趙春梅，范 習(xí)，薛仁鎬

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

大豆CHI1基因啟動(dòng)子的克隆及功能初探

趙春梅，范 習(xí)，薛仁鎬

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

為了解大豆Class Ⅰ幾丁酶基因(Chitinase gene)對不同脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制。利用PCR技術(shù)克隆了大豆Class ⅠChitinase基因的啟動(dòng)子片段(GmCHI1p)，序列分析表明，擴(kuò)增片段(1 641 bp)與GenBank中的已知序列同源性達(dá)99.8%，且含有多個(gè)脅迫響應(yīng)調(diào)控元件。利用GUS基因上游無啟動(dòng)子的表達(dá)載體pCAMBIA1391Z，構(gòu)建GmCHI1p與GUS基因融合的植物表達(dá)載體pCAM-GmCHI1p，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草中。在轉(zhuǎn)基因煙草愈傷組織中檢測到GUS活性，表明該啟動(dòng)子具有啟動(dòng)活性。對轉(zhuǎn)基因煙草中的GUS活性進(jìn)行初步定性分析，結(jié)果表明，GmCHI1p可驅(qū)動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草的根部特異性表達(dá)，而且在傷害處理的葉片中檢測到GUS的強(qiáng)烈表達(dá)，表現(xiàn)出明顯的根組織特異性及傷害誘導(dǎo)性。這種傷害誘導(dǎo)僅在傷害組織部位及其附近高效表達(dá)而沒有被長距離傳遞，預(yù)計(jì)該啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因抗蟲分子育種中具有巨大的應(yīng)用前景。

幾丁質(zhì)酶；啟動(dòng)子；根特異性；傷害誘導(dǎo)性

大豆(GlycinemaxL.Merrill)是重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物。大豆生產(chǎn)中，各種真菌病及蟲害是導(dǎo)致大豆品質(zhì)和產(chǎn)量下降的重要原因。通過基因工程技術(shù)將相關(guān)抗性基因?qū)氪蠖梗钱?dāng)今提高大豆抗病性及生產(chǎn)力的有效策略。目前，有大量優(yōu)良新基因被分離克隆，但植物基因工程中廣泛使用的組成型啟動(dòng)子(比如CaMV35S啟動(dòng)子、Act1啟動(dòng)子及Ubi1啟動(dòng)子等)，在應(yīng)用中逐漸暴露出一些問題：靶基因的過量表達(dá)通常會嚴(yán)重影響植物的正常生長和發(fā)育[1-2]。因此，發(fā)掘能夠?qū)ν庠椿虮磉_(dá)施行時(shí)、空、量三維調(diào)控的組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子顯得尤為重要[3]。

植物傷害或病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究是植物生物技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。病原菌侵染會誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種防衛(wèi)反應(yīng)，包括病程相關(guān)蛋白的合成(PR蛋白：Pathogenesis-related proteins)。幾丁質(zhì)酶(Chitinase，CHI)是主要的植物PR蛋白之一，廣泛存在于各種植物中，在抵御真菌病害的防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[4-5]。研究表明，Chitinase在植物正常生長情況下表達(dá)量極低或不表達(dá)，但在受到病原菌、傷害及信號分子誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量迅速增加[6-7]，快速而強(qiáng)烈的誘導(dǎo)特性暗示其啟動(dòng)子在植物基因工程中具有重要的實(shí)用價(jià)值。目前，已從擬南芥、辣椒、芥菜等幾種植物中獲得了Chitinase的啟動(dòng)子序列，并對其誘導(dǎo)調(diào)控特性進(jìn)行了分析[8-11]。但到目前為止，對Chitinase啟動(dòng)子的調(diào)控機(jī)理所進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化研究僅局限在少數(shù)模式植物上，對農(nóng)作物的實(shí)用性研究卻很少。

大豆Class IChitinase(GmCHI1)同樣也受到病原菌、傷害及激發(fā)子等的誘導(dǎo)表達(dá)[12-13]。為了從大豆中發(fā)掘新型的病原菌或傷害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，本研究首先克隆了大豆GmCHI1基因的啟動(dòng)子序列(GmCHI1p)，將其構(gòu)建入無啟動(dòng)子的pCAMBIA1391Z表達(dá)載體中，獲得GmCHI1p與GUS報(bào)告基因融合的重組表達(dá)載體，然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，對轉(zhuǎn)基因煙草中的GUS表達(dá)情況進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果表明GmCHI1p具有顯著的根組織特異性及傷害誘導(dǎo)性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

分離啟動(dòng)子的DNA供體材料為吉林小黃豆，遺傳轉(zhuǎn)化受體為煙草品種云煙87，大腸桿菌菌株(Escherichiacoli) 為DH5α，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株為EHA105。植物表達(dá)載體pCAMBIA1391Z含有GUS結(jié)構(gòu)基因，但不含調(diào)控GUS基因表達(dá)的啟動(dòng)子，為本實(shí)驗(yàn)室保存。pMD18-T vector、LATaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶及各種限制性內(nèi)切酶、試劑和試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。

1.2 PCR 擴(kuò)增引物

本試驗(yàn)所需引物全部由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

1.3 試驗(yàn)方法

1. 3. 1GmCHI1p的克隆和序列分析 采用改良的CTAB 法[14]，從大豆葉片中提取基因組DNA。參照已發(fā)表的大豆幾丁質(zhì)酶基因(Chitinase1，GmCHI1)序列(GenBank：AF202731.1)，設(shè)計(jì)上游引物ChiPF和下游引物ChiPR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得GmCHI1基因起始密碼子上游約1.6 kb DNA片段。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。

表1 PCR 擴(kuò)增引物序列

利用TaKaRa公司的DNA凝膠純化回收試劑盒，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，方法參照產(chǎn)品說明書?；厥蘸蟮腜CR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，篩選重組質(zhì)粒，命名為pMD18-T-CHI1p。對插入片段的克隆由TaKaRa公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果的同源性分析采用DNAman序列分析軟件(www.bio-soft.net)。利用生物信息學(xué)網(wǎng)站PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行分析。

1.3.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建和煙草轉(zhuǎn)化 利用pMD18-T的酶切位點(diǎn)，將pMD18-T-CHI1p質(zhì)粒用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切，回收GmCHI1p啟動(dòng)子片段，然后與Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切后的pCAMBIA1391Z載體片段連接，得到GmCHI1p與GUS基因融合的植物表達(dá)載體pCAM-GmCHI1p。對獲得的陽性克隆進(jìn)行Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切鑒定。

用凍融法[15]將表達(dá)載體pCAM-GmCHI1p轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株中。葉圓盤法[16]轉(zhuǎn)化煙草云煙87，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗移至田間培育。同時(shí)，將pCAMBIA1391Z植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草作為陰性對照。

1.3.3 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定 對不同的轉(zhuǎn)基因煙草獨(dú)立轉(zhuǎn)化系采用CTAB法提取葉片基因組DNA，分別使用GUSF / R 引物對和HygF / R 引物對進(jìn)行PCR檢測。PCR反應(yīng)條件均為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min,4 ℃保存。擴(kuò)增出相應(yīng)特異條帶(GUS基因約706 bp；HPT基因約559 bp)的植株即為陽性株，可以用于后續(xù)的GUS酶活測定。

1.3.4 轉(zhuǎn)基因煙草GUS表達(dá)分析 傷害處理：取溫室培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)基因煙草的整株小苗，用牙簽在煙草葉片上扎孔，同一張葉片只在一半葉片上扎孔，另一半作對照，處理3 h后取樣。

將上述材料置于小燒杯中，進(jìn)行GUS活性的組織染色分析[17]。所需溶液：50 mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH值7.0；0.5 mmol/L K3Fe(CN)6；0.5 mmol/L K4Fe(CN)6；10 mmol/L EDTA；0.1%Triton X-100；2 mmol/L X-gluc。37 ℃染色16 h，組織用90%乙醇脫色，然后觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1GmCHI1p的克隆及表達(dá)調(diào)控元件分析

生物信息學(xué)的發(fā)展及大豆基因組測序工作的完成，為本研究的順利進(jìn)行提供了條件。根據(jù)GenBank中發(fā)表的序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得Chitinase1基因起始密碼子上游1 641 bp的DNA片段，命名為GmCHI1p(圖1，泳道2)。將克隆片段進(jìn)行T載體連接，對重組載體pMD18-T-CHI1p分別進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖1，泳道1)和測序驗(yàn)證。測序結(jié)果表明，克隆的GmCHI1p序列與大豆基因庫中的序列相似度達(dá)99.8%。M.Wide range DNA Marker (500～12 000 bp)；1.pMD18-T-GmCHI1p酶切驗(yàn)證；2.GmCHI1pPCR 擴(kuò)增；3.pCAM-GmCHI1p酶切驗(yàn)證。

M.Wide range DNA Marker (500-12 000 bp)；1.EcoRⅠ+Hind Ⅲ digestion of pMD18-T-GmCHI1p；2.PCR amplification ofGmCHI1p；3.EcoRⅠ+Hind Ⅲdigestion of pCAM-GmCHI1p.

圖1GmCHI1p的克隆及載體構(gòu)建

Fig. 1 The cloning ofGmCHI1pand construction of promoter binary vector

利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫對GmCHI1p啟動(dòng)子序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，在GmCHI1p序列中除包含基本的啟動(dòng)元件TATA-box及大量的CAAT-box(與增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率有關(guān))外，還含有多個(gè)對水楊酸、茉莉酸等激素響應(yīng)的元件，以及一些對其他脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄元件(表2)，由此推測該啟動(dòng)子可能具有脅迫誘導(dǎo)響應(yīng)特性。

表2 啟動(dòng)子順式作用元件統(tǒng)計(jì)

2.2GmCHI1p∷GUS融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建

pCAMBIA1391Z表達(dá)載體的GUS基因上游不攜帶啟動(dòng)子，為多克隆酶切位點(diǎn)(MCS)區(qū)，方便其他外源啟動(dòng)子的插入，為啟動(dòng)子的效率驗(yàn)證提供了非常好的載體系統(tǒng)。用HindⅢ和EcoR Ⅰ雙酶切pMD18-T-CHI1p重組質(zhì)粒，回收GmCHI1p啟動(dòng)子片段，然后與Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切后的pCAMBIA1391Z載體片段連接，得到GmCHI1p與GUS基因融合的植物表達(dá)載體pCAM-GmCHI1p(圖2)，并通過凍融法將重組表達(dá)載體pCAM-GmCHI1p轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。

2.3 轉(zhuǎn)GmCHI1p∷GUS融合基因煙草的獲得及分子鑒定

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將植物表達(dá)載體pCAM-GmCHI1p轉(zhuǎn)化煙草，共獲得56株具有潮霉素抗性的GmCHI1p∷GUS融合基因轉(zhuǎn)化株系。隨機(jī)選取其中33個(gè)轉(zhuǎn)化株系，提取煙草葉片基因組DNA，分別用GUS基因和HPT基因特異性引物進(jìn)行PCR分析，整合有外源基因的植株應(yīng)在PCR產(chǎn)物中含有相應(yīng)大小的片段(GUS基因約706 bp；HPT基因約559 bp)，結(jié)果表明，33個(gè)轉(zhuǎn)化株系均獲得相應(yīng)的特異條帶(圖3)，初步證明外源基因已整合到這些植物的基因組中。

35Sp.CaMV35S啟動(dòng)子；GUS.β-葡萄糖苷酶基因；HPT.潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；MCS.多克隆位點(diǎn)；GmCHI1p.大豆GmCHI1基因啟動(dòng)子。35Sp.CaMV35S promoter；GUS. β-glucuronidase gene；HPT.Hygromycin phosphotransferase gene；MCS.Multiple cloning sites；GmCHI1p.GmCHI1 gene promoter.

M.DNA Marker 2000；CK+.質(zhì)粒pCAM-GmCHI1p陽性對照；CK-.ddH2O；0.未轉(zhuǎn)基因煙草陰性對照；1～33. 轉(zhuǎn)基因煙草植株。M.DNA Marker 2000；CK+.Plasmid pCAM-GmCHI1p；CK-.ddH2O；0.Untransgenic tobacco (negative control)；1-33.Transgenic tobacco plants.

2.4GUS融合基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)分析

為檢測GmCHI1p的啟動(dòng)活性，首先對煙草抗性愈傷組織進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化pCAM-GmCHI1p且具有潮霉素抗性的愈傷組織中有強(qiáng)烈的GUS表達(dá)，而無啟動(dòng)子的空載體(pCAMBIA1391Z)轉(zhuǎn)化獲得的抗性愈傷組織中未檢測到GUS活性(圖4)，表明GmCHI1p具有啟動(dòng)GUS表達(dá)的功能。

A.轉(zhuǎn)pCAM-GmCHI1p的抗性愈傷組織；B.轉(zhuǎn)空載體的抗性愈傷組織。 A.Calli (HygR) transformed with pCAM-GmCHI1p；B.Calli (HygR) transformed with pCAMBIA1391Z.

對轉(zhuǎn)基因煙草小苗進(jìn)行GUS染色分析表明，在未傷害處理的煙草植株的莖、葉處沒有檢測到GUS蛋白的表達(dá)，而根部則具有明顯的GUS染色(圖5-A)；在傷害處理下，受傷葉片的傷口處及其附近出現(xiàn)明顯的GUS染色，包括葉片切口處和葉片刺傷處，而其他未受傷部位和對照葉片均未檢測到GUS蛋白的表達(dá)(圖5-B、C)，表明該啟動(dòng)子的傷害誘導(dǎo)信號沒有被長距離傳遞，因此，預(yù)計(jì)該啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因抗蟲分子育種中具有巨大的應(yīng)用前景。

圖5 轉(zhuǎn)基因煙草中的GUS表達(dá)分析Fig.5 The expression analysis of GUS in transgenic tobacco

3 討論

植物幾丁質(zhì)酶啟動(dòng)子受傷害、病原菌、激發(fā)子等的快速強(qiáng)烈誘導(dǎo)。Wu等[10]發(fā)現(xiàn)芥菜ClassⅠ幾丁質(zhì)酶基因BjCHI1啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥中表達(dá)，并受傷害、MeJA等生物和非生物因素的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，并首次證明BjCHI1啟動(dòng)子中的T/G-box(AACGTG)序列賦予啟動(dòng)子的MeJA誘導(dǎo)特性。Hong等[11]證明辣椒classⅡ幾丁質(zhì)酶基因CAChi2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因受病菌侵染、滲透脅迫和SA的誘導(dǎo)強(qiáng)烈表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，大豆幾丁質(zhì)酶基因啟動(dòng)子GmCHI1p能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)。對GmCHI1p序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，序列中含有多個(gè)對水楊酸、茉莉酸等激素響應(yīng)的元件，推測該啟動(dòng)子可能具有傷害誘導(dǎo)特性。而對轉(zhuǎn)基因煙草的組織化學(xué)染色也證明了GmCHI1p啟動(dòng)子被傷害強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)。

根部特異啟動(dòng)子在植物抗病以及抗逆性改良和植物品質(zhì)改良中有良好的應(yīng)用價(jià)值。近年來，一些植物根特異的啟動(dòng)子相繼被克隆分析[18-21]。Park等[22]證明在營養(yǎng)生長階段，水稻根部特異啟動(dòng)子HPX1主要活躍在根部伸長區(qū)。大豆GmPRP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥和大豆根中優(yōu)先表達(dá)[23]。Kong等[24]將根特異啟動(dòng)子LjNRT2和AtNRT2.1驅(qū)動(dòng)下的人工合成幾丁質(zhì)酶基因(NIC)進(jìn)行番茄和煙草的轉(zhuǎn)化，證明根部特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的NIC基因只在轉(zhuǎn)基因植物的根部有表達(dá)，并且轉(zhuǎn)基因植物對根部病原菌-尖刀鐮孢菌的抗性水平顯著增加。幾丁質(zhì)酶啟動(dòng)子的表達(dá)也具有一定的組織特異性，如山葡萄ClassⅢ 幾丁質(zhì)酶基因VCH3啟動(dòng)子受外源施加SA誘導(dǎo)在植物維管組織中特異性的高效表達(dá)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，大豆GmChi1p啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草的根部特異性高效表達(dá)。

在大豆的高產(chǎn)、品質(zhì)改良及抗病蟲害基因工程中能夠選用的植物內(nèi)源的組織特異或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子仍然較少。因此，從大豆中發(fā)掘更多的根特異和/或傷害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)應(yīng)用具有重要的意義。本試驗(yàn)證明GmCHI1p啟動(dòng)子具有明顯的根組織特異性，且可受傷害強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，因此,能用于植物源的根特異性兼?zhèn)φT導(dǎo)型表達(dá)載體的構(gòu)建，預(yù)計(jì)該啟動(dòng)子在農(nóng)作物品質(zhì)改良及抗病蟲害基因工程中有很好的應(yīng)用前景。

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Molecular Cloning and Function Analysis of aGmCHI1 Promoter

ZHAO Chunmei，F(xiàn)AN Xi，XUE Rengao

(College of Life Science，Qingdao Agriculture University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province，Qingdao 266109，China)

To investigate the molecular mechanism of the Class Ⅰ Chitinase gene response to virous stresses,the Class IChitinasepromoter was isolated from soybean by PCR and its sequencing analysis indicated that the amplified fragment (1 641 bp) was 99.8% homologous to the ones reported in the GenBank database. The results showed that it included several conserved stress-responsive elements. By using the expression vector pCAMBIA1391Z without promoter upstream ofGUSgene，GmCHI1pwas fused in the frame with theGUSreporter gene and the resulting construct pCAM-GmCHI1pwas introduced into tobacco byAgrobacterium-mediated method.GUSactivity can be detected in theGmCHI1p-transfomants but not untransformed calli (control). The determinations of the GUS activities in the transgenic tobacco plants indicated thatGmCHI1pcould drive theGUSreporter gene to express in the roots specifically and could be significantly induced by wounding. TheGmCHI1 promoter was root tissue-specific and wounding-inducible in its expression. The wounding-inducible expression was occurred only in the wounding tissue or at round it but not transmitted for a long distance. It is expected to have great application prospects in the molecular breeding of transgenic insect resistance.

Chitinase；Promoter；Root-specific；Hurt-inducible

2017-07-01

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2014ZX08010002-003-002)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2013CM025)

趙春梅(1974-)，女，山東臨沂人，副教授，博士，主要從事植物逆境生理與分子生物學(xué)研究。

薛仁鎬(1965-)，男，吉林汪清人，教授，博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。

Q78；S565.03

A

1000-7091(2017)04-0032-05

10.7668/hbnxb.2017.04.005