李 淼，李春玲，宋 帥，楊冬霞，蔡汝健，李 艷，蔣智勇，勾紅潮，楚品品

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州 510640；2.廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；3.廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640)

豬鏈球菌ssnA基因缺失突變菌株的構(gòu)建及毒力分析

李 淼1,2,3，李春玲1,2,3，宋 帥1,2,3，楊冬霞1,2,3，蔡汝健1,2,3，李 艷1,2,3，蔣智勇1,2,3，勾紅潮1,2,3，楚品品1,2,3

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州 510640；2.廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；3.廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640)

分泌型核酸酶基因ssnA是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的一種脫氧核糖核酸酶，被認(rèn)為是一種豬鏈球菌2型(SS2)潛在的毒力因子。為了分析ssnA基因?qū)τ赟S2毒力的影響，通過(guò)體外構(gòu)建具有同源臂的重組自殺性質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化進(jìn)入 SS2，經(jīng)同源重組構(gòu)建了SS2流行毒力株GD01的ssnA基因缺失突變菌株，并通過(guò)比較分析了野生菌株與缺失突變菌株的生長(zhǎng)特性及溶血活性等生物學(xué)特性。結(jié)果顯示，GD01株與ΔssnA突變株的生長(zhǎng)速度及溶血活性沒(méi)有明顯差異；ssnA基因缺失后SS2對(duì)Hep-2細(xì)胞的黏附及入侵能力則明顯下降。小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示，ssnA基因缺失突變菌株對(duì)于CD1小鼠LD50是6.17×108cfu，而SS2野生菌株的LD50是4.42×107cfu，缺失突變株的LD50約是野生株的14倍，表明ssnA的缺失對(duì)SS2毒力產(chǎn)生明顯影響，提示ssnA基因在其致病過(guò)程中具有重要作用，其具體作用機(jī)制需進(jìn)一步分析。

豬鏈球菌2型；ssnA基因；基因缺失；毒力

豬鏈球菌(Streptococcussuis，S.suis)是當(dāng)前嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的一種最重要的病原菌，能夠引起豬關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥甚至急性死亡[1-3]。根據(jù)豬鏈球菌表面多糖抗原分型，其目前主要分為35個(gè)血清型[4]。其中豬鏈球菌2型 (SS2) 分布最廣，分離率最高，致病性最強(qiáng)，同時(shí)也是一種重要的人獸共患病原菌[5-6]。1968 年丹麥?zhǔn)状螆?bào)道了人感染豬鏈球菌的病例，隨后在英國(guó)、美國(guó)、巴西、澳大利亞、西班牙及新西蘭等國(guó)均有過(guò)人感染豬鏈球菌的報(bào)道[7-9]。1998年和2005年在中國(guó)江蘇和四川分別發(fā)生了較大規(guī)模的人感染豬鏈球菌疫情，累計(jì)報(bào)告發(fā)病229 例，死亡52例，對(duì)公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重影響[10]。最近研究證實(shí)，多種血清型的豬鏈球菌均能感染人類(lèi)[11]。

目前，國(guó)內(nèi)外缺乏對(duì)豬鏈球菌毒力因子和致病機(jī)制的全面了解，已確認(rèn)與豬鏈球菌的致病性相關(guān)的毒力因子包括莢膜多糖(CPS)、溶血素(SLY)、胞外因子(EF)、溶菌酶釋放蛋白(MRP)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、精氨酸氨基肽酶(ADIs)及纖連蛋白結(jié)合蛋白(FBPS)等[12-17]。但由于毒力因子的多樣性以及復(fù)雜性，單靠現(xiàn)有的毒力因子還不足以全面解釋SS2的致病機(jī)理。

分泌型核酸酶因其具有脫氧核糖核酸酶活性而能夠直接作用于細(xì)胞中關(guān)鍵的大分子物質(zhì)DNA，因此推測(cè)其是潛在的毒力因子。Fontaine 等[18]在 SS2 致病菌株 SX332 和后來(lái)的 1～9 型菌株中，發(fā)現(xiàn)了一種分泌型核酸酶SsnA。反轉(zhuǎn)錄 PCR 表明ssnA在豬鏈球菌整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中均表達(dá)。該研究分析分離于豬上頜棉拭子或鼻拭子以及豬內(nèi)部器官的豬鏈球菌發(fā)現(xiàn)，ssnA的表型與其分離位置密切相關(guān)，提示ssnA是一種新型的毒力因子。最新的研究已經(jīng)證實(shí)，ssnA是SS9的一個(gè)毒力因子[19]。本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了SS2強(qiáng)毒株ssnA基因的缺失突變菌株ΔssnA，比較了野生菌株與ΔssnA的生長(zhǎng)特性及對(duì)宿主細(xì)胞的黏附與入侵，進(jìn)一步分析了ssnA基因缺失對(duì)豬鏈球菌毒力的影響，為研究該基因的功能以及其在豬鏈球菌致病過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及生化試劑

大腸桿菌DH5α、BL21由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所豬病實(shí)驗(yàn)室保存；SS2菌株GD01由本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)病豬體內(nèi)分離、鑒定并保存；溫敏型自殺質(zhì)粒pSET4s由Takamatsu[20]博士惠贈(zèng)；T4DNA連接酶、DNA限制性?xún)?nèi)切酶及pMD19-T載體購(gòu)于寶生物工程(大連) 有限公司；壯觀霉素(Spc)及氯霉素(Cm)購(gòu)自 Sigma 公司。

1.2 細(xì)胞系及試驗(yàn)動(dòng)物

人喉上皮癌細(xì)胞系Hep-2由本實(shí)驗(yàn)室保存，6周齡雌性CD1小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 引物

本研究所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成(表1)，下劃線部分為酶切位點(diǎn)。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.4 基因缺失突變株的構(gòu)建及鑒定

以 SS2 分離株GD01基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增ssnA基因上游序列P1和下游序列P2；以穿梭質(zhì)粒 pSET3 為模板，擴(kuò)增 CmR基因盒序列，將得到的3個(gè)片段的基因序列分別連接到 pMD19-T 載體上，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后酶切回收目的基因片段并定向以P1-Cm-P2的順序連接到溫敏型自殺性載體質(zhì)粒 pSET4S 中，得到自殺性質(zhì)粒 pSET4SΔssnA；將其轉(zhuǎn)入 GD01 菌株中，篩選具有 CmR的克隆，利用 PCR 鑒定和測(cè)序證實(shí)獲得ssnA基因缺失突變株 ΔssnA。

1.5 基因缺失突變株 ΔssnA的生物活性測(cè)定

將ssnA基因缺失突變菌株ΔssnA和野生菌株GD01分別接種于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至平臺(tái)期，將2種菌株分別在血平板上劃線，在37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)和溶血環(huán)大小。測(cè)定平臺(tái)期2個(gè)菌株的OD600，用TSB培養(yǎng)基稀釋至OD600=0.2后，按1%比例轉(zhuǎn)接，連續(xù)培養(yǎng)12 h，每隔1 h 測(cè)OD600，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 基因缺失突變株對(duì)Hep-2細(xì)胞的黏附和入侵

將基因缺失菌株 ΔssnA和野生菌株GD01培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用1640培養(yǎng)基稀釋至5×106～1×107cfu/mL。將Hep-2細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)至單層后加入適當(dāng)稀釋的菌液，于37 ℃、5%CO2條件下孵育。感染2 h后，用無(wú)菌PBS(pH值7.4)洗滌3次。然后每孔加入200 μL細(xì)胞洗脫液(含0.1% EDTA和0.25%胰蛋白酶的PBS)。洗脫后，每孔加入800 μL PBS(含0.025%Triton X-100)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎。將上述溶液倍比稀釋涂布于TSA平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量。

細(xì)胞入侵試驗(yàn)是在上述試驗(yàn)結(jié)束后，每孔加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(含5 μg青霉素和100 μg鏈霉素)，于37 ℃、5%CO2條件下孵育1 h。

1.7 基因缺失突變株ΔssnA對(duì)小鼠致病力分析

選取6周齡CD1雌性遠(yuǎn)交系小鼠，用于小鼠半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定試驗(yàn)。將野生菌GD01和缺失菌ΔssnA培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。按照預(yù)試驗(yàn)得出的最高、最低劑量對(duì)數(shù)差，分成幾個(gè)對(duì)數(shù)等距的劑量組。以腹腔接種的方式注射CD1小鼠，每天觀察小鼠的臨床癥狀和死亡情況，觀察期為14 d。最后通過(guò)PCR 對(duì)死亡小鼠和正常處死小鼠的肝臟、腎臟和脾臟等器官分離的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 GD01株ssnA基因缺失菌株ΔssnA的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)GenBank中登錄的SC84菌株全基因序列(序列號(hào)為NC_012924)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出ssnA基因上游序列P1(865 bp) 和下游序列P2(624 bp)；根據(jù)GenBank登陸的穿梭質(zhì)粒pSET3序列(No.AB042431)設(shè)計(jì)擴(kuò)增出Cm基因(1 056 bp)，結(jié)果如圖1所示；將酶切后的目的片段和pSET4S載體連接轉(zhuǎn)化后，構(gòu)建得到自殺性載體質(zhì)粒pSET4SΔssnA。將 pSET4SΔssnA質(zhì)粒加入新鮮制備的GD01野生菌株電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化后，利用4對(duì)PCR引物鑒定及測(cè)序證實(shí)ssnA基因被Cm抗性基因盒所替代，如圖2所示，SS 16S rRNA陽(yáng)性，成功缺失ssnA基因的突變株 CmR陽(yáng)性，SpcR陰性，ssnA基因敲除鑒定引物陽(yáng)性，PCR 擴(kuò)增結(jié)果如上述預(yù)期，說(shuō)明成功獲得 SS2ssnA基因缺失突變菌株。

2.2 缺失菌株ΔssnA的生長(zhǎng)特性

觀察發(fā)現(xiàn)野生株及缺失株的菌落形態(tài)和溶血環(huán)大小無(wú)明顯區(qū)別。如圖3所示，缺失菌株 ΔssnA與野生型菌株的生長(zhǎng)特性相似。

2.3 細(xì)胞黏附及入侵試驗(yàn)

本試驗(yàn)以Hep-2細(xì)胞為模型，比較了野生菌株與基因缺失菌株ΔssnA黏附及入侵的能力。如圖4所示，ssnA基因缺失菌株ΔssnA的黏附和入侵能力極顯著低于野生菌株GD01，提示ssnA基因可能與豬鏈球菌的致病性相關(guān)。

M.DL2000 DNA Marker；1.ssnA上游序列；2.ssnA下游序列；3.Cm序列。M.DL2000 DNA Marker； 1.The upstream sequence of ssnA； 2.The downstream sequence of ssnA； 3.Cm fragment.

A.16S rRNA片段(294 bp)；B.Cm基因片段(1 056 bp)；C.P3-F/P3-R擴(kuò)增片段；M1.DL600 DNA Marker； M2.DL2000 DNA Marker； 1，3，5.野生型菌株；2，4，6.ssnA缺失突變菌株。A.16S rRNA(294 bp)； B.Cm fragment (1 056 bp)；C.P3-F/P3-R fragment；M1.DL600 DNA Marker； M2.DL2000 DNA Marker； 1，3，5.Wild-type strain；2，4，6.Mutant strain ΔssnA.

圖3 野生菌株與缺失突變菌株生長(zhǎng)曲線的比較Fig.3 Growth curve of wild-type and mutant strains

2.4 小鼠致病力分析

選取CD1小鼠為動(dòng)物模型，用不同濃度的野生菌GD01和ssnA基因缺失菌株對(duì)其進(jìn)行攻毒，觀察記錄小鼠的存活情況 (表2)。結(jié)果表明，ΔssnA菌株的LD50(6.17×108) 約為野生菌株 ΔssnA的 LD50(4.42×107) 的14倍，表明ssnA基因缺失后，SS2毒力明顯下降。

表2 野生株GD01和基因缺失突變株ΔssnA對(duì)小鼠的LD50結(jié)果Tab.2 The LD50 of the GD01 and ΔssnA strains in CD1 mice

**.P<0.01。

3 討論

近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一些酶類(lèi)，如三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和谷氨酸脫氫酶(GDH)能?chē)?yán)重影響 SS2 的致病力[21-22]。GAPDH是一種參與糖分解途徑的酶，其作為毒力因子可通過(guò)與肌球蛋白、纖連素、肌動(dòng)蛋白和血纖蛋白溶酶等不同的宿主蛋白結(jié)合而發(fā)揮作用。豬鏈球菌GDH在細(xì)胞表面表達(dá)，是NADP(H)特異性酶，GDH有保守的抗原性，能與豬鏈球菌的陽(yáng)性豬血清反應(yīng)，因此，可作為檢測(cè)豬鏈球菌的重要標(biāo)志性抗原。分泌型核酸酶基因ssnA作為豬鏈球菌的潛在毒力因子，最早是由Fontaine等[18]發(fā)現(xiàn)的。隨后，張東[23]研究了ssnA的部分生物學(xué)特性，建立了能特異性檢測(cè)豬鏈球菌ssnA基因的PCR檢測(cè)方法，并用甲苯胺藍(lán)法檢測(cè)驗(yàn)證了其核酸酶的活性。近年來(lái)，De Buhr等[24]通過(guò)體外試驗(yàn)證實(shí)了ssnA 能夠有效降解中性粒細(xì)胞胞外陷阱(Neutrophil extracellular traps，NETs)，但并未通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)其對(duì)細(xì)菌毒力的影響。目前為止，仍然缺乏針對(duì)ssnA基因在豬鏈球菌致病過(guò)程中作用的具體研究。因此，本研究以豬鏈球菌中分泌型核酸酶基因ssnA作為研究對(duì)象，構(gòu)建了ssnA基因缺失突變株ΔssnA，并在此基礎(chǔ)上分析了ssnA的缺失對(duì)SS2基本生物學(xué)性狀以及致病力的影響，為探明豬鏈球菌潛在的毒力因子及其致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

為了構(gòu)建ssnA基因缺失突變株，利用穿梭載體pSET4S攜帶ssnA基因的側(cè)翼序列，通過(guò)經(jīng)典的同源重組技術(shù)將SS2流行強(qiáng)毒株中的ssnA從基因組中敲除。pSET4S是一種溫敏型自殺性載體質(zhì)粒，當(dāng)溫度為28 ℃時(shí)可以在豬鏈球菌中正常復(fù)制，而質(zhì)粒上的溫敏復(fù)制子在溫度達(dá)到37 ℃時(shí)失去作用，從而實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒自殺。由于影響基因缺失菌株構(gòu)建的因素很多[25-26]，且通常在整個(gè)過(guò)程中只有極少的細(xì)菌發(fā)生了重組，因此需要進(jìn)一步通過(guò)抗性篩選、PCR鑒定等進(jìn)行驗(yàn)證。本研究利用經(jīng)典的基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了ssnA基因缺失突變株ΔssnA，為研究ssnA基因的功能提供了保障。

本研究針對(duì)分泌型核酸酶SsnA對(duì)SS2致病力的影響進(jìn)行了分析，體外生長(zhǎng)特性試驗(yàn)結(jié)果顯示，基因缺失突變株與野生株的生長(zhǎng)速率及溶血活性沒(méi)有明顯差異。細(xì)胞感染結(jié)果顯示，ΔssnA菌株對(duì)Hep-2細(xì)胞的黏附及入侵能力均明顯降低。由于豬鏈球菌入侵宿主時(shí)，先是黏附于表面上皮細(xì)胞，進(jìn)一步突破上呼吸道屏障后通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)全身各處，并最終引起機(jī)體感染。因此，揭示ssnA可能在豬鏈球菌的感染過(guò)程中也發(fā)揮了一定的作用。CD1小鼠的體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)分析進(jìn)一步證實(shí)，ssnA基因敲除后，豬鏈球菌毒力下降明顯，表明ssnA是SS2的毒力因子，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

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Construction and Virulence Analysis of thessnAGene Knock-out Mutant ofStreptococcussuisSerotype 2

LI Miao1,2,3，LI Chunling1,2,3，SONG Shuai1,2,3，YANG Dongxia1,2,3，CAI Rujian1,2,3，LI Yan1,2,3，JIANG Zhiyong1,2,3，GOU Hongchao1,2,3，CHU Pinpin1,2,3

(1.Institute of Animal Health，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China；2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock Disease Prevention，Guangzhou 510640，China；3.Guangdong Open Laboratory of Veterinary Public Health，Guangzhou 510640，China)

Streptococcussuisnuclease A (ssnA) is a recently discovered deoxyribonuclease (DNase)，which is one of potential virulence factors ofStreptococcussuisserotype 2(SS2).To determine the effects ofssnAon virulence，thessnAdeletion mutant (ΔssnA) was constructed by using the suicide vector pSET4S.The growth and hemolytic activity of thessnAgene mutant strain had no obvious difference compared with the wild-type strain.The ability of ΔssnAmutant to interact with human laryngeal epithelial cell (Hep-2) was evaluated and it exhibited dramatically decreased ability to adhere to and invade Hep-2 cells.For CD1 mice，the LD50of the mutation strain was 6.17×108cfu，whereas the LD50of wild-type strain was 4.42×107cfu.This mutation was found to exhibit significant attenuation of virulence when evaluated in CD1 mice，suggestingssnAplays a critical role in the pathogenesis of SS2，the mechanism of this protein is valuable for further analysis.

Streptococcussuis2；ssnA； Gene mutant； Virulence

2017-04-22

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201510010142)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016B020202004)；廣東省公益研究與能力建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金(2014B070706011)；廣東省國(guó)際合作項(xiàng)目(2015B050501007)

李 淼(1982-)，女，黑龍江哈爾濱人，副研究員,博士，主要從事細(xì)菌分子生物學(xué)研究。

李春玲(1965-)，女，河南長(zhǎng)葛人，研究員，博士，主要從事獸醫(yī)微生物學(xué)研究。

Q78； S828

A

1000-7091(2017)04-0001-06

10.7668/hbnxb.2017.04.001