻突變體

劉 維，劉 浩，董雙玉，古豐瑋，陳志強，王加峰，王 慧

(華南農業(yè)大學，國家植物航天育種工程技術研究中心，廣東 廣州 510642)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)可對植物的內源基因進行有效定點編輯，為作物的遺傳育種提供了新的方向。以感病水稻品種麗江為材料，抗病基因OsCOL9為靶基因，探索該系統(tǒng)對水稻內源基因定點編輯效率以及獲得有研究意義的突變體。OsCOL9基因CDS序列全長1 266 bp，編碼一個422 aa蛋白，分子量大小約為45.6 kDa，蛋白質結構的N端含有B-box結構域，C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1 ) 結構域。設計4個長20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶點，靶向編輯OsCOL9基因的CDS起始區(qū)域以及外顯子的末端，分別由 U3、U6a、U6b以及U6c 啟動子驅動，提取T1轉基因植株的基因組DNA并對編輯位點附近的DNA片段進行序列分析。結果表明，T1材料中OsCOL9的堿基缺失數(shù)最多可達59 bp，突變次數(shù)最多可達11次，取得較好的基因編輯效果。同時本試驗出現(xiàn)了脫靶效應，因此著重探討了降低脫靶效應的方法。由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)在進行基因編輯時沒有外源基因的導入，加上該技術的快捷、簡便，對生物技術與傳統(tǒng)育種的結合具有重要實踐意義。

水稻；基因編輯；CRISPR/Cas9；OsCOL9

水稻(OryzasativaL.)屬于禾本科植物，主要種植在亞洲以及非洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，全球約一半以上的人口以此為主食。由于糧食的高消耗以及地理氣候因素的限制，導致世界范圍內的糧食危機。要解決該問題，必須要借助科學技術以及合理的糧食種植從根源上提高糧食的產量。水稻遺傳背景的多樣化是水稻育種可持續(xù)性發(fā)展的關鍵，基因編輯技術為此帶來了新的發(fā)展機遇[1]?；蚓庉嬀褪峭ㄟ^對基因組的修飾，從而改變某一特定性狀的一種技術，可以在海量的測序數(shù)據中挖掘基因型對表現(xiàn)型的影響，廣泛應用于生物醫(yī)學以及植物病理相關領域。水稻不僅是單子葉的模式植物，更是重要的糧食作物，所以利用基因編輯技術準確有效地對水稻基因組進行修飾，對水稻重要性狀的改良有著重要的意義。

傳統(tǒng)的基因靶向修飾技術依賴于自然條件下細胞內的同源重組 (Homologous recombination，HR)，即減數(shù)分裂過程中基因重組以及有絲分裂前DNA雙鏈斷裂的修復，但是在動植物細胞內其效率非常低，極大地限制了該技術的應用[2]。人工核酸酶介導的基因編輯技術憑借其高效性、特異性強、周期短迅速成為基因定點編輯研究的熱點。如鋅指核酸酶 (Zinc-finger nucleases，ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases，TALEN)通過引導位點特異性核酸內切酶對特定的靶向序列進行切割產生雙鏈斷裂的 (Double strand break，DSB) 缺口。由于細胞內的DNA雙鏈具有自我修復的功能，DSB可以通過非同源末端連接(Nonhomologous end-joining,NHEJ)以及HR修復途徑使基因組DNA缺口處有堿基的插入或者缺失，從而實現(xiàn)基因編輯的目的[3-6]。ZFN和TALEN的DNA結合域改造比較復雜，容易出現(xiàn)脫靶的現(xiàn)象，且這2種技術的核酸內切酶FokⅠ必須在形成二聚體的條件下才能發(fā)揮酶切作用，這極大地限制了這2種技術的應用[7]。CRISPR在1987年首次被日本科學家Ishino等[8]在大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應用代表第3代基因編輯技術的產生，該系統(tǒng)具有較好的可操作性、特異性、高效性，僅需要gRNA和核酸酶(Cas9)識別靶基因的PAM(Protospacer adjacent motif)序列就可以進行定點突變[9-10]。目前，CRISPR/Cas9 技術在基因治療以及動植物新品種的改造和培育中都得到了較好的應用，如在作物中對水稻、小麥、玉米、高粱都實現(xiàn)了基因組的定點編輯[11-13]。研究表明，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對水稻基因的編輯可以穩(wěn)定遺傳給下一代[14]，所以將該技術應用到水稻育種意義重大。

OsCOL9基因位于水稻第3染色體，cDNA全長2 055 bp，含有2個外顯子和一個內含子，CDS序列全長1 266 bp，編碼一個422 aa蛋白，分子量大小約為45.6 kDa，蛋白質結構的N端含有B-box結構域，C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1) 結構域。CCT蛋白可能是信號轉導途徑的主要效應子，鋅指蛋白是常見的轉錄因子之一，B-box可能參與鋅指蛋白與其他蛋白之間的互作。在本研究中，設計4個靶點，利用CRISPR/Cas9 技術對水稻抗病相關基因OsCOL9實行定點編輯，探索該方法的編輯效率及基因可能參與的信號通路。

1 材料和方法

1.1 CRISPR/Cas9及gRNA載體

CRISPR/gRNA載體以Amp抗性pUC18載體為骨架經過改造而獲得，大小約為3 kb，如圖1-A所示。為了便于gRNA表達盒的連接反應，采用BsaⅠ或BamHⅠ單酶切gRNA載體。為降低假陽性克隆出現(xiàn)，載體設計時將gRNA區(qū)排列在U3/U6啟動子區(qū)上游，中間用載體骨架隔開，設計引物時選用靠近U3/U6啟動子區(qū)以及gRNA區(qū)的載體骨架序列設計上下游引物，由于延伸時間(20 s)限制，未被酶切的載體不被PCR擴增。CRISPR/Cas9雙元載體大小約為16.5 kb，如圖1-B所示。該載體設置左右邊界，從左往右依次排列由35S 啟動子驅動的HPT基因、玉米泛素啟動子Ubi驅動的Cas9基因、終止子、ccdB大腸桿菌致死基因。組裝靶點時，可以使用AscⅠ或BsaⅠ單酶切CRISPR/Cas9雙元載體，未酶切干凈的載體，由于ccdB基因的存在會抑制大腸桿菌的生長，從而降低假陽性。這2個載體由華南農業(yè)大學劉耀光研究員饋贈。

圖1 CRISPR/gRNA及Cas9載體示意圖Fig.1 Feature of CRISPR/gRNA and Cas9 vectors

1.2 gRNA靶點選擇及其寡核苷酸鏈引物的設計

本試驗針對OsCOL9基因按照NGG序列，對靶序列進行Blast后篩選了4個靶點，分別在該基因CDS序列的起始密碼子(ATG)后依次設計3個靶點U6a、U6b、U6c以及CDS的中部設計一個靶點(U3)，如表1所示，盡最大可能引起該基因密碼子的缺失和移碼。PCR鑒定陽性克隆引物，OsCOL9-CasF-Test：5′-CGCACTGTCGCTGACGTGTGG-3′，OsCOL9-CasR-Test：5′-TTCTGCTCGATCTGCTGCT-3′。

1.3 四靶點pYLCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA載體構建

載體的構建方法基于Ma等[15]報道的利用CRISPR/Cas9技術高效多重編輯單子葉。該方法主要分為三步：1.gRNA表達盒組裝。利用PCR儀95 ℃處理30 s連接接頭引物，酶切pYLCRISPR/gRNA載體，利用T4連接酶組裝gRNA表達盒，根據不同啟動子設計引物擴增gRNA表達盒。2.靶點與載體pYLCRISPR/Cas9組裝。同時用BsaⅠ單酶切gRNA表達盒的擴增產物與CRISPR/Cas9載體，純化回收后利用T4連接酶組裝載體。在組裝多靶點時，可以將酶切好的gRNA表達盒在20 ℃連接約10 min，再加入線性化的Cas9載體。3.轉化以及陽性克隆檢測。將10 μL的連接產物加入到100 μL的DH5α感受態(tài)細胞進行轉化，挑選單克隆培養(yǎng)后抽提質粒，利用PCR以及AscⅠ酶切進行初步鑒定后進行測序分析。

表1 靶點寡核苷酸序列Tab.1 The oligonucleotide sequences of target sites

1.4 轉基因植株的構建、水稻基因組DNA的提取以及突變體測序

通過農桿菌介導將表達載體轉入到粳稻品種麗江中，包括誘導愈傷、侵染、2次篩選、分化、生根，得到轉基因幼苗進行種植。采用CTAB法提取轉基因水稻基因組DNA[16]。送Thermo Fisher Scientific公司完成測序。

2 結果與分析

2.1 pYLCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA雙元載體組裝結構以及酶切鑒定

本次試驗針對OsCOL9基因設計了4個靶點，將組裝好的gRNA表達盒替換Cas9載體骨架中的ccdB片段，得到pYLCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA雙元載體(圖2)。抽提單克隆的質粒，利用AscⅠ進行酶切鑒定，如圖3所示，切出的目的片段大小約為2.0 kb左右，表明OsCOL9的4個靶點gRNA表達盒正確的組裝到pYLCRISPR/Cas9載體上。通過設計特異性引物對構建載體上的各靶點進行測序，結果如圖4所示，通過BsaⅠ位點組裝的4個靶點序列都與所設計靶點序列(表1)一致，結果表明構建的載體適合用于下續(xù)的由農桿菌介導的水稻遺傳轉化中，為獲得OsCOL9水稻突變體奠定基礎。

圖2 pLYCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA載體的組裝圖Fig.2 The structure of pLYCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA vectors

M.1 kb DNA ladder Marker；1.pYLCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA。

圖4 四個靶點序列的測序結果Fig.4 Sequencing results for the four target sequences

2.2OsCOL9 轉基因植株獲得

利用農桿菌介導法將表達載體轉入水稻材料易感病品種麗江(LTH)愈傷組織中，獲得OsCOL9轉基因植株，如圖5所示，經Cas9敲除后，和野生型LTH相比，植株生長相對矮小，分蘗數(shù)減少，敲除后對抗病的影響需要進一步檢測。

WT.野生型LTH；1-2.LTH的突變體。WT.Wild-type of LTH;1～2.Mutants of LTH.

2.3pYLCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA 載體打靶效果檢測

提取T1水稻葉片的基因組DNA，首先用潮霉素基因(HPT)檢測引物進行PCR鑒定，篩選得到陽性的轉基因植株。再利用設計的Cas9-OsCOL9檢測引物對靶基因OsCOL9各個編輯位點上下游200 bp左右區(qū)域DNA片段進行擴增、測序，測序結果見圖6。統(tǒng)計靶位點上下游堿基突變以及缺失情況，如表2所示，最多的堿基缺失數(shù)可達到59 bp，最少為1 bp，突變次數(shù)最多可達11次，由此表明，取得較好的基因編輯效果。

2.4 脫靶效應分析

由于Target 2靶位點的打靶效率較低，將Target 2靶點的序列與日本晴第3號染色體堿基序列Chr3：28000000-29000000進行比對分析得到可能出現(xiàn)脫靶的位點。結果表明，與靶序列相差3個堿基數(shù)的序列有3個，相差4個堿基數(shù)的靶點有5個，初步推測這些都是極易出現(xiàn)脫靶效應的位點(表3)。

表 2 OsCOL9 突變體與野生型序列對比結果Tab.2 Sequence alignment of OsCOL9 mutants compared to the WT line

表3 預測可能脫靶的位點Tab.3 The putative off-target sites

圖6 OsCOL9突變體測序結果Fig.6 Sequencing results for OsCOL9 mutants

3 結論與討論

CRISPR/Cas9是一種高效且簡便的基因定點編輯技術。相對ZFN和TALEN 2種技術而言，用RNA替代組裝蛋白，實現(xiàn)與靶基因的特異性識別與結合，使得該技術有更加簡便靈活的可操作性[17]。目前，國內外該技術主要應用于靶基因的定點突變以及基因功能的研究，同時拓展該技術的應用范圍，如Cas9多重分子工具箱的轉錄調控作用[18]，由sgRNA介導的轉錄激活活性[19]，dCas9介導靶基因的沉默表達[20]，大規(guī)模的打靶試驗進行大規(guī)模的表型分析。

本研究中，通過構建多靶點gRNAs載體對水稻的OsCOL9基因進行打靶試驗，獲得一系列不同類型的OsCOL9突變體，T1OsCOL9突變率高達87%。在水稻中，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行靶基因定點編輯的突變率從0～100%都有報道[21-22]，試驗結果表明多靶點同時進行定點編輯有利于突變體的獲得。T1轉基因植株中堿基缺失最多可達59 bp，最少為1 bp，由于缺失堿基較少，PCR擴增目的片段后，通過凝膠電泳檢測無明顯差異，因此通過測序檢測突變位點。打靶過程中，以U6b、U6c為啟動子驅動的2個靶點起到顯著的效果。起始密碼子ATG附近以U6a為啟動子、外顯子末端以U3a為啟動子設計的2個靶點都出現(xiàn)了嚴重的脫靶現(xiàn)象，可能的原因有：①基因組內包含有與這2個靶點高度類似的堿基序列導致sgRNA結合時發(fā)生錯配；將Target 2 和Target 3序列與日本晴第3染色體3：28000000-29000000序列進行比對，以4 bp堿基差為閥值得到與Target 2相似的序列有8個，Target 3為0個，以6 bp堿基差為閥值得到與Target 2相似的序列有38個，Target 3為5個，由此可以初步推論靶位點的特異性選擇有利于降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應。②該基因外顯子GC含量過高。GC含量過高可能不利于gRNA與靶序列的識別，增加脫靶機率。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的DNA切割，PAM為NGG應用最廣泛，但有研究表明，PAM為NAG時，在人細胞中也有較高的切割效率，由此推測，非NGG 序列可能是導致脫靶的一個原因[23]。Sternberg等[24]研究表明，CRISPR/Cas9核酸酶結構域的構象直接控制DNA切割的效率，對打靶是否成功起關鍵性作用。PAM序列區(qū)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)行使切割功能的基本條件，可能不同PAM序列對CRISPR/Cas9核酸酶結構域的構象影響程度不同。本試驗中gRNA使用U6啟動子比U3啟動子具有更好的打靶效果，從表1可以看出靶基因缺失、插入、突變的位點都在U6啟動子靶點的附近，Mikami等[21]以OsYSA為靶點，對比CRISPR/Cas中U3和U6啟動子驅動gRNA表達效率，結果表明U3突變率為0～53.3%，U6突變率為39.6%～80.0%，U6驅動gRNA表達更高效，Ma等[15]研究也表明U6的平均編輯效率較U3高。

降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應同時又保持操作的簡便性是該技術突破的關鍵?？梢詮囊韵?個方面著手：①設計特異性sgRNA。比如利用CRISPRscan設計模型運算預測得到高特異性的sgRNA[25]、張鋒實驗室開發(fā)的(http：//crispr.mit.edu/)[26]。②對Cas蛋白進行改造提高精準性。Kleinstiver等[27]使用改造后高保真核酸酶SpCas9-HF1進行打靶實驗，通過全基因組范圍內測序得到脫靶率為0。還有研究通過抑制非同源末端的連接來提高CRISPR/Cas9對基因組編輯的有效性以及精確性[28]。

T0靶基因的突變可以遺傳給T1，到了T2可以檢測到目標性狀分離的現(xiàn)象[29-30]。該方法可得到純合、雜合2種突變體，將突變體經過回交等一系列手段消除轉基因的痕跡，結合傳統(tǒng)的作物育種，將極大加快育種進程。該技術只能定點編輯基因組內源基因，因此不能明確定義該突變體為轉基因植株，另外該技術是否屬于轉基因管理范疇進行監(jiān)管有待于進一步研討。

綜上所述，本研究通過利用CRISPR/Cas9技術獲得了類型較為豐富的OsCOL9突變體，為水稻抗病的研究提供了豐富的材料，且為水稻的抗病育種奠定了重要材料基礎。該技術可以定點編輯植物的內源基因，產生多樣的突變體獲得豐富的水稻育種材料，開拓了高效、安全的育種途徑，實現(xiàn)了理論與實踐的相結合。降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應是推廣應用該技術的關鍵，該系統(tǒng)在不同作物中誘導產生突變的效率、特異性、遺傳性等問題的研究還不十分清楚，仍需大力投入和積極開展研究。

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MutantedOsCOL9 Based on CRISPR/Cas9 Technology in Rice

LIU Wei,LIU Hao,DONG Shuangyu,GU Fengwei,CHEN Zhiqiang,WANG Jiafeng,WANG Hui

(National Engineering Research Center of Plant Space Breeding，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

The CRISPR/Cas9 system can directly to edit endogenous genomic loci in plant,provide a new opportunities for crop breeding.To explore the editing efficiency of the system on rice endogenous gene and obtain meaningful mutants,using the susceptible rice variety Lijiang and the disease resistance geneOsCOL9 as the target gene.The full-length CDS ofOsCOL9 was 1 266 bp long and encoding a 422 aa protein with a molecular weight of about 45.6 kDa,and the N-terminus contained the B-box domain,and the C-terminus contains the CCT (CONSTANS，CONSTANS-Like，TOC1) domain.In this study,four 20 nt guide RNAs (gRNAs) which were targeted to the initiation region CDS and terminal exon ofOsCOL9 were designed and transcribed from the U3，U6a，U6b and U6c promoters，respectively. The sequences near the editing site were analyzed by extracting genomic DNA from T1 transgenic plants.The number of target base deletions was 59 bp and the number of mutations was up to 11 times .In this study,we get better gene editing results.However，there have been more serious off-target effects in this experiment.Therefore，we focus on off-target effects in the discussion section of this paper. Owing largely to its flexibility，efficiency and no insertion of exogenous gene，it has important practical significance to combine biotechnology and traditional breeding.

Rice；Genome editing；CRISPR/Cas9;OsCOL9

2017-06-11

國家計劃項目(2007AA1090101)；國家自然科學基金項目(31401722)

劉 維(1993-)，女，湖南衡陽人，在讀碩士，主要從事水稻抗稻瘟病研究。

王 慧(1965-)，女，湖南長沙人，教授，博士，碩士生導師，主要從事高產優(yōu)質常規(guī)稻育種研究。

Q78；S572.03

A

1000-7091(2017)04-0042-07

10.7668/hbnxb.2017.04.007